角膜微囊含量:血管生成在小鼠眼模型

该程序的总体目标是刺激小鼠角膜中的血管生长。这是通过首先制备含有生长因子的颗粒来实现的。第二步是将颗粒植入角膜。

然后将小鼠放置 5 到 6 天，具体取决于生长因子以允许血管发育。最后一步是量化血管面积，使用裂隙灯显微镜测量平均血管长度和血管生长的眼睛圆周距离。最终，角膜微袋测定法被用作研究体内血管生成的可重复且可靠的方法。

通常，由于该程序的技术复杂性，刚接触这种方法的人会很挣扎。研究人员应在实验试验之前进行广泛的实践，以确保手术和分级技术的一致性。首先，用无菌未弯曲的刮刀称取 10 毫克 suc fate 和 60 毫克 hydron，然后将它们放入单独的微量离心管中。

将一块 1 厘米见方的尼龙网放入 10 厘米的无菌培养皿中。将其倒置，使网眼靠在浅睑上，然后将其放在一边。接下来，向 hydron 中加入 500 微升乙醇并涡旋至少 10 分钟。

从冰箱生长因子负 80 中取出一小瓶生长因子。原液的浓度应为 1 毫克/毫升。然后加入适量的生长因子到 suc 命运中。

添加的体积应至少为 20 微升，以确保 Sucre 命运完全湿润，但不应超过 50 微升，以确保其易于蒸发。添加生长因子涡旋后，根据所用液体的体积，将 Sucre Fate 生长因子混合物短暂放入离心蒸发器中，低温放置 30 至 50 分钟。完成后，混合物应完全干燥。

用无菌刮刀的锥形端检查混合物是否有残留水分。混合物干燥时应该感觉松脆。继续用抹刀打碎盐混合物。

此时，取下覆盖尼龙网的盖子，以便网片为下一步做好准备。然后准备从 200 微升移液器吸头上切下末端来添加 hydron。由于水合氢体的粘性，吸取并释放 10 微升水合物，然后再次移液并将其添加到 suc 淡入水中。

使用弯曲的抹刀快速混合 hydron 和 suc 命运。然后沿着刮刀尖端的底部收集混合物并旋转管子，同时将刮刀沿管壁拉出。混合物会迅速干燥，因此必须有效地完成此步骤。

现在用镊子将准备好的网片固定到位，将 hydron suc fate 生长因子混合物涂抹到网片上。混合物应为均匀层，并填充网孔。将弯曲的刮刀浸入含有水合物的管中，并用它涂覆网眼的顶部和底部。

将涂有涂层的网片侧靠在培养皿的边缘，让其在室温下干燥 30 至 45 分钟，网片干燥后，将装有网片的 35 毫米培养皿放入较大的培养皿内。使用一对镊子小心地将 35 毫米培养皿上的网片纤维拉开。这个动作将干燥的混合物打碎成颗粒。

最后，轻敲较大的培养皿，将杂散的颗粒移入较小的培养皿中。检查颗粒在范围内是否均匀。这个过程产生大约 250 个颗粒。

用胶带盖上盖子后，颗粒可以存放在 35 毫米的培养皿中，在零下 20 摄氏度的冰箱中保存长达三个月。用 ton 麻醉小鼠后，将鼠标放在手术显微镜下，使眼睛可见并执行脚趾捏。为确保足够的麻醉水平，通过在眼球上滴一滴丙烷来麻醉小鼠的眼睛。

等待 20 到 30 秒，然后用纱布垫轻拍。使用钝化的 Number One Jeweler 镊子，并小心将皮肤留在镊子和眼睛支柱之间。重要的是要避免太紧或太松。

使用 30 度微型刀在距离角膜缘约 1 毫米的角膜上切开 1 到 2 毫米的切口。切口应足够深，以穿透上皮层进入基质中段，但不要太深以至于使眼睛破裂。将 von 移植刀滑入切口部位的角膜层下，轻轻地将刀放入并沿切口移动以扩大空间。

从而形成一个垂直于切口的口袋。它有助于移动鼠标以配合眼睛的曲率。小心不要用尖端向下推，以免撕裂眼睛。

用丙烷润湿 5 号珠宝商的镊子后，从盘子中取出一个颗粒，然后将颗粒放在眼睛上。接下来，用丙烷润湿嫁接刀，并将一些液体转移到颗粒上，使其具有弹性和柔韧性。用纱布垫或棉签去除多余的水分。

现在使用 von 移植刀将颗粒推入角膜层下方的口袋内。一旦整个颗粒进入内部，将 von 移植刀的平坦面划过该部位，以检查颗粒是否牢固。此时，在眼睛上涂上三重抗生素软膏，然后将鼠标翻转过来，在另一只眼睛中重复手术。

允许新生血管形成几天后，用 ton 麻醉小鼠。裂隙灯显微镜用于分级。一个目镜有一个嘲讽，即目镜内的线条，用作测量辅助工具，以量化血管发芽的眼周周围的血管长度和距离。

现在将鼠标放在瞄准镜前面，将其放置在眼睛中，使颗粒正前方的眼睛可见。用拇指和食指稳定头部，使面部皮肤收紧，眼睛略微道升。将嘲讽的 Y 轴沿着颗粒正下方的角膜缘血管放置。

然后测量向上分支到颗粒的血管的长度。以数十毫米为单位记录此测量值，并将其指定为血管长度，转动鼠标或嘲讽，以便这些血管发芽的眼睛周围距离变得清晰。最简单的方法是将眼睛想象成一个间隔为 1 到 12 的钟面。

将容器发芽的距离指定为时钟小时。clock hour 可以是整数或 0.25 的小数，并且是主观的。继续以与其他小鼠相同的方式进行测量。

虽然可以从正视观察眼睛，但侧向视图往往提供最多的信息。但是，侧向视图仅显示大约 25% 的周长，因此确实需要旋转鼠标才能获得完整的图片。船舶面积的计算方法是船舶长度乘以时钟，小时乘以 0.2 pi。

此计算基于椭圆的面积。在此图像中，测得的血管长度为 0.9 毫米，时钟小时为 3.25。因此，计算出的血管面积为 1.84 平方毫米。

此处显示了生长因子诱导的角膜新生血管形成。将 80 ng 碱性 FGF 沉淀植入低血管生成 black six 小鼠中，导致血管面积等于 2.0 平方毫米。这种剂量导致血管到达颗粒并长入颗粒是很常见的。

将 20 ng 碱性 FGF 沉淀植入黑色 6 小鼠中，导致血管面积等于 1.04 平方毫米。将 200 ng VEGF 颗粒植入黑色 6 小鼠中，导致血管面积等于 0.71 平方毫米。黑色 6 只小鼠的角膜新生血管面积随着 VEGF 或碱性 FGF 剂量的增加而增加。

当将 20 ng 碱性 FGF 沉淀植入高血管生成 1 2 9 菌株中时，观察到血管生成电位大于黑色 6 只小鼠的两倍。抗血管生成药物沙利度胺抑制碱性 FGF 驱动的新生血管形成。与仅接受碱性 FGF 颗粒的对照组相比，该处理导致血管生长抑制 38%。

前房积血可能使角膜新生血管分级变得困难或不可能。在这张严重前房积血的图像中，此处显示了轻度前房积血。整个眼睛呈淡红色，靠近虹膜底部有明显的血池。

在尝试此程序时，重要的是要记住要放松并保持耐心。您练习手术技术和分级方法的次数越多，您的数据输出就越可重复和可靠。