小鼠胚胎皮肤和Live成像黑素细胞迁移的体外培养

以下实验的总体目标是了解黑素原始细胞种群在通过发育中的胚胎表皮横向迁移时的行为。这是通过解剖 E 14.5 小鼠胚胎的皮肤以进行离体器官型培养来实现的。作为第二步，将解剖的皮肤安装在定制的培养装置中，该装置允许在液体界面进行培养。

接下来，将腔室安装在共聚焦显微镜的载物台上，以对迁移的黑色素原始细胞群进行成像。在 18 小时内对 6 个胚胎皮肤培养物进行平行成像，表明梅尔州的迁移以及原代毛囊的发育。与旧方法（如癫痫发作杂交中的免疫组织化学或乳糖酶染色）相比，该技术的主要优点是我们可以进行实时成像，从而查看单个细胞以检测随时间推移的迁移和增殖。

该方法可以帮助回答色素细胞生物学领域的关键问题，例如甜瓜原始细胞行为如何在色素沉着突变体中被破坏，以及黑色素原始细胞如何定位于发育中的毛囊 对于胚胎在胚胎第 14.5 天的该程序 在表达黑色素原始细胞的冷 PBS 收获胚胎中，如果需要，特异性 Cree 重组酶和荧光 Cree 激活剂报告构建体， 筛选胚胎中荧光报告基因的表达 选择所需的胚胎后，将它们斩首并用剃须刀片去除它们的四肢。如果需要收集胚胎皮肤，请保留这些组织进行基因分型。首先，在靠近中线的静脉上做一个 Ros coddle 切口。

下一步需要 Kashiwa 和他的公司描述的工具。用剃须刀片在 15 厘米长的竹签的平端划一个小口，然后将软牙刷刷毛插入狭缝中。使用这些发棒工具，在旋转胚胎的同时，小心地从下面的结缔组织中梳理掉皮肤。

让皮肤沿着第一个切口的腹侧边缘附着，但没有其他地方可以固定皮肤。必须做一些准备。将夹子、插件和 O 形圈在 70% 乙醇浴中过夜消毒。

首先将加热至 60 摄氏度的培养基与等体积的 60 摄氏度熔融 2%aros 混合，以制备剪辑。然后用所得的 1%Aros 溶液滴加成像剪辑，并让它们冷却和固化。凝固后，向每个孔中加入一毫升 PBS 以防止剪辑变干。

夹子在使用前可以保存几个小时。现在，从明矾培养皿中切下明矾膜，并使用 O 形圈将膜固定到每个无菌内室上，以准备插入物。用 70% 乙醇擦拭清洁装有夹子插件组件的底座。

然后将 6 个插件放入底座中。使用 6 孔板的无菌盖将插件封装在底座中。现在，在几乎剥下第一个胚胎的皮肤后，将其转移到干燥的培养皿中。

使用发棒，将皮肤压平到培养皿的真皮面上，没有任何褶皱。然后用剃须刀将皮肤切开。它应该大约是半平方厘米。

从 PBS 中取出成像夹，擦干 aeros 的表面并将其放在皮肤上，使 aeros 接触组织的真皮侧。等待 60 秒，让真皮粘附在 aros 上，然后小心地将组织的边缘沿着夹子的侧面梳理。使用发棒。

将夹子翻转过来，尽量减少对要成像的区域的接触，去除气泡并将皮肤压平到臀部。使用毛棒，用丝缝线将皮肤固定在夹子的两侧，拧紧后打几个简单的拇指结，线应将皮肤拉入夹子顶部的凹槽中。现在将夹子推入之前安装在底座中的成像插件中。

然后用大约 5 毫升的培养物、培养基填充插入物，并继续成像。重复该过程，为每个剩余的插入件和夹组件添加额外的五个胚胎。共聚焦显微镜需要一个环境室或载物台顶室，在空气中提供 5% 的二氧化碳，以及一个自动化载物台。

使用前将环境室预热至 37 摄氏度至少一小时。使用控制软件，准备多位置模板以快速执行成像实验。定义要成像的 6 个位置。

通常在 18 至 24 小时内每两个位置收集一次小 Zack 病毒。Zacks 选择比最佳针孔设置更宽的针孔设置并拍摄 3 到 5 张小图像，有助于防止激光在较长的成像周期内损坏组织。安装到载物台上时，请务必使用适当的板插件，然后继续进行成像程序。

制备胚胎皮肤培养物并制作延时图像。根据观看 YFP 频道的协议，梅尔州几乎不断移动，仅在透射光下暂停进行有丝分裂。在复合序列中观察到发育中的皮肤和初级毛囊模式的形成。

黑色素原始细胞、有丝分裂和发育中的毛囊可以使用 WR MAC 插件一起识别。对于图像 J，可以在捕获的六个延时序列中的每一个序列中跟踪迁移的黑色素爆炸群体。同时，Melano 爆炸的代表。

跟踪结果显示发育中的皮肤培养物中的运动程度。使用零进行跟踪的跟踪数据摘要突出了梅尔州运动的随机性，并显示了它们是如何传播的。一旦掌握了培养物的解剖和构建，作员就可以在大约 90 分钟内完成。

这项技术为发育生物学和癌症领域的研究人员在许多突变小鼠背景上探索胚胎发育过程中的黑素原始细胞行为铺平了道路。