Name: 啮齿动物附睾精子磷酸分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 了解小鼠精子成熟过程中磷酸化蛋白的定量变化，采用逆行冲洗技术分离附睾精子，结合TiO2富集和质谱分析。该方法为生殖生物学研究提供了可靠的磷酸化蛋白质组学分析手段。

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作者感谢NHMRC提供的职业发展奖和资助项目APP1066336，本研究工作得到了上述资助的支持。

1. 培养基和培养皿的制备
<ol>
	<li>配制 200 ml&#160;Biggers Whitten 和 Whitten (BWW)17 工作液：将 5.54 g NaCl、0.356 g KCl、0.25 g CaCl2、0.162 g H2KO4P 和 0.294 g MgSO4 加入 1 L 的 Milli-Q 水中。此为储备液，可在 4 °C&#160;下保存长达一个月。</li>
	<li>取上述储备液 193 ml&#160;，加入 420 mg NaHCO3-、200 mg 葡萄糖、6 mg 丙酮酸钠、600 mg 牛血清白蛋白、0.74 ml&#160;乳酸钠和 4.0 ml&#160;HEPES 缓冲液。此即工作液，需在使用当天新鲜配制，并在使用前平衡至 37 °C。</li>
	<li>制作套管时，取内径为 0.4 mm、外径为 1.1 mm 的聚乙烯 (PE) 管，置于低温热源（通常为甲醇火焰）上加热，使管体开始软化熔化。立即向外拉伸管体，使其外径变细。</li>
	<li>剪裁一端形成狭窄尖端，以便更易于插入输精管。</li>
	<li>将套管另一端剪至约 15 cm 长度。将 30 G&#160;针头插入钝端，并连接一支 3 ml&#160;注射器（活塞完全回缩）。</li>
	<li>通过截取一段 20 cm 长的 PE 管（内径 4.2 mm，外径 6.4 mm）制作吸液吹管，在一端插入吹嘴。</li>
	<li>插入微毛细玻璃管夹持器及玻璃微毛细管本身（小鼠通常使用 3 µl&#160;，大鼠使用 40 µl&#160;）。</li>
</ol>
2. 小鼠附睾的摘除
<ol>
	<li>根据各机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的程序对小鼠实施安乐死。</li>
	<li>取动物，在阴囊处做一小切口以暴露附睾。使用5号钟表镊将睾丸和附睾从体腔中拉出。</li>
	<li>切断输精管，使至少1-2 cm的输精管仍与附睾尾部相连。同时，切断连接附睾与睾丸的近端输出小管及组织，完整取出整个雄性生殖道。</li>
	<li>将整个雄性生殖道置于解剖显微镜下，放大倍数范围为5-40倍。</li>
</ol>
3. 输精管的插管
<ol>
	<li>将套管固定在显微镜上，使锥形端有 1-2 cm 的部分自由伸出，并能通过镜头清晰可见。</li>
	<li>使用一对 5 号钟表镊，轻轻夹住输精管两侧，将输精管拉至套管上，使套管插入输精管内。</li>
	<li>取一段不可吸收的黑色编织处理丝线（5-0 规格），在已插入套管的输精管上打结。确保结扎紧实，以便在注射器施加气压时，套管仍能牢固地固定在输精管内。</li>
</ol>
4. 尾部附睾精子的逆行或反向冲洗
<ol>
	<li>使用钟表匠#5镊子夹住附睾尾远端，去除白膜，以暴露单个附睾小管。</li>
	<li>用镊子轻轻拉出小管，使其暴露并小心分离，从而形成开口以便精子释放。</li>
	<li>轻轻推动3 ml&#160;（小鼠）或20 ml&#160;（大鼠）注射器，将空气推入输精管。当压力适当时，精子将开始从附睾尾远端断裂的小管处缓慢流出。此时，通过吸嘴施加负压，将精子吸入玻璃毛细管中。注意：通常情况下，根据动物年龄的不同，小鼠可获得2–3 µl&#160;精子，大鼠平均可获得30–40 µl。</li>
</ol>
5. 蛋白质组学分析前精子的洗涤与裂解
<ol>
