小脑轴突的激光Nanosurgery在体内
2014年7月28日
双光子成像，其耦合到激光nanodissection，是有用的工具来研究退化和再生过程中对中枢神经系统具有亚细胞分辨率。该协议显示了如何标记，图像，并剖析单个登山纤维在体内小脑皮质。
该程序的总体目标是通过监测体内单个解剖神经元的动力学来研究单个受伤神经元细胞退化和再生的机制。这是通过首先通过前级追踪标记下神经元的子集及其轴突伸长来实现的。第二步是在小脑皮层上进行颅窗，以在颅窗下的任意时间点反复监测攀爬纤维。
下一张图片，并在体内通过激光 ax 耳切术解剖单个轴突分支。最后一步是通过两个光子体内成像监测激光鸡奸后几天轴突的退化和最终重塑。使用激光光子分类法的主要优点之一是非常非常具体。
你甚至可以在受到巨大伤害时摧毁一根脊椎。在这一点上，您无法消融精确的区域。此外，在这种情况下，通过体内成像，您可以研究静态视图无法实现的动力学。
最后，将烧蚀的纤维与其他纤维连接起来，以显示再生过程和可塑性是如何发生的，这一点非常重要。因此，该方法可以深入了解小脑共鼻中 CLA Fs 的可塑性结构。它可用于解剖任何荧光结构。
在活脑中，las 版以前确实是针对单细胞体的破坏。作用 TH one GFPM 小鼠皮层中锥体神经元的树突分支甚至单棘 通过向毛细血管加载 1 到 2 微升葡聚糖偶联染料来开始此过程。接下来，通过腹膜内注射每公斤氯胺酮 90 毫克和每公斤甲苯噻嗪 9 毫克来麻醉小鼠，确保使用尾巴或脚趾捏住动物完全镇静。
然后在双眼上使用软膏以防止麻醉时干燥，用剃须刀片剃掉脖子以上的头发。用 Betadine 与 70% 乙醇交替擦拭手术部位两次。之后，将鼠标放在立体定位支架上，将头部定位为与身体成 140 度角。
然后在耳朵之间的皮肤上滴几滴利多卡因。随后，在解剖显微镜下在枕骨下方的皮肤上切开约 1 厘米。用钝镊轻轻分离皮下组织和肌肉。
然后向下推水平肌肉束，将两个垂直肌肉分开，以露出枕骨大孔上方的硬脑膜。接下来，用注射器针头或非常锋利的镊子小心解剖硬脑膜。要将脑干暴露在立体定向微纵器上，请将毛细管支架从垂直方向旋转 45 度。
将毛细血管放在小脑皮层的边缘和第一颈椎之间的中点。将移液管插入距离表面 2 毫米的深度，在 10 到 15 分钟内输送 0.5 至 1.5 微升染料。将毛细管留在原位再放置 15 分钟，然后再将其取出。
缓慢、巧妙地重新调整肌肉并缝合上面的皮肤。将动物放在加热的笼子中，直到从麻醉中完全恢复。为了在永久颅窗下看到稀疏标记的小脑攀爬纤维，首先像以前一样麻醉小鼠，并使用脚趾捏确保动物完全镇静。
接下来，将鼠标放在立体定位框架中并放置耳杆，以便在皮下牢牢地固定头部，每公斤施用 0.2 毫克地塞米松和每公斤 5 毫克卡洛芬，以防止大脑肿胀和颅窗部位可能的炎症。之后，在颅骨上方的皮肤上滴一滴利多卡因。从耳朵之间到眼睛上方剪一个皮瓣。
然后将利多卡因溶液再次涂抹在骨膜上，然后用手术刀刮擦。现在使用牙钻在小脑上方的颅骨中减薄一个半圆形区域。用剃须刀片和镊子将盖玻片切成两半。
然后确保盖玻片比骨头的过道略大，并且具有相似的形状。接下来，用镊子去除骨瓣。小心地将盖玻片放在硬脑膜上。
之后，用丙烯酸胶和牙科水泥的混合物密封窗户。将动物放在恢复室的加热垫上，直到手术后 2 到 7 天从麻醉中完全恢复，通过将麻醉动物的头部放置在立体定向支架中来进行第一次成像，使颅窗平行于物镜焦平面。用两个光子荧光观察颅窗下的皮层。
成像打开实验室视图软件并获取 Zack 以生成目标轴突的 3D 重建。接下来，将激光功率提高到成像功率的 5 到 10 倍。随后以高能量剂量照射小脑攀爬纤维远端部分的选定点，在照射后几分钟获取同一区域的堆栈，以确保消融手术执行良好。
如果该区域开始肿胀并且轴突形成珠状结构，则神经元已被成功解剖。在这种情况下，轴突的远端部分将在几个小时内退化并完全消失。之后，在激光鸡奸后的几天内，通过两个光子体内成像监测轴突的最终重塑。
该图显示了用 LOR 4 88 葡聚糖标记的小脑攀爬纤维的延时图像，并在第 16 天到第 18 天通过两个光子荧光显微镜在体内可视化。该图显示了攀爬光纤的单个分支上的激光鸡奸。神经元被照射。
在第 16 天，这些红色箭头突出显示了第 18 天激光斧鸡奸后轴突远端部分的消失。这是一个新形成的横向分支。遵循此程序，可以应用免疫荧光染色或电子显微镜等方法来回答其他问题，例如可能在 theones 上形成新的突触接触，或评估激光诱导损伤对附近结构的有效影响。
观看此视频后，您可以了解如何使用激光分类法标记图像和激光解剖攀爬纤维。
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概述
本协议展示了使用二光子成像和激光纳米解剖学研究中枢神经系统亚细胞水平的退化和再生过程。它专注于在体内标记、成像和解剖小脑皮层中的单个攀爬纤维。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经生物学
- 成像技术
背景
- 理解神经元细胞动力学对于洞察神经退行性变和再生至关重要。
- 二光子成像允许对神经元过程进行高分辨率观察。
- 激光纳米解剖学能够精确定位特定的神经元结构。
- 本研究专注于小脑皮层中的攀爬纤维。
研究目的
- 调查受伤神经元细胞中退化和再生的机制。
- 监测体内单个解剖神经元的动力学。
- 评估受伤后轴突的重塑。
使用的方法
- 通过顺行示踪标记下咽神经元及其轴突伸长。
- 在小脑皮层上创建一个头部窗以进行重复监测。
- 使用激光轴切成像和解剖单个轴突分支。
- 使用二光子成像监测轴突退化和重塑。
主要结果
- 成功在体内标记和成像攀爬纤维。
- 观察到退化和重塑过程随时间推移。
- 展示了激光轴切在定位神经元结构方面的特异性。
- 洞察神经元损伤和恢复的动力学。
结论
- 二光子成像结合激光纳米解剖学对于研究神经元过程有效。
- 这种方法为神经元损伤和修复的机制提供了宝贵的见解。
- 未来的研究可以在这些方法基础上探索神经生物学的其他方面。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise subcellular interrogation of neuronal injury and regeneration dynamics in vivo, offering a mechanistic de-risking approach for target validation in neurodegenerative disease research. By isolating single axonal branches and monitoring real-time degeneration and remodeling, it supports predictive confidence in early discovery stages where biological plausibility of therapeutic targets must be established. The method provides translational continuity from molecular target engagement to phenotypic outcomes in a disease-relevant system, reducing ambiguity in lead identification pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating single axonal branches to assess degeneration and regrowth mechanisms.
