一个鼠标，两种文化:隔离和成人神经的培养干细胞从单个小鼠的两个神经源性区
February 25th, 2014
在这里，我们描述的同时产生神经前体细胞培养的一个详细的协议，因为无论是贴壁单层或神经球，从脑室下区和个体成年小鼠海马齿状回。
该程序的总体目标是同时产生神经前体细胞培养物，作为来自个体成年小鼠的脑室下区和齿状回的贴壁单层或神经球。这是通过首先切除个体成年小鼠的大脑来实现的。第二步是显微解剖脑室下区和齿状回区域。
接下来，将组织解离成单细胞悬液。最后一步是将前体细胞培养为贴壁单层或神经球。最终，神经球测定和贴壁单层培养系统是确定成体神经干细胞增殖或分化潜力的宝贵工具。
在体外，这种方法使我们能够解决成人神经发生领域的几个非常有趣的问题。有了它，我们可以观察来自个体动物的细胞并进行比较，这在观察个体差异的背景下很有趣，或者，例如，与对照组相比，个体转基因或敲除掩模之间的差异。我们小组的资深科学家 Tara Walker 将介绍这种方法 Before brain dissection.
通过在火焰中旋转玻璃牧场移液器直到边缘变圆，准备带有中型和小型公猪的火焰抛光移液器。然后在高压灭菌器中对它们进行消毒。首先，将大脑转移到含有 PBS 的 10 厘米塑料培养皿中。
将培养皿与大脑放在低倍率的解剖显微镜下，将大脑置于其腹面上。随后，在握住小脑的同时，使用细弯曲的镊子去除嗅球。接下来，将大脑旋转到背侧。
用手术刀在视交叉水平的大脑中做一个冠状切口，以显微解剖 SVZ。将大脑的喙部靠在培养皿上，使切割的冠状面朝上。在更高的放大倍数下，取出并丢弃隔膜。
然后解剖 SVZ，通过将细弯曲镊子的一个刀片的尖端放在侧脑室的外侧角，解剖 SVZ，它是围绕脑室的一层薄组织。紧邻胼胝体和另一个叶片下方，进入紧邻心室的组织约 1 毫米。将镊子向下压向培养皿的底部和脑室的腹侧，以去除一小块三角形组织。
之后，将解剖的 SVZ 放入冰上的培养皿中，以显微解剖 DEG 位置，即培养皿中大脑的 coddle 部分，并在解剖显微镜下使用手术刀沿纵裂切割。去除小脑和染料头颅。重新聚焦显微镜，使 DG 周围的边界现在可见。
要取下 dg，请插入 27 号针头的尖端，然后沿着 DG 和 amen 的角之间的边界滑动。然后使用细镊子将 DG 从周围组织中释放出来，用于 SVZ 组织解离。用手术刀刀片将组织切碎一分钟，直到没有大块残留。
然后复苏。用 1 毫升 0.05% 的 EDTA 预热 5.05% 行程悬浮肉末组织。然后，将其转移到 15 毫升试管中，并在设置为 37 摄氏度的水浴中孵育 7 分钟。
为了终止酶促反应，加入 1 毫升含有胰蛋白酶抑制剂的 DNA swan，然后轻弹试管混合内容物。接下来，以 300 G 离心 5 分钟，形成悬浮液沉淀，留下疤痕。之后，Sennett 将沉淀重悬于 1 毫升生长培养基中，并通过 gly 结合。
使用 P 1000 移液器上下移液大约 7 到 10 次。然后加入总体积为 5 毫升的生长培养基，并将细胞悬液通过 40 微米筛子，以去除碎片和未关联的组织团块。随后以 300 Gs 离心 5 分钟。
丢弃 supinate 和 reus。将所得沉淀悬浮在 200 μL 生长培养基中，用于 DG 组织解离。用手术刀刀片将组织切碎约一分钟，直到没有大块残留。
接下来，将碎组织转移到预热的 PDD 酶混合物中。在 20 摄氏度下孵育 37 分钟，然后每 3 到 5 分钟倒置试管混合。接下来，使用中等口径火抛光牧场移液器轻轻上下移液 10 次，机械地分离组织，然后在 37 摄氏度下再孵育 10 分钟，每 3 到 5 分钟轻弹一次试管混合。进一步。
使用小型野猪火抛光牧场移液器轻轻上下移液 10 次，机械地分离组织。然后，以 130 gs 离心 5 分钟。随后，去除脊髓突起物并将沉淀重悬于 1 毫升缓冲溶液中。
用缓冲溶液补足至 10 毫升。在 130 GS 下离心 5 分钟后。去除 S 上清液，每次调用 5 毫升 20% 重悬沉淀。
然后以 450 GS 离心 15 分钟。去除 snat 并将沉淀重悬于 10 ml 缓冲液中。最后，以 130 GS 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 200 微升生长培养基中，用于贴壁培养 在 PDL 核纤层蛋白 ENC 包被的 96 孔板的每个单孔中接种 200 微升细胞，用于 sphe 培养 用生长培养基稀释至 20 毫升，并在未包被的 96 孔板上每孔接种 200 微升，然后在 6 至 12 次后在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育使用安装在正置光学显微镜上的 IP gradi 计算天数并测量神经球的直径。
该图显示，成年小鼠前体细胞可以作为贴壁单层培养物或在 SVZ 和 dg 中作为神经球培养。与个体小鼠的 DG 相比，可以看到 SVZ 产生的神经球明显更多，并且 SVZ 和 DG 前体细胞对体外去极化的反应也不同，以确认长期增强。神经球显示已经扩展了 10 次。
神经球可以分化为 β 3 微管蛋白阳性神经元，如红色所示，GFAP 阳性星形胶质细胞为绿色，O 四个阳性少突胶质细胞为红色，红色为两个 AB 阳性神经元遵循此程序。可以进行其他方法，例如将细胞或神经球包装几代或分化神经球，然后进行组织学分析。这将有助于回答进一步的问题，例如多潜力和长期潜力。
概述
本文介绍了一种从成年小鼠的脑室下区和牙状回中生成神经前体细胞培养物的协议。这些培养物可以建立为附着单层或神经球，为研究成年神经发生提供了宝贵的工具。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 干细胞研究
背景
- 神经前体细胞对于理解神经发生至关重要。
- 脑室下区（SVZ）和牙状回（DG）是成年神经发生的关键区域。
- 研究这些细胞可以揭示神经发生个体差异的见解。
- 培养这些细胞的协议对于实验的可重复性至关重要。
研究目的
- 开发一种从成年小鼠中培养神经前体细胞的可靠方法。
- 比较来自不同脑区的细胞的增殖和分化潜力。
- 促进神经发生个体差异的研究。
使用的方法
- 从成年小鼠大脑中微解剖SVZ和DG。
- 将组织分离为单细胞悬液。
- 将细胞作为附着单层或神经球培养。
- 评估神经球形成和细胞增殖。
主要结果
- 成功从SVZ和DG中生成神经前体细胞。
- 与DG相比，SVZ产生的神经球明显更多。
- 该方法允许研究神经发生的个体差异。
- 两种培养系统都为成年神经干细胞行为提供了宝贵的见解。
结论
- 该协议能够有效地从成年小鼠中培养神经前体细胞。
- 它支持研究成年神经发生的机制。
- 未来的研究可以利用这种方法探索基因对神经发生的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Simultaneous isolation and culture of neural stem cells from both the subventricular zone and dentate gyrus of individual mice enables direct, paired analysis of proliferation and differentiation potential. This approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence in neurogenesis research, facilitating robust target validation and translational continuity for CNS drug discovery portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct comparison of neural precursor potential across brain regions within the same animal, reducing biological variability.