	<li>将精子从玻璃毛细管中排出至1 ml&#160;通过轻轻向吹嘴吹气或连接注射器并排出空气，将精子从毛细管中推回到BWW溶液（37 °C）中。</li>
	<li>精子细胞分散后，洗涤3次&#160;(300 × g，5 分钟) 离心，加入 1 ml&#160;BWW 洗涤以去除污染蛋白。最后一次洗涤后，弃去上清液。注意：此时精子细胞可冷冻保存以备后续使用。</li>
	<li>使用4% CHAPS、2 M硫脲溶解蛋白质&#160;50 mM Tris，pH 7.4，孵育1小时，期间间断涡旋振荡。</li>
	<li>细胞裂解后，离心（10,000 × g，20 分钟），取上清液转移至新管中。注意：此时可进行蛋白质定量。</li>
</ol>
6. 二硫键还原与烷基化
<ol>
	<li>向裂解的蛋白质中加入终浓度为 10 mM 的 DTT，涡旋混匀后在室温下孵育 30 分钟。</li>
	<li>向裂解液中加入终浓度为 50 mM 的碘乙酰胺，涡旋混匀后避光于室温孵育 30 分钟。</li>
</ol>
7. 沉淀
<ol>
	<li>使用甲醇-氯仿沉淀样品：加入1体积裂解液（以400 µl&#160;为例），再加入1体积（400 µl）甲醇和0.5体积（200 µl）氯仿。</li>
	<li>涡旋混匀样品，离心（10,000 × g，2 min）。</li>
	<li>注意离心后将出现两相。弃去上层液，仅保留约2 mm的上层液体（注意不要扰动两相界面）。</li>
	<li>加入1体积（400 µl）甲醇，轻轻倒置管子1–2次&#160;以混匀，再次离心（10,000 × g，15 min）。弃去上清液至废液容器中，将沉淀在空气中干燥3–4 min。</li>
</ol>
8. 胰蛋白酶消化
<ol>
	<li>将胰蛋白酶用含有1 M尿素的25 mM碳酸氢铵溶液重悬，按50:1（W/W；蛋白质:胰蛋白酶）的比例配制，并在37 °C下于恒温混匀仪中以700 rpm优先进行过夜孵育。</li>
	<li>离心（10,000 × g，15分钟）以沉淀未消化的物质。将上清液转移至新管中。</li>
</ol>
9. 磷酸化肽段富集
<ol>
	<li>按照先前所述方法18对胰蛋白酶消化产物中的磷酸化肽段进行纯化和富集。用DHB缓冲液将胰蛋白酶肽段稀释10倍[DHB缓冲液成分为：350 mg/ml&#160;2,5-二羟基苯磺酸（DHB）、80%（v/v）乙腈（ACN）、2%（v/v）三氟乙酸（TFA）]，然后加入至干燥的TiO2微球（200 µg）中。</li>
	<li>室温下置于旋转仪上孵育1小时。</li>
	<li>用DHB缓冲液洗涤样品，离心并弃去上清液。随后用洗涤缓冲液[80% ACN（v/v）、2% TFA（v/v）]洗涤样品三次，以去除DHB。</li>
	<li>最后一次离心后，直接加入25 µl&#160;浓度为2.5%、pH ≥ 10.5的氢氧化铵溶液作为洗脱缓冲液，洗脱磷酸化肽段。离心并收集上清液。立即加入约0.3 µl&#160;甲酸进行中和。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

成功且可重复地对精子进行蛋白质组学分析的关键步骤包括：1）起始材料的纯度；2）去除不需要的盐类和去污剂；3）充分变性蛋白质，以使胰蛋白酶能够高效消化尽可能多的蛋白质；4）尽量减少样品操作，以降低肽段的损失。
为了成功逆向冲洗附睾尾部，必须准确定位精子将要排出的区域。对于大鼠和小鼠而言，该位置位于附睾尾部凹面区域顶端的中央部位（见图&#160;2A）。若操作位置更靠近输精管，则逆向冲洗更容易，成功率通常也更高。然而，这种方法会导致收集到的精子数量减少。相反，若尝试将操作位置移向更靠近附睾体的区域，则往往需要施加过高的压力才能将精子逆向推过附睾管，从而不可避免地造成附睾组织损伤。
