Name: 对于侧线再生成年斑马鱼的含量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-08T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 了解成年斑马鱼侧线再生定量检测方法，通过庆大霉素处理诱导神经丘损伤，利用荧光显微镜观察再生过程。该技术为神经再生研究提供可靠的定量分析手段。

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作者无任何利益冲突需要披露。

所有操作均遵循《实验动物护理原则》（美国国立卫生研究院出版物编号85-23，1985年修订版）以及罗斯林德·富兰克林大学机构动物护理与使用委员会批准的动物实验方案08-19进行。
1. 庆大霉素诱导毛细胞坏死
<ol>
	<li>用生理盐水配制硫酸庆大霉素，终浓度为 0.004%（4.32 mM）。</li>
	<li>将成年斑马鱼（D. rerio，4–6 月龄）放入盛有 0.004%（4.32 mM）庆大霉素溶液的容器中。容器可任意选择，但我们使用 Pharmacal Aquatic System 的鱼类容器，其尺寸为宽 7 英寸、高 6 英寸、长 7 英寸。将装有鱼的容器置于 28 °C 的培养箱中，处理 24 小时。调整容器内液体总体积，确保鱼在 24 小时内维持存活状态。注意：若液体体积足以满足所处理鱼的数量，则无需对庆大霉素溶液进行通气。</li>
</ol>
2. 毛细胞的活体染色
<ol>
	<li>从乙醇中浓度为 15 mg/mL 的工作储备液中配制荧光活体染料 [4-4-二乙氨基苯乙烯基]-N-甲基吡啶碘化物（在甲醇中激发波长 λ 为 485 nm，发射波长 λ 为 603 nm）的 0.08% 浓度（溶于生理盐水）溶液。</li>
	<li>为确定庆大霉素处理是否有效，立即将部分对照组和庆大霉素处理的斑马鱼放入含有活体染料的 6 孔培养板孔中进行染色。使用足够数量的斑马鱼（以及根据需要的培养板数量），以确保达到统计学显著性。根据观察者计数神经丘的速度，分批将斑马鱼在不同时间点放入培养板中，避免染色时间超过 75 分钟，如步骤 2.3 所述。</li>
	<li>将步骤 2.2 中的培养板放入荧光显微镜旁的实验台抽屉中，用于染色后神经丘的观察。关闭室内灯光，以防止在室温下 1 小时染色期间活体染料发生淬灭。</li>
	<li>准备染料洗脱用水和麻醉用水。染料洗脱用水为普通养鱼用水；麻醉用水则需加入足量的 2-苯氧乙醇，使其在普通养鱼用水中稀释至 1:1,000 的比例。</li>
	<li>将斑马鱼放入过量的普通养鱼用水中，以洗去多余的活体染料，随后进入步骤 3.1 进行活体染料染色斑马鱼的观察。</li>
	<li>为观察神经丘的再生情况，将经庆大霉素处理并在普通养鱼用水中清洗过的斑马鱼转移至 28 °C 的培养箱中孵育 8–16 小时。</li>
	<li>在 8–16 小时内的不同时间点，从培养箱中取出斑马鱼，按照步骤 2.1–2.4 所述进行清洗和染色。随后进入步骤 3.1 进行活体染料染色斑马鱼的观察。</li>
</ol>
3. 麻醉鱼类及神经丘的荧光计数
<ol>
	<li>用纸巾轻轻吸干每条鱼表面的多余液体，然后将其放置在塑料培养皿盖中央一张湿润的滤纸上。</li>
	<li>将培养皿盖置于荧光体视显微镜载物台上，以获取鱼体中部缝线区域经活体染料染色后的感觉丘细胞的数字图像。</li>
	<li>在荧光体视显微镜上连接数码相机，并设置2倍放大倍数以拍摄图像，用于后续定量分析。注意：体视显微镜的放大倍数设置可能因显微镜品牌而异，但应确保能够清晰观察并计数中部缝线区域内的单个感觉丘细胞。</li>
	<li>通过计数鱼体腹侧最下方、紧邻右侧胸鳍近端处四条指定缝线区域内的可见感觉丘细胞数量，来评估再生程度（见图1）。进行统计分析时，应采用适当的检验方法，如方差分析（ANOVA）或学生t检验。每个时间点至少使用5条鱼，所有实验至少重复3次。</li>
	<li>根据感觉丘细胞再生时间曲线（见图3），在庆大霉素洗脱后8–16小时之间计数感觉丘细胞，此时间段处于再生曲线的线性相。注意：使用线性相时间点可确保对照组与实验组之间的定量分析具有可比性。</li>
</ol>
4. 若神经丘分析结果无统计学显著性，可通过单个毛细胞的荧光计数以获得更高分辨率的定量分析
<ol>
	<li>如果在神经丘水平的定量分析无显著性意义，也可采用单个毛细胞水平的分析，以获得更高的分辨率。选择庆大霉素洗脱后特定时间点的斑马鱼（时间点依据先前的神经丘研究确定），按照方案2所述方法进行活体染料染色，然后使用1:500稀释的2-苯氧乙醇处理1–5分钟，对斑马鱼实施安乐死。</li>
	<li>在弱光条件下操作，以防止荧光淬灭，进行四次切口，制备出方形皮肤瓣，具体如下：沿鱼体上部肋骨方向切开，直至与臀鳍对齐；然后在腹部横向切开；最后，在上述切口两侧分别做两个垂直切口，形成方形皮肤瓣。注意：该皮肤制备样本将包含神经丘实验中使用的体中部缝线区域。</li>
	<li>将皮肤样本置于载玻片上，然后在切除的皮肤样本上覆盖圆形玻璃盖玻片，以帮助固定并展平组织，便于后续的数字成像。</li>
	<li>利用步骤4.3获得的皮肤样本，对体中部缝线区域各神经丘内的毛细胞进行数字成像。成像放大倍数至少为60倍，随后对各个神经丘内的毛细胞进行计数，用于对照组与实验组之间的比较定量分析（见图4）。</li>
</ol>

