啮齿动物附睾精子磷酸分析

以下实验的总体目标是定量精子细胞成熟过程中精子内发生的磷酸肽变化。这是通过从小鼠中取出附睾，对精子细胞进行逆行反冲洗并将细胞收集到微毛细管中来实现的。接下来，让精子细胞游出到平衡的盐溶液中，这样可以去除污染蛋白，然后将它们洗涤、躺置和沉淀，以去除污染的盐和脂肪。

使用胰蛋白酶消化食腺蛋白，然后使用二氧化钛富集，以富集磷酸肽。结果显示基于液相色谱、质谱分析的蛋白质磷酸化状态的定量变化。这种方法可以帮助回答生殖生物学领域的关键问题，例如当精子穿过 EPI 或获能期间会发生什么磷酸化蛋白质组学变化。

虽然这种方法提供了对精子细胞生物学的见解，但它也可以应用于模式生物、癌症等疾病研究、神经系统病理学和一般信号转导途径。这种方法的视觉演示至关重要，因为很难确定 EPI 将作的区域的解剖结构。首先制作 200 毫升 Biggers、Whitten 和 Whitten 或 BWW 工作茎溶液，将以下内容添加到一升 Milli Q 水中制成套管。

使用内径和外径分别为 0.4 毫米和 1.1 毫米的聚乙烯管。用小火保持，直到管路开始熔化。立即向外拉管子的末端以拉伸它，从而减小外径。

切割管子以使一端变窄，这将更容易地对 S deens 进行插管。将另一端切成约 15 厘米。然后将 30 号针头插入钝端，并将一个完全缩回的 3 毫升注射器连接到其上。

剪下 20 厘米长的 PE 管，将其插入套管的一端，制成吸嘴。插入微毛细管玻璃管支架和玻璃微毛细管。根据文本协议对小鼠实施安乐死后，在阴囊上做一个小切口以露出 epi。

然后使用一对制表师。5 号镊子将睾丸和附睾从腔中拉出。切开以去除除 kata 附睾中约 1 至 2 厘米的巨大尊重外的所有。

然后切割以去除近端 EENT 导管和连接附睾和睾丸的组织，并在解剖显微镜下使用 5 倍到 40 倍的放大倍率去除整个雄性生殖轨迹。将套管狭窄端的 1 到 2 厘米放入视野中，并使用胶带用 5 号钟表匠的镊子固定。轻轻地扣住 Vast Deference 的每一侧，并将其拉过套管的可见部分。

然后，用不可吸收的黑色编织处理丝绸，由制表师在空心组织周围打一个安全的结。5 号镊子。抓住 kata epi ides 的远端并去除 Eugenia 的外膜。

为了暴露单个表皮小管，轻轻暴露小管并将其梳理开，为精子释放创造一个开口。接下来，轻轻按下注射器的柱塞，将空气排出到广阔的尊重中。压力会导致精子从破裂的小管中排出。

然后对咬嘴施加吸力，将精子吸入玻璃毛细管。轻轻吹入咬嘴或连接注射器，将精子从玻璃毛细管中排出到一毫升战前 B WW 溶液中。并使用溶液洗涤细胞 3 次以去除任何污染蛋白。

去除最后一次洗涤后，冷冻精子以备后用，或使用 4% CHAPS、两磨牙硫代尿素和 50 毫摩尔 tris pH 7.4 溶解蛋白质，间歇涡旋孵育一小时。然后将溶液以 10， 000 GS 离心 20 分钟，并将上清液转移到新试管中以减少二硫键，并将 DTT 处的蛋白质以终浓度为 10 毫摩尔的烷基化为蛋白质溶液。涡旋并在室温下孵育 30 分钟。

然后向裂解物涡旋中加入 50 毫摩尔的 IO 乙酰胺，并在室温下避光孵育 30 分钟。为了沉淀蛋白质，将 1 体积的裂解物、1 体积的甲醇和 0.5 体积的氯仿混合。涡旋样品后，以 10， 000 Gs 离心 2 分钟，收集顶层，留出约 2 毫米，以避免吸出界面。

加入一体积的甲醇后，轻轻倒置试管并再次离心。弃去上清液，将沉淀风干 3 至 4 分钟，以进行胰蛋白酶、消化和磷酸肽富集。首先使用含有 1 磨牙尿素的 25 毫摩尔碳酸氢铵。

为了重构胰蛋白酶，将 F 50 比 1 重量比的蛋白质与胰蛋白酶混合，并在 37 摄氏度和 700 RPM 的热混合器上孵育过夜。旋转以沉淀未消化的材料后，将上清液转移到新管中。使用根据文本方案制备的 DHB 缓冲液，将 trys 化肽稀释 10 倍，并将其应用于 200 微克干燥的二氧化钛珠中，孵育后在室温下在旋转器上孵育 1 小时，使用 DHB 缓冲液再次洗涤样品，然后使用由 80%A CN 和 2%TFA 组成的洗涤缓冲液洗涤样品 3 次，在最终离心后洗脱磷酸化肽旋转后立即加入 2.5% 氢氧化铵并收集上清液。

使用 0.3 微升甲酸酸化样品，如图所示。该方案的一个优点是精子被分离。在静止状态下，许多细胞在排出到 B WW 培养基中后立即聚集。

然而，10 分钟后，它们变为模态，解变得均匀。本视频中描述的制备通常产生 200 乘以 10 到 6 zoa。该图显示了 AR 大鼠 Cota 附睾动物精子的纯度。

样品制备的一个主要问题是脱离和消解的产量。与通常需要调整样品 pH 值的 TCA 沉淀不同，苯酚氯仿沉淀速度快，不会酸化，此处显示的样品是通常从上下界面之间的 100 μg 样品中看到的蛋白质沉淀。这是该协议的可重复性。

随着时间的推移出现的蓝色条纹是来自 C 18 纳米柱的肽。随着模态种群中乙腈浓度的增加，在约 651.5 道尔顿处有一个肽簇，在非范围内完全不存在。一旦磷酸肽富集方案是一种有效的技术。

在尝试此程序时，重要的是要记住样品制备是获得蛋白质组学可重现结果的关键方面。这种方法可以适用于分离糖蛋白，糖蛋白可用于回答其他问题，例如哪些蛋白质的蛋白质组的 sic acid 含量发生变化。