传统上，附睾逆向冲洗使用注射器内饱和了水的矿物油以及平衡盐溶液作为去除精子的介质22-25。然而，这两种方法在进行液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析时均可能存在潜在问题。首先，矿物油可能会堵塞目前全球蛋白质组学分析普遍使用的纳米C18色谱柱，因此必须格外小心，避免在操作过程中带入任何矿物油。一旦发生堵塞，后续分析将无法继续，样本实质上即告丢失。这一问题可通过在注射器中使用BWW或其他平衡盐溶液来克服。然而，尽管该方法可行，但我们很快发现，当BWW溶液与尾部附睾细胞接触并混合后，大量精子立即开始活动。为解决这一问题，我们直接采用空气进行精子逆向冲洗。该方法不仅获得的精子质量与基于液体的方法相当，且精子数量也完全一致。
磷酸化蛋白质组学可能是确定射精后精子中发生哪些信号通路的唯一方法之一。我们正在研究的主要通路之一是获能过程。精子必须经历“获能”后才能具备与卵子结合的能力。在实际操作中，这一过程基本通过将精子在含血清白蛋白的BWW溶液中孵育一段时间来实现（小鼠40分钟；大鼠1.5小时；人类3–24小时）。此前，我们及其他研究者已证实多种激酶在获能过程中发挥作用。值得关注的是，删除 PKAµII 产生精子能够自发游动的小鼠 体外，但无法发生超活化26后者是精子获能的标志，即精子的游动模式从高速、低振幅转变为低速、高振幅的鞭打频率。我们已证实参与该过程的下游激酶包括 pp60-cSRC（SRC）13,27 c-yes28 和 c-ABL14有趣的是，抑制SRC可阻断依赖于获能的酪氨酸磷酸化13然而，使用冈田酸可以克服这一问题，这表明SRC并未直接参与酪氨酸磷酸化的普遍启动过程 29 但可能调控一种磷酸酶29使用BWW作为培养基将精子从附睾中强制排出存在的问题是，一旦被激活，小鼠精子大约仅需40分钟即可完成获能。考虑到每只小鼠的精子分离过程可能需要5分钟，且实验中通常会使用多只小鼠，因此在实验开始时，精子所处的成熟阶段将各不相同。为克服这一问题，可利用气压将精子从附睾尾部推入玻璃导管中。这样不仅可使所有精子保持非活动状态，而且其状态基本与附睾尾部自然存在的精子一致 环境，这使得能够比较非运动性和运动性磷酸化蛋白质组。
在比较两种不同功能状态的精子时，磷酸化蛋白质组学的样品处理应尽量减少。与传统的蛋白质沉淀方法相比，使用甲醇-氯仿法具有以下优势：1）减少了额外洗涤步骤的需求，2）几乎完全去除了盐类和脂肪，3）已被证明比三氯乙酸（TCA）更能有效沉淀低丰度蛋白质19。建议在胰蛋白酶消化前进行蛋白质沉淀，因为这不仅有助于使蛋白质变性（从而促进胰蛋白酶消化），还能去除细胞中存在的许多与质谱不兼容的代谢物。
精子磷酸化肽的比较可以通过多种方式进行。在基础层面，可采用称为“谱图计数”（spectral counting）的方法，简单比较一个样本中鉴定出的磷酸化肽与另一个样本中的相应肽段。然而，这种方法受到一些批评，主要原因是早期的蛋白质组学研究通常使用较少的重复次数（更详细的讨论参见Lundgren&#160;et al.30）。更为精细的方法是分析肽段母离子的质量强度，并将其与其他样本进行比较（即无标记比较）。在图4所示的示例中，可以观察到在非活动性精子（图&#160;4 上图）中缺失、但在活动性精子（图4 下图）中存在于m/z 650–670范围内的肽段。这一过程被称为基于质谱的无标记定量，是一种无标记定量策略。
一种常用于减少蛋白质组定量所需实验次数的替代策略是使用同位素。由于同位素的质量不同，质谱仪可用于比较洗脱肽段的信号强度。然而，与其他大多数细胞类型不同，某些同位素标记方法无法应用于精子细胞。例如，稳定同位素标记（在一个样本中加入重同位素，而在另一个样本中加入轻同位素）可用于组织培养。当同位素被整合到蛋白质中后，可通过合并两个样本（多重分析）进行蛋白质组学分析。但对于精子细胞而言，这种方法不可行，原因在于：1）同位素标记需要在组织培养中传代多次（最多达8次）；2）精子细胞无细胞核基因的转录和翻译活动，因此根本无法将同位素整合到全部蛋白质中。一种可能的解决方案是订购放射性标记的小鼠，但这类动物模型成本极高。另一种替代方法是使用化学标签。该方法已被用于比较非获能小鼠精子与获能小鼠精子。在此类研究中，采用D0和D3标签以在质谱仪中区分不同样本31。其他方法还包括使用iTRAQ（用于相对和绝对定量的同量异位标签），即通过不同质量的同位素化学标记赖氨酸；iCAT（同位素编码亲和标签），即用不同质量的同位素标记半胱氨酸；以及重水和轻水标记法。
