DNA交联聚丙烯酰胺水凝胶的制备
August 27th, 2014
我们的实验室已开发的DNA交联聚丙烯酰胺水凝胶，动态水凝胶体系，以更好地了解调节组织硬度对细胞功能的影响。这里，我们提供了示意图，说明和协议来制备这些凝胶。
该程序的总体目标是制备 DNA 交联聚丙烯酰胺水凝胶，在细胞接种到顶部后，通过将单链 DNA 移液到培养基中，可以使其变硬或软化。这是通过首先 Resus 悬浮冻干的 SA one、SA two L two R two 和缓冲液中的单链 DNA，然后将 SA one 和 SA two 溶液单独聚合成聚丙烯酰胺丙烯酰胺骨架来实现的。第二步是将 SA one 和 SA two 聚合溶液与 L 2 溶液混合以形成 DNA 凝胶。
接下来，然后用光学胶将 DNA 凝胶溶液固定在玻璃盖玻片上。最后一步是通过先用 sul sampa 处理凝胶，然后用 PDL 处理凝胶来使凝胶功能化。最终，将细胞接种在 DNA 凝胶上，并通过添加 R 2、L 2 或对照单链 DNA 来调节凝胶弹性，以分别软化、变硬或不改变凝胶弹性。
这些实验的结果表明，底层底物的动态性质直接细胞行为，使用这种技术相对于其他方法（如 CRO、行话、球状水凝胶）的优势在于 DNA 凝胶不需要紫外线等刺激来调节其弹性。相反，DNA 凝胶分别通过 L 2 或 R 2 单链 DNA 通过凝胶的扩散而变硬和软化。首先，将 SA 1 单链 DNA 以 2000 GS 的浓度冻干 15 秒，以确保所有单链 DNA 都位于试管底部。
离心后，向试管中加入 107 微升 1 x tris、EDTA 或 TE 缓冲液，制备 3 毫摩尔的 SA one 溶液在 70 摄氏度下加热 SA 1 NTE 缓冲液 5 分钟或直到单链 DNA 沉淀完全溶解。然后，通过添加 45 微升 40% 丙烯酰胺和 18 微升 10 x tribo、EDTA 或 TBE 缓冲液并离心机来制备 SA one 聚合溶液。这种混合物便于混合。
插入 P 200 吸头，连接到氮气源中，将其连接到溶液中，然后缓慢让氮气通过溶液 2 到 3 分钟。接下来，将样品以 2000 Gs 离心 15 秒以收集溶液 当以 4.5 微升 2% 硫酸铵或 PS 向样品中完成以引发凝胶聚合时，倒置试管数次混合 离心样品以收集溶液进行均匀聚合后，加入 4.5 微升 20% 四乙基亚甲基， 二胺，或向样品中搅拌以催化聚合样品经过后，混合和离心。用氮气对溶液脱气 3 到 5 分钟，以完成聚合并尽量减少未反应的单体。
然后，将溶液在室温下孵育 10 分钟以完成聚合，并为 SA 提供一种聚合溶液。用冻干的 SA 两个单链 DNA 重复前面的步骤，分别加入 45、18、4、0.5 和 4.5 微升丙烯酰胺 T-B-E-A-P-S，并分别加入 108 微升 SA 二溶液中。要制备 L two R two 和对照溶液，请离心、冻干的单链 DNA，并如前所述将以下量的 TE 缓冲液添加到相应的冻干单链 DNA 中，加热溶液直至凝胶溶液溶解。
制剂将 s sa one 和 SA two 聚合溶液在 70 摄氏度下加热约 1 分钟。直到溶液粘度降低。将 10 微升或 10 份 SA one 聚合溶液添加到 10 微升或 10 份 SA two 聚合溶液中。
然后将 SA 1 和 SA 2 聚合溶液混合在一起，在 70 摄氏度下交替加热 15 秒，并用移液器吸头搅拌 15 秒，总共 1 分钟。以 6 μL 或 6 份 100%L 混合后，将两种溶液混合，形成 100% 凝胶。如前所述混合样品后，将 100% 凝胶移液到 60 毫米培养皿中，并在最佳退火温度下加热凝胶 1 小时。
接下来，通过在室温下孵育凝胶 4 小时，让 DNA 交联继续重新杂交。在室温下孵育过夜后，用含钙的 PBS 覆盖凝胶，从培养皿中取出剩余的缓冲液，然后将凝胶放入微量离心管中。此时，将 100% 凝胶在 70 摄氏度下加热约 30 秒或直到凝胶的粘度降低。
移液时，将玻璃盖套在 70 摄氏度的加热块上，加热 1 到 2 分钟。在每个玻璃盖玻片上添加一滴光学胶粘剂。然后将 20 微升 100% 凝胶添加到每个玻璃盖玻片中，让凝胶熔化并铺展在玻璃盖玻片上。
从加热块中取出每个含有凝胶的玻璃杯，并将它们放入 24 孔组织培养皿中。将凝胶暴露在 365 纳米紫外光下 15 分钟。在最佳肛门温度下加热凝胶 1 小时并让 DNA 交联重新杂交 4 小时后，向其中添加 PBS。
然后将凝胶在 4 摄氏度下孵育过夜。孵育后，用移液管从孔中取出缓冲液，小心不要吸出凝胶。然后加入磺胺 sampa 以覆盖每块凝胶。
将凝胶暴露在 365 纳米紫外光下 15 分钟后，去除磺胺 sampa。重复上述步骤后，用 PBS 冲洗凝胶一次以去除多余的磺胺 sampa，将凝胶在大约 300 微升 0.2 毫克/毫升的 poly de lycine 中在 4 摄氏度下孵育过夜完成后，用 PBS 洗涤凝胶两次，每次 5 分钟，以去除多余的聚赖氨酸并添加培养基。凝胶在培养基中孵育 30 分钟后，在接种细胞进行细胞培养和成像之前立即去除培养基。
在硬化凝胶上生长的成纤维细胞，纵横比没有改变，但比在 100% 凝胶上生长的成纤维细胞表现出更大的投影面积。与在 80% 凝胶上生长的成纤维细胞相比，在 100% 凝胶上生长的成纤维细胞具有更小的投影面积和更大的纵横比。这些结果表明，成纤维细胞的行为取决于微环境的动态性质。
在软化凝胶上生长的神经元在初级树突数或轴突长度上没有差异，但表现出比在 50% 凝胶上生长的神经元更短的初级树突。与成纤维细胞研究一样，静态凝胶上的神经表型与动态凝胶上的神经表型不同。与在 100% 凝胶上生长的神经元相比，在 50% 凝胶上生长的神经元具有更少的初级树突和更长的轴突。
虽然尝试此程序对于准确移液粘性凝胶非常重要，但由于浓度对于避免凝胶爆裂很重要，因此准确移液可能需要多次尝试，我们在本协议的讨论部分提供了其他几种选择。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概览
本文描述了DNA交联聚丙烯酰胺水凝胶的制备，该水凝胶允许调节组织刚度以研究其对细胞功能的影响。为研究人员提供了详细的协议和示意图，以便复制该过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物材料
- 细胞生物学
- 组织工程
背景
- 了解组织刚度对细胞功能至关重要。
- 水凝胶可以模仿天然组织的机械性质。
- DNA交联提供了一种动态方法来改变水凝胶的性质。
- 先前的研究已经显示了刚度对细胞行为的影响。
研究目的
- 开发一个可以轻松修改的水凝胶系统。
- 研究刚度的变化如何影响细胞行为。
- 提供复制水凝胶制备的详细方法。
使用的方法
- 在缓冲液中重新悬浮冻干组分。
- 聚合溶液以创建聚丙烯酰胺骨架。
- 通过混合聚合溶液形成DNA凝胶。
- 为细胞接种和弹性调节功能化凝胶。
主要结果
- 成功制备了DNA交联水凝胶。
- 证明了调节凝胶刚度的能力。
- 提供了可用于进一步研究的协议。
- 强调了刚度与细胞功能之间的关系。
结论