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<li>Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+Transmission+of+Diabetic+Metabolic+Memory+in+Zebrafish+Correlates+With+DNA+Hypomethylation+and+Aberrant+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression.</a> Diabetes. 61 (2), 485-491 (2012).</li>
</ol>

本研究得到了Iacocca家族基金会的研究资助、美国国立卫生研究院资助DK092721（授予R.V.I.）以及罗斯林德·富兰克林大学启动资金的支持。未报告与本文相关的任何潜在利益冲突。G.C.P.、S.M.M.和N.D.负责数据研究。M.P.S. Jr.和RI负责监督项目，参与了数据讨论，并监督了手稿的撰写与编辑工作。

基于已建立的关于斑马鱼胚胎和幼鱼侧线（LL）再生分析的大量文献8,24,25，本研究的目标是开发一种可用于成年斑马鱼疾病模型的侧线再生定量检测方法，这些疾病模型在成年鱼中研究效果最佳。我们发现，将原本为胚胎/幼鱼开发的实验方法应用于成年鱼时，某些关键点至关重要。其中最重要的几点包括：1）沿鱼体纵轴分布的侧线神经丘数量；2）神经丘毛细胞染色的持续时间；3）氨基糖苷类药物处理的浓度和持续时间；以及 4）氨基糖苷类药物处理后侧线再生的时间进程。以下讨论将针对这些问题进行阐述。
关于斑马鱼侧线系统中神经丘的数量，胚胎期和幼体期斑马鱼具有明显优势，因为在特定节段内神经丘数量较少，其排列模式较成鱼更为简单。这种较低的数量使得研究人员能够清晰地识别每一个神经丘，并为其命名6。因此，在撤除氨基糖苷类药物后，再生研究可以通过名称来定量分析特定神经丘在任意时间点的重新出现情况。相比之下，成鱼每个节段内的神经丽数量更多，这在再生神经丽数量重现时的准确计数与定量分析中带来了显著困难。如图所示，我们评估了成鱼体节内侧线神经丘的分布模式，确定中段区域（图1和图2）是...