然而，在任何情况下都必须牢记一点：质谱仪仅能报告样品中存在的成分，而这些成分反映了样品在检测之前所经历的全部过程。为了成功进行蛋白质组学分析，必须尽量减少样品操作步骤，同时在每一步骤中最大化样品得率。

精子从睾丸排出时虽已高度分化，但令人惊讶的是，这些细胞仍处于未成熟状态1,2因此，它们缺乏完整功能，包括游动和与卵母细胞结合的能力3尽管精子细胞还需要进一步成熟，但这一过程无法通过经典途径实现，因为在此细胞分化阶段，它们已无法进行基因转录和进一步的蛋白质生物合成。4精子在离开睾丸并进入男性生殖系统的一部分——附睾时，获得生物学功能能力。5附睾是一段紧密盘绕且高度分化的管道，连接睾丸的输出小管与输精管，存在于所有雄性哺乳动物中。6精子在附睾内下行过程中逐步获得受精潜能，这一过程依赖于由局部附睾上皮细胞所营造的动态变化的管腔环境。7附睾中存在的多种分泌和重吸收功能 环境 作用于精子本身，改变其蛋白质、碳水化合物和脂质组成6附睾的重要性，尤其是其起始部“头段”的作用，已通过手术结扎技术得到证实。8通过结扎输出小管滞留在睾丸内的精子完全丧失使卵子受精的能力9-11.
除了附睾环境外，精子细胞内部的信号转导通路也通过翻译后修饰来改变现有精子细胞组分。例如，来自附睾较早区域的精子在蛋白质磷酸化模式上与来自较后区域的精子存在差异5,12。这一点并不意外，因为来自这些不同区域的精子功能能力存在显著差异。例如，来自附睾头部（caput epididymis）的精子不具备运动能力；而来自附睾尾部（cauda region）的精子一旦置于等渗培养基中，即可表现出前向渐进性运动。由于附睾中的精子无法进行从头蛋白生物合成（de-novo protein biosynthesis），因此调控精子功能的所有内在通路必须依赖翻译后修饰（PTM）。因此，若要深入理解精子细胞的成熟过程，蛋白质组学研究——特别是对磷酸化等翻译后修饰的探究——必然是一个关键方向。
一种获取附睾精子的替代方法是采用逆行反冲法13-16。尽管该技术无疑更加耗时，且对操作者的技术要求更高，但所获得的精子纯度 consistently 超过99.99%。此外，与其他所有技术不同的是，精子可以以静息状态被分离出来，从而能够研究精子运动能力是如何启动的。由于样品制备是蛋白质组学分析中最重要的环节，精子的分离已成为精子蛋白质组学研究中最关键的步骤之一。本方案详细说明了如何从附睾尾部分离精子。随后介绍了TiO2磷酸化肽段富集的操作流程，并特别阐述了如何从高度分化的精子细胞中提取肽段。质谱（MS）方法可用于区分磷酸化肽段的变化，例如比较附睾尾部精子在一种状态（不动或未获能）与另一种状态（可动、已获能、顶体反应等）之间的差异，因此该方法是研究精子功能的有力手段。

<table><tbody><tr><td>2,5-二羟基-1,4-苯醌</td><td>Aldrich</td><td>195464</td><td></td></tr><tr><td>2-D 定量试剂盒</td><td>VWR (GE Healthcare)</td><td>80-6483-56</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>25% 氨水溶液</td><td>Merck</td><td>1.05432</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐</td><td>Research Organics</td><td>1300C</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>BDH</td><td>10077.6B</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Merck</td><td>1.06580</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇 (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma</td><td>O6440</