- Supports functional target validation by quantifying proliferation and differentiation in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing region-specific responses to exogenous factors.
- Provides a platform for hypothesis-driven interrogation of neurogenic pathways in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Generates validated, homogeneous precursor cell populations for reproducible in vitro assays.
- Supports quantitative assessment of neurosphere formation and cell differentiation as screening readouts.
- Enables assay standardization and scalability for compound evaluation in neural stem cell contexts.
- Allows for continuous passage and expansion of neural precursor cell lines for downstream applications.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with in vivo neurogenesis by maintaining region-specific cell identity.
- Enables translational biomarker development by tracking differentiation outcomes in defined neural populations.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative, reproducible data on neural precursor behavior.
Pipeline & Workflow Integration
This dual-culture method bridges early discovery and preclinical research by enabling direct, quantitative analysis of neural stem cell potential from individual animals.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in neurogenesis and CNS target validation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for proliferation and differentiation assays.
- Analytics: Enables measurement of neurosphere number, size, and differentiation markers for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains continuity from in vitro findings to in vivo relevance by preserving region-specific cell characteristics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for generating neural precursor cultures from minimal animal input.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes neural precursor isolation and culture, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables robust go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage in neurogenesis programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS discovery assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection and neural cell culture techniques.
- Demands access to specialized instrumentation for tissue dissociation and cell quantification.
- Necessitates cross-team standardization of culture conditions and analytical endpoints.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or disease models.
- Practical limitations include throughput constraints and the need for precise region identification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:41
Microdissection of Mouse Brain
4:13
SVZ Tissue Dissociation
5:43
DG Tissue Dissociation
7:36
Cell Plating for Monolayer and Neurosphere Culture Generation
8:17
Results: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice
9:21
Conclusion