侧线系统是一种存在于鱼类和两栖类中的机械感受器官，负责听觉、平衡、趋流性，并介导群集和躲避捕食者等行为1-5由支持细胞环绕的毛细胞簇组成，这些细胞均位于称为神经丘的结构中6这些神经丘通常沿鱼体和尾部的纵轴排列成垂直线（称为条纹），在鱼头部还可观察到一些水平条纹。在成鱼中，条纹内的神经丽数量明显多于胚胎期或幼鱼期的鱼。6. 斑马鱼的生物医学研究主要集中在抗生素处理、噪音诱导的损伤以及慢性感染的影响 等等毛细胞上的7,8 旨在更深入地了解其在人类中的作用。
与其他大多数脊椎动物不同，斑马鱼（Danio rerio）等硬骨鱼类具有再生丢失毛细胞的能力。斑马鱼特别适用于研究，因其发育迅速且再生能力极强。迄今为止，有关侧线系统发育和（或）再生的斑马鱼研究主要使用胚胎期和幼体期的鱼类，原因是此阶段侧线神经丘数量较少，便于进行更简便的计数与分析6,9,10。
然而，由于许多斑马鱼的神经和非神经系统疾病模型11-16 在成年鱼而非幼鱼中进行研究，因此我们重点开发了一种利用庆大霉素（一种先前用于斑马鱼幼鱼、近期也用于成年鱼的氨基糖苷类药物）在成年斑马鱼中建立侧线再生实验的方法17)&#160;以便提供一种可应用于现有成年斑马鱼疾病模型的检测方法。尽管此前Van Trump发表的方案 等17 建立了成年鱼毛细胞消融的条件，但未建立用于定量比较对照组与实验组之间差异的神经丘再生标准曲线，而这种标准曲线在使用转基因斑马鱼品系或药理诱导斑马鱼疾病状态等实验中是必需的18因此，我们遵循了 Van Trump 的实验步骤 等17 用于毛细胞消融，但在此基础上建立了神经丘再生的标准曲线，以便研究者在比较对照组与实验组（如成年斑马鱼疾病模型）时能够使用我们的数据。该检测方法还设计为可在需要更高分辨率时，将分析扩展至单个毛细胞水平。

<table><tbody><tr><td>硫酸庆大霉素溶液（50 mg/ml）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>2-苯氧乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1126</td><td></td></tr><tr><td>4-二乙氨基苯乙烯基-N-甲基吡啶碘化物（4-Di-2-Asp）的甲醇溶液</td><td>Aldrich</td><td>D-3418</td><td>485 nm 激发 &amp;lambda; 603 nm 发射 &amp;lambda;</td></tr><tr><td>6孔板</td><td>中段科学</td><td>TP92006</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底小培养皿</td><td>Matek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>解剖&amp;nbsp; 显微镜</td><td>尼康</td><td>TMZ-1500</td><td>任何解剖显微镜均可使用。</td></tr><tr><td>成像用相机</td><td>尼康</td><td>Q成像</td><td>任何相机均可使用。</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>NIH Image</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>尼康</td><td></td><td>任何成像软件均可使用。</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV10i</td><td>任何高分辨率荧光显微镜均适用</td></tr><tr><td>水生系统</td><td>KG Aquatics ZFS Rack 系统</td><td></td><td>任何水生系统均可使用</td></tr></tbody></table>

成年斑马鱼侧线再生检测方法

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

由于听力和平衡障碍在临床上具有重要意义，斑马鱼等模式生物已被用于研究侧线系统的发育与再生。斑马鱼在这些研究中尤其具有吸引力，因其发育迅速且再生能力极强。迄今为止，由于胚胎期和幼体阶段的神经丘数量较少，斑马鱼的侧线再生研究主要集中在胚胎和幼体阶段。这使得在早期发育阶段对侧线再生和/或发育进行定量分析更为简便。然而，许多神经系统及非神经系统疾病的斑马鱼模型是在成鱼而非胚胎/幼体中进行研究的，因此我们致力于建立一种适用于成年斑马鱼的定量侧线再生检测方法，以便将其应用于当前的成年斑马鱼疾病模型研究中。在Van Trump 等17&#160;先前研究的基础上，该研究描述了在成年墨西哥盲洞穴鱼和斑马鱼（Danio rerio）中消融毛细胞的操作步骤，我们的检测方法旨在实现对照组与实验组之间的定量比较。这一目标通过建立再生神经丘的标准曲线来实现，该曲线基于在特定侧线区域毛细胞经庆大霉素诱导坏死后24小时内神经丽数量重新出现的百分比。此外，该检测方法还设计为可在需要更高分辨率时，将分析扩展至单个毛细胞水平。

优化成年斑马鱼侧线神经丘再生定量分析的实验流程。
幼年斑马鱼的神经丘易于定量；然而，成年斑马鱼侧线每条缝线上的神经丽数量显著更多，使得定量分析更加困难6,17,19,20。如图1A所示，头部的神经丽数量明显多于中段或尾部区域；尾部区域的神经丽数量最少，如图1D所示。由于头部缝线分布模式复杂且神经丽数量显著较多，不适合作为定量分析的区域。此外，无论我们测试的庆大霉素浓度如何，头部区域神经丘的完全消融都很难实现；这与Van Trump et al.17先前报道的结果一致，即在庆大霉素处理后仍可观察到残留的神经丘。相比之下，尾部区域的神经丽数量过少。因此，我们选择中体区域（图1B）对成年斑马鱼神经丘再生进行定量分析。在该区域，我们在胸鳍侧后方确定了四条缝线，这些缝线在所有成年个体中的神经丽数量具有一致性 [61.45 (n = 95)]（图1B和<strong...