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（游离酸）</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酸（游离酸）</td><td>Sigma</td><td>I4386</td><td></td></tr><tr><td>乳酸</td><td>Sigma</td><td>L1750</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Res. Org.</td><td>0090M</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Merck</td><td>10158.6B</td><td></td></tr><tr><td>Percoll（无菌）</td><td>VWR (GE Healthcare)</td><td>GEHE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合物 Halt</td><td>ThermoFisher Scientific (Pierce)</td><td>PIE78420</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钾</td><td>Medical Store</td><td>CH 600</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Merck</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>BDH</td><td>10247.4V</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Tris，超纯级</td><td>Amresco (Astral)</td><td>AM0497</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 Gold，质谱级</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>氯化锌</td><td>Sigma</td><td>Z0173</td><td></td></tr><tr><td>0.4 mm 聚乙烯管</td><td>Goodfellow</td><td>ET317100</td><td></td></tr><tr><td>30 G 针头</td><td>Terumo</td><td>NN2038R</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 注射器</td><td>Terumo</td><td>SS035</td><td></td></tr><tr><td>4.2 mm 聚乙烯管</td><td>Goodfellow</td><td>ET317640</td><td></td></tr><tr><td>编织丝线（5-0）</td><td>Dynek</td><td>CSS0100</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸</td><td>Sigma</td><td>299537</td><td></td></tr><tr><td>TiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 磁珠（来自拆解的柱子）</td><td>Titansphere</td><td>6HT68003</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>C7B30</td><td>Sigma</td><td>C0856</td><td></td></tr></tbody></table>

啮齿动物附睾精子的磷酸化肽分析