- Operational Value: Provides quantitative, time-lapse readouts of axonal dynamics to functionally validate targets involved in neuronal repair pathways.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking target modulation to observable structural remodeling in a disease-relevant CNS model.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible imaging-based readouts of axonal integrity and remodeling for assay development.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems (olivocerebellar neurons) for downstream compound screening in neurodegeneration models.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple time points and experimental conditions for longitudinal target engagement studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Uses a disease-relevant system (adult mammalian CNS injury model) to study regeneration mechanisms with direct implications for neurodegenerative disorders.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-phase target validation with preclinical assessment of axonal repair and synaptic reformation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing structural and functional evidence of target-mediated axonal remodeling over time.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, specifically supporting neurodegeneration programs focused on axonal repair and neuronal plasticity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise dissection and monitoring of single axonal branches in vivo.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (axon degeneration/regrowth metrics) that allow comparison across genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Generates time-lapse imaging data and structural readouts that help teams assess target engagement and biological activity.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by modeling axonal degeneration and regeneration in a clinically relevant CNS injury context.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and nanosurgery platform applicable to multiple neuronal targets and disease models beyond climbing fibers.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through direct observation of axonal degeneration and regeneration dynamics.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via cranial window preparation and two-photon imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in neuronal repair pathways, enhancing capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on demonstrated axonal remodeling capacity in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neurosurgical techniques, two-photon microscopy, and laser nanosurgery for precise axonal targeting.
- Depends on specialized instrumentation including Ti:Sapphire laser systems and two-photon fluorescence microscopes with cranial window access.
- Necessitates cross-team standardization between neurobiology, imaging, and laser physics teams for consistent lesion generation and monitoring.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different neuronal types or brain regions beyond cerebellar climbing fibers.
- Practical limitations include technical complexity of cranial window surgery and post-operative monitoring timelines affecting throughput.
