隔离成年小鼠心肌细胞的细胞信号传导和文化及在体外心肌肥厚

[旁白]该程序的总体目标是为功能性成年小鼠心肌细胞的培养提供一致的准备。首先在麻醉和插管下取出小鼠心脏。灌注心脏并用胶原酶消化。然后解离细胞并重新引入钙。接下来接种细胞并培养原代心肌细胞。蛋白质印迹和氚化亮氨酸掺入测定的结果可以证明 Ouabain 诱导的 PI3 激酶依赖性 AKT 磷酸化激活和蛋白质合成率增加等功能。

- 心脏隔离后，快速将主动脉与许多其他血管扇动，然后非常小心地处理主动脉，并在第一次尝试时快速将其连接起来。通过练习，您将能够通过准确监测颜色和柔软度的变化来确定何时停止心脏的胶原酶消化。

- 演示该程序的将是我实验室的博士后李大翔博士。

- [旁白] 在灌注之前，准备含有 II 型胶原酶的新鲜消化缓冲液，并在准备分离时将缓冲液加热至 37 摄氏度。将剪刀和镊子浸泡在 70% 乙醇中并晾干。现在将鼠标称重到最接近的十分之一克。记录其体重、菌株、性别和出生日期。腹腔注射200微升肝素，防止冠状动脉血液凝固。10分钟后，麻醉小鼠。5 到 10 分钟后，检查鼠标是否对尾巴或脚趾捏没有反应，然后将前爪和后爪轻轻固定在工作台面上，将鼠标固定在仰卧位。用70%乙醇擦拭胸部和腹部，然后从腹部中部到横膈膜做一个中线皮肤切口。握住胸骨并双侧切割。接下来，切开横膈膜并向后弯曲胸腔以暴露心脏。现在稍微抬起心脏，将心脏从胸腔中解剖出来，尽可能靠近背胸壁。将心脏转移到 100 毫米培养皿中的冷充缓冲液中。小心地修剪掉肺、胸腺、支气管和食道等结缔组织。现在识别主动脉及其被胸腺和脂肪垫隐藏的颅骨分支。切开主动脉第一支下方，抓住主动脉壁并抬起心脏。检查大量液体是否滴落，然后将心脏轻轻滑到充满灌注液的主动脉插管上，使插管尖端位于主动脉瓣上方。将主动脉夹在插管上，用 6-0 手术丝将主动脉结扎到插管上。用无钙大量缓冲液以每分钟4毫升的流速灌注心脏约4-5分钟，直到流出物变得清澈，然后改用含有50微摩尔氯化钙的消化缓冲液。如果适用，在消化时将后载压力增加到 70 至 80 毫米汞柱。当心脏变得轻微苍白和松弛时，轻轻捏住时检查它是否呈海绵状，然后停止消化。用70%乙醇浸泡的镊子，将主动脉从插管中拉出，并将心脏放入含有2.5毫升消化缓冲液的无菌60毫米培养皿中。现在进入细胞培养罩并使用无菌用品和无菌技术。用细手术剪刀去除主动脉、心房和大血管。然后轻轻地将心室梳理成 10 到 12 个小块。使用 10 毫升转移移液器，轻轻移液心脏片段和细胞，并将样品转移到 15 毫升聚丙烯锥形管中。用 7.5 毫升钙溶液 I 冲洗培养皿，然后将洗涤液转移到锥形管中，最终体积为 10 毫升。接下来，用细头转移移液器轻轻移液，分散大块心脏组织。然后以 20 G 离心三分钟，以分离出小的非肌细胞，例如内皮细胞和成纤维细胞。吸出上清液。将肌细胞沉淀重悬于补充有ATP的10毫升钙溶液中，平衡三到五分钟。接下来，将复制的 10 微升等分试样转移到血细胞计数器中。计算杆状肌细胞和圆形肌细胞，然后计算肌细胞总数并确定杆状肌细胞的百分比。通过离心沉淀肌细胞。除去上清液，用10毫升钙浓度递增依次洗涤沉淀。对于小鼠肌细胞原代培养，将最终的肌细胞沉淀重悬于五毫升的铺板培养基中，以获得耐钙心肌细胞。计算肌细胞总数，计算杆状囊细胞的百分比。将杆状肌细胞浓度调整为每毫升25,000个杆状肌细胞。轻轻移液肌细胞，以确保每个培养皿或板的细胞密度相等。从培养板上吸出层压板包被溶液后，接种心肌细胞，并通过在培养罩表面以十字状图案轻轻地前后和左右滑动培养皿来均匀分散细胞。将培养物置于37摄氏度的2%二氧化碳培养箱中，以允许肌细胞以约80%的速率附着。现在轻轻吸出含有未附着的肌细胞和细胞碎片的培养基。一次一盘地对准盘子的侧面来补充培养基。立即将细胞放回培养箱中。在成功的制备中，分离的肌细胞通常具有独特的骑形，具有矩形末端和清晰的交叉条纹。作为功能测定，培养成年C57黑六小鼠心肌细胞，并用Ouabain和ET1处理。这些数据表明，Ouabain 和 ET1 可以以剂量依赖性方式增加 AKT 磷酸化，并且还可以在蛋白质合成过程中诱导氚化亮氨酸掺入。这项技术为心脏病领域的研究人员探索转基因小鼠心脏调节机制铺平了道路。