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

精子细胞在所有细胞类型中非常独特。尽管精子在睾丸中产生，但一旦前体圆形细胞开始伸长并分化为形态学上可识别的精子细胞，细胞核内的基因转录和翻译即被关闭。然而，此时的精子仍处于高度未成熟状态，尚不具备运动能力或识别卵子的功能。这两项功能的获得发生在精子经过一个称为附睾的次级器官之后。在精子细胞通过附睾约12天的过程中，现有蛋白质的翻译后修饰在细胞成熟过程中发挥着关键作用，其中一个重要方面是蛋白质的磷酸化。为了表征精子成熟过程中发生的磷酸化事件，必须首先获得高纯度的精子细胞群体，并对磷酸化肽段进行预分级。本文介绍了利用逆向冲洗技术，从附睾远端或尾部高效、高产量地分离纯精子细胞的方法。同时阐述了精子磷酸化肽段的溶解、消化以及通过二氧化钛（TiO2）亲和色谱进行预分级的步骤。分离得到的磷酸化肽段可注入质谱仪（MS），以鉴定特定氨基酸残基上的蛋白质磷酸化事件，并定量分析精子成熟过程中发生的磷酸化水平。

任何蛋白质组学分析结果的质量在很大程度上取决于起始材料。在现代质谱技术（MS）下，样品制备中的微量污染也容易被检测到。因此，在精子细胞蛋白质组学研究中，选择一种能够获得高纯度精子的方法至关重要。如图1所示，通过逆行反冲法从附睾尾部回收精子细胞。该方法需使用PE导管插入输精管，并通过连接的注射器缓慢施加气压。图1A展示了附睾尾部与输精管的结构。图1B为导管插入部位结扎后的输精管局部放大图。通过该操作，精子从附睾尾部一条小管的切断端释放出来。如图2A所示，精子从附睾尾部顶端区域被提取，并以静止状态吸入玻璃毛细管中（图2B）。该方法相比传统的“游出法”具有多项优势，尤其重要的是能够在精子运动激活前后进行磷酸化蛋白质组学分析。随后，可将精子排入任意选择的培养基中。图2C（左侧）展示了精子刚排入BWW培养基时的形态，许多细胞聚集在一起；但10分钟后，细胞表现出良好的运动能力，逐渐均匀游散至整个溶液中（图2C右侧细胞）。由于反冲技术对精子细胞影响极小，我们通常可获得接近100%的精子活力，且细胞无需外界刺激即可迅速分散到培养基中。在典型的反冲实验中，从小鼠（Swiss品系）附睾尾部回收的精子数量约为1–5 × 106个，具体数量高度依赖于动物年龄，并可能因小鼠品系不同而有所差异。在挪威大鼠中，通常可获得约200 × 106个精子，波动范围为±20%。图2D展示了从大鼠附睾尾部分离所得精子的纯度。
除了样品本身外，样品制备中的一个主要问题在于胰蛋白酶消化的产率。蛋白质沉淀在此过程中起着关键作用，不仅可去除与质谱（MS）不兼容的去垢剂和盐类等干扰物质，还能使蛋白质变性。我们发现甲醇-氯仿沉淀法效果最佳。该方法不仅被报道在沉淀低丰度蛋白质方面优于其他方法（包括三氯乙酸（TCA）沉淀法）19，还具有其他优势。TCA沉淀后，通常需要在重新悬浮TCA沉淀物后调节pH值，因为沉淀物可能仍呈较强酸性。尽管可通过高比例有机溶剂洗涤TCA沉淀物以去除酸，但这会增加样品处理步骤，并可能导致结果重复性降低。若未能中和酸性环境，将导致胰蛋白酶肽段产率低下。甲醇-氯仿沉淀法不仅操作快速，且不会使样品酸化。图3展示了通常在100 µg样品经甲醇-氯仿沉淀后，于下层与上层液相界面之间可见的蛋白质沉淀物。
磷酸化肽的分离可以通过多种方式进行；然而，其重复性取决于样品在此前及当前步骤中的处理方式。其中一种较为常见且正在发展的方法是TiO2法，最初由Martin Larsen团队开发18,20,21。尽管该方法曾被描述为适用于微柱的操作流程，但我们通过批量色谱法同样可以获得可重复的数据。该方法的成功在很大程度上依赖于洗脱缓冲液的组成，必须按照正确的配方配制；否则，磷酸化肽将完全无法被洗脱出来。
从非运动状态（图4 上图）和运动状态（图4 下图）的附睾尾部精子中富集的TiO2磷酸化肽段在m/z 650–670范围内的实验可重复性及代表性数据可见。我们已证明，即使使用生物学重复样本，该技术也具有极高的可重复性17。随着时间推移出现的蓝色条带是随着乙腈浓度增加，从C18纳米柱上洗脱下来的肽段。显然，在运动型精子群体中（显示n=3，通常进行n=8），存在一个单一同位素质量约为651.5 Da的肽段簇，而在非运动型精子中则完全缺失。随后采用串联质谱技术对该肽段进行鉴定。