- 开发的水凝胶用于研究细胞行为具有多功能性。
- 调节刚度可以提供有关细胞反应的洞见。
- 该方法可以应用于各种生物学研究领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
Dynamic modulation of extracellular matrix stiffness is a critical variable in early discovery and preclinical research, directly impacting the predictive confidence of cell-based assays. DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels enable reversible, stimulus-free control of substrate elasticity, supporting mechanistic de-risking and target validation in disease-relevant systems. This capability enhances the translational fidelity of in vitro models for portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mechanobiological hypotheses by dynamically altering substrate stiffness post-cell plating.
- Supports functional target validation by linking cell phenotype changes to controlled mechanical cues.
- Facilitates biological de-risking by distinguishing static versus dynamic microenvironment effects.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, tunable substrates for reproducible cell-based assays.
- Standardizes mechanical microenvironments to improve assay comparability and scalability.
- Enables quantitative readouts of cell morphology and behavior in response to defined stiffness changes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with disease-relevant tissue mechanics for improved translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by modeling dynamic tissue environments seen in development and pathology.
- Provides a platform for evaluating mechanosensitive biomarkers and phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This hydrogel system integrates from early discovery through preclinical validation, bridging static and dynamic mechanobiology studies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on the role of matrix elasticity in cell function and disease modeling.
- Screening: Provides assay-ready, tunable substrates for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of cell morphology and behavior under controlled mechanical conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with in vivo tissue mechanics for biomarker and phenotype validation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to multiple cell types and mechanobiology questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based models.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of mechanobiology assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing dynamic, disease-relevant assay conditions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of mechanosensitive targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel chemistry and precise pipetting of viscous materials.
- Needs access to standard polymerization and cell culture instrumentation.
- Demands cross-team standardization of gel preparation and functionalization protocols.
- Adaptable to various cell types but may require optimization for specific models.
- Accurate concentration control is critical to avoid gel bursting and ensure reproducibility.