由于许多神经系统和非神经系统疾病的斑马鱼模型是在成年鱼而非胚胎/幼鱼中进行研究的，我们开发了一种可应用于成年斑马鱼疾病模型的定量侧线再生检测方法。该检测方法包括在1）神经丘和2）单个毛细胞水平上的评估。

由于听力与平衡功能障碍在人类临床医学中的重要性，斑马鱼等模式生物已被用于研究侧线系统……

本实验的总体目标是建立一种可应用于成年斑马鱼疾病模型的定量侧线再生检测方法。首先，通过将成年斑马鱼暴露于庆大霉素中处理 24 小时，以消融其侧线系统；随后，洗去庆大霉素，并将斑马鱼转移至新鲜水中，使其在不同时间点进行神经丘的再生。随后用活体染料对斑马鱼进行染色，以在指定时间点观察其侧线系统的恢复情况。为确认药物已有效消融神经丘，部分斑马鱼应在洗脱庆大霉素后立即染色。然后利用荧光显微镜或共聚焦显微镜获取的图像，对斑马鱼或皮肤标本上侧线的神经丽数量进行计数。最后，利用再生神经丘标准曲线，将实验组与对照组进行定量比较。最终，通过荧光显微镜和共聚焦显微镜监测成年斑马鱼疾病模型中侧线系统的再生情况。我们开发了该技术，以提供一种用于检测成年斑马鱼疾病模型中神经元再生的定量分析方法。为诱导毛细胞坏死，首先在鱼水中加入硫酸庆大霉素溶液，使其终浓度为每毫升50毫克，终体积浓度为0.004%。使用一个足够容纳4至6月龄斑马鱼且不充气的容器，将其装满庆大霉素溶液。将鱼放入其中，在28摄氏度下孵育24小时。准备一个装有正常鱼水的鱼缸以洗去庆大霉素。洗去庆大霉素后，将鱼放入正常鱼水中，并放回28摄氏度的培养箱中孵育8至16小时，孵育液为荧光活性染料的工作液，浓度为15毫克/毫升。四四二氨基苯乙烯和甲基百里酚蓝碘化物或四染料二A。在鱼水中配制0.08%浓度。在庆大霉素处理后的指定恢复时间，将每条鱼放入六孔培养板的孔中，孔内含有活性染料。盖上培养板，将其置于荧光显微镜旁的实验台抽屉中，以检查染色的神经丘。关闭灯光以防止活性染料淬灭，并在庆大霉素洗脱后的选定时间点孵育一小时。将每条鱼放入麻醉水中进行麻醉，等待约一至两分钟，直至其游动动作停止。接着，用纸巾轻轻吸干每条鱼表面的水分，并将其放置在塑料培养皿盖中央一张湿润的滤纸上。然后将培养皿盖置于荧光体视显微镜的载物台上，使用两倍放大倍数拍摄图像，用于定量分析。为确定再生程度，计数鱼体腹侧最下方、紧邻右侧胸鳍近端处四个指定缝合位置内可见的神经荧光信号数量。采用学生 t 检验或方差分析（ANOVA）进行统计分析，所有实验至少重复三次，每次实验至少使用五条鱼。如果在神经丘水平的定量分析无显著性差异，也可采用单个毛细胞水平的分析以获得更高的分辨率。染色并洗去染料后，在弱光条件下使用1:500稀释的2-苯氧乙醇对鱼实施安乐死。在腹部做一个横向切口，并在前两个切口的两侧各做两个纵向切口。然后沿鱼的上部肋骨进行切口，直至与肛门鳍对齐，形成一个方形的皮肤瓣。将皮肤样本置于载玻片上，上面放置 aros，再覆盖圆形玻璃盖玻片，以帮助固定并压平组织。用于后续的数字成像。使用60倍物镜拍摄体部中段每个神经丘内毛细胞的数字图像，然后对各个神经丘内的毛细胞进行计数，以对对照组和实验组进行比较和定量分析。如图所示，与中段或尾部相比，斑马鱼头部的神经丘数量显著更多，而尾部区

an-assay-for-lateral-line-regeneration-in-adult-zebrafish

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成年斑马鱼侧线再生检测方法

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