<img alt="输精管和附睾尾部装置；生物解剖中的插管与丝线打结。" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：附睾尾部插管操作。（A） 附睾尾部的图像。将插管用胶带固定，使其前端预先拉出的部分暴露约1-2 cm。使用精细的#5钟表匠镊子将此端插入输精管中。（B） 通过在包含输精管和插管的一段组织上绑紧细丝线，将插管固定到位。从小鼠可收集约2-3 µl尾部附睾细胞及液体，浓度约为1 × 106/µl；从大鼠（图示）可获得约30-40 µl液体，浓度相近。
<img alt="附睾尾部精子提取；精子分析；显微镜图像 A-D 描述实验过程。" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2: 用于收集具有活性的附睾尾部精子的玻璃毛细管。（A）从附睾尾顶端分离出一条小管并将其剪断，图中显示了操作的大致位置。（B）图像上方为一根空的玻璃毛细管，下方为先前反向冲洗大鼠所用过的毛细管，无血液污染，上皮细胞污染极少。（C）由于精子仍处于未稀释的附睾液中，尚未开始激活。当精子最初被排入BWW溶液时，呈紧密的“线状”结构（左侧）。细胞的活性易于判断，因为10分钟后大多数精子在无外界扰动的情况下自行游入溶液中（右侧）。（D）附睾尾部精子在孵育后立即拍摄的等分试样图像，显示了细胞的高纯度。
<img alt="用于实验室分析的离心管中蛋白质界面示意图" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3：甲醇-氯仿沉淀法。 精子细胞溶解后，对可溶性组分进行甲醇-氯仿沉淀处理，以确保蛋白质完全变性并去除污染物。蛋白质沉淀物出现在甲醇/水相与氯仿相之间的界面上。需小心移除上层液体，避免扰动该沉淀物。通常保留约 2–3 mm 的上层液体，以防损失蛋白质。
<img alt="质谱结果；运动性分析；色谱图比较；不同细胞类型的 m/z 与时间关系。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig4highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4：典型的TiO2富集的磷酸化肽谱。 根据所述方案，从尾部附睾精子中分离出非运动状态（上方，N = 3）或运动状态（下方，N = 3）的样本。一个单一同位素质量约为651.5 Da的肽簇在运动精子群体中存在，而在非运动群体中完全缺失（箭头所示）。此类比较被称为“无标记（基于质谱）”分析。随后利用该肽段的质量和保留时间，通过串联质谱技术对目标化合物进行靶向分析，以鉴定其来源蛋白质。

任何细胞类型的蛋白质组学分析都高度依赖于起始材料的纯度和预分级分离，以便在进行液相色谱-质谱联用（MS）分析之前降低样品的复杂性。通过使用反向冲洗技术，可以从啮齿类动物中获得高纯度的精子细胞。消化后，可利用TiO2对磷酸化肽段进行富集。

精子细胞在各类细胞中极为独特。尽管在睾丸中产生，但一旦……，细胞核基因的转录和翻译即被关闭。

以下实验的总体目标是定量分析精子细胞在成熟过程中发生的磷酸化肽变化。该目标通过从小鼠体内取出附睾尾部，对精子细胞进行逆行反向冲洗，并将细胞收集到微量毛细管中来实现。随后，让精子细胞游入平衡盐溶液中，以去除污染蛋白，然后对其进行洗涤、裂解和沉淀，从而去除污染的盐类和脂质。通过胰蛋白酶消化喉部蛋白，然后利用二氧化钛富集磷酸化肽段。结果基于液相色谱-质谱分析，展示了蛋白质磷酸化状态的定量变化。该方法有助于回答生殖生物学领域的关键问题，例如精子穿过附睾上皮或在获能过程中发生的磷酸化蛋白质组学变化。尽管该方法为精子细胞生物学研究提供了深入见解，但也可应用于模式生物、癌症、神经病理学等疾病研究以及一般的信号转导通路研究。该方法的可视化演示至关重要，因为难以确定将要对EPI进行操作的区域的解剖结构。首先，通过将以下成分加入一升Milli Q水中，配制200毫升Biggers、Whitten和Whitten（BWW）工作液，以制备套管。使用内径为0.4毫米、外径为1.1毫米的聚乙烯管。将其置于低温加热源上加热，直至管材开始熔化。立即向外拉伸管端，以延长管材并减小其外径。将导管剪裁，使一端变窄，以便更易于插管S小管。将另一端剪至约15厘米。然后将30号针头插入钝端，并连接一个完全回缩的3毫升注射器。通过截取一段20厘米长的PE管，并将其插入套管的一端，制成一个吸吮式吹管。插入微毛细玻璃管支架和玻璃微毛细管。根据文本方案处死一只小鼠后，在阴囊上做一个小切口以暴露附睾。然后使用一对钟表匠用5号镊子将睾丸和附睾从体腔中取出。从尾部附睾端剪去输精管，仅保留约一到两厘米的输精管。然后，在解剖显微镜下使用5倍至40倍的放大倍数，剪除附睾与睾丸相连的近端附属性腺管及组织，完整移除雄性生殖道。将导管变窄端的一至两厘米置于视野中，并使用胶带和5号钟表匠镊子将其固定。轻轻夹住输精管两侧，将其缓缓拉过导管的可见部分。然后使用不可吸收的黑色编织处理丝线，借助钟表镊和5号镊子，在套管穿过的组织上打一个牢固的结。抓住卡塔依皮迪斯的远端，去除阴囊外被膜。为了暴露单个表皮小管，需轻柔地暴露该小管并将其分离，以形成开口，使精子得以释放。接着，轻轻按压注射器的推杆，将空气注入输精管。压力将促使精子从破裂的小管中排出。然后对吸嘴施加负压，将精子吸入玻璃毛细管中。轻轻向吸嘴吹气，或连接注射器，将精子从玻璃毛细管中排出，注入1毫升预热的BWW溶液中。用该溶液洗涤细胞三次，以去除任何污染的蛋白质。除去最后一次洗涤液后，可将精子冷冻以备后续使用，或使用4% CHAPS、2 mol/L硫脲和50 mmol/L Tris（pH 7.4）溶解蛋白质，期间间歇性涡旋混匀，孵育1小时。然后将溶液在10,000 × g下离心20分钟，将上清液转移至新管中，以还原二硫键并对蛋白质进行烷基化处理：向蛋白溶液中加入DTT，使其终浓度为10 mmol/L，涡旋混匀后室温孵育30分钟。然后向裂解液中加入50毫摩尔的IO乙酰胺，涡旋混匀，并在室温下避光孵育30分钟。为沉淀蛋白质，将一体积裂解液、一体积甲醇和0.5体积氯仿混合。涡旋样品后，在10,000 G下离心两分钟，收集上层液体，保留约两毫米以避免吸出界面层。加入等体积甲醇后，轻轻倒置离心管并再次离心。弃去上清液，将沉淀物在空气中干燥三至四分钟，随后进行胰蛋白酶消化及磷酸化肽段富集。起始步骤使用含1 M尿素的25 mM碳酸氢铵溶液。为了重悬胰蛋白酶，将F 50以1:1的蛋白与胰蛋白酶质量比混合，并在37摄氏度、700 RPM条件下于恒温混匀仪中孵育过夜。离心去除未消化的物质后，将上清液转移至新管中。使用根据文本方案配制的DHB缓冲液，将胰蛋白酶消化后的肽段稀释十倍，并将其加入含有200微克干燥二氧化钛微珠的管中，在室温下于旋转仪上孵育一小时。孵育结束后，先用DHB缓冲液洗涤样品一次，再用含80%乙腈和2%三氟乙酸的洗涤缓冲液洗涤样品三次。最后一次离心后，立即加入2.5%氢氧化铵洗脱磷酸化肽段，并在离心后收集上清液。使用0.3微升甲酸对样本进行酸化，如图所示。本方案的一个优点是能够分离出精子细胞。在静止状态下，许多细胞在排入B WW培养基后会立即发生聚集。然而，10分钟后，它们变为均相，溶液也变得均匀。本视频中描述的制备方法通常可获得200乘以10的6次方个精子。该图展示了来自AR大鼠附睾尾的精子纯度。样品制备中的一个主要问题是裂解和消化的得率。与三氯乙酸（TCA）沉淀不同（后者通常需要调节样品的pH值），苯酚-氯仿沉淀法操作快速，且不会使样品酸化。图中显示的是通常从100微克样品中获得的蛋白质沉淀，位于下层与上层界面之间。此处展示了本实验方案的可重复性。随着时间推移出现的蓝色条带是从 C 18 纳米柱洗脱出的肽段。当乙腈浓度在主群中增加时，在约 651.5 道尔顿处出现一个肽段簇，该肽段簇在非保留区间完全缺失。磷酸化肽富集方案是一种高效的技术。在进行该实验操作时，必须牢记样品制备是获得可重复蛋白质组学结果的关键环节。该方法可经调整用于分离糖蛋白，进而解答其他科学问题，例如哪些蛋白质在其蛋白质组的唾液酸含量上发生了改变。

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