中血红素的合成水平在哺乳动物细胞中测量

该程序的总体目标是通过使用血红素合成的特异性放射性前体来测量哺乳动物细胞中血红素合成的水平。这是通过首先将细胞与 C 14 标记的 5 种免疫利林酸一起孵育来实现的，C 14 标记的 5 种免疫利林酸将被掺入血红素中。第二步是通过刮擦收集细胞，然后使用血红素提取缓冲液去除它们。

接下来加入达乙醚以提取血红素并收集乙醚相。最后一步是用盐酸洗涤乙醚相，以将卟啉与血红素分离。最终，可以在细胞系中测量血红素合成水平，结果显示血红素合成水平与各种癌细胞和 HK 2 93 T 细胞的水平不同。

与使用 C 14 甘氨酸或铁 59 等现有方法相比，该技术的主要优点是 C 14 ELA 非常特异，可测量整个通路的通量。此外，与铁 59 相比，C 14 辐射非常弱。这项技术的影响延伸到癌症和神经系统疾病的诊断和治疗，因为改变的新陈代谢与包括癌症和神经系统疾病在内的各种疾病有关。

用于血红素测定的细胞的接种共流畅度取决于细胞类型及其生长速率，将细胞接种在 3.5 厘米板中，因此在血红素测量当天的共流畅度为 80% 至 90%。建议使用单个板，因为在测量前一天处理单个板更容易。将无线电标记的五免疫莱克酸 C 14 A LA 添加到细胞中。

由于标记 LA 所需的放射性电量可能因细胞系而异，因此应事先确定所研究细胞系所需的最小量。对于大多数实验，0.1 到 0.3 微咖喱就足以对每种培养物进行良好的测量。菜中加入 0.1 至 0.3，微咖喱五 A LA，冷 A LA 达到终浓度 20，微摩尔总 A L.A 添加冷 A LA 是可选的。

采取适当的预防措施以避免污染实验人员和周围环境，并遵循当地的辐射安全指南来处理所有废物。将细胞与放射性 A LA 一起孵育 16 小时。要开始此过程，请将含有放射性标记细胞的细胞培养皿放在冰上，并将它们带到指定用于放射性工作的区域。

整个提取和蒸发过程必须在防爆罩中进行。使用移液管吸出培养基，用 1 毫升 1 x 冷液洗涤细胞一次。PBS 吸出 PBS 并加入 1 毫升冷 PBS。

使用橡胶警察，刮擦并收集细胞。将细胞转移至预冷的 2 ml 微量离心管中。从所有板中收集细胞后，将所有试管在 4 摄氏度下以 15， 000 G 旋转 1 分钟。

吸出 PBS 并旋转。简而言之，去除残留的 PBS 并将细胞重悬于 100 微升 PBS 涡旋中，并保持在冰上。将 10 μL 细胞悬液从每根 2 ml 试管转移到 1.5 mL 微量离心管中。

立即加入细胞裂解缓冲液并储存在冰上。该 Eloqua 稍后将用于蛋白质浓度的测量。将剩余的 90 微升细胞悬液放入 2 毫升试管中，在 5， 000 G 下在 4 摄氏度下旋转 30 秒。

使用 200 微升移液器吸头完全去除 PBS。向每个试管中加入 300 微升血红素提取缓冲液或 HEB 并涡旋以重悬。沉淀一次只能处理一到两根管，因为沉淀应快速重悬，不要在 HEB 中停留太久。

将 HEB 添加到所有试管中并将沉淀物重悬 15 秒后，涡旋混合并置于冰上 1 分钟，以这种方式涡旋和冰块 3 次。接下来，向每个试管中加入 1.2 毫升达乙醚。由于乙醚从移液器吸头中耗尽，因此请快速上下移液一两次，以帮助将其保持在移液器吸头涡旋中 30 秒。

在 4 摄氏度下以 15， 000 G 离心 5 分钟。使用 1 毫升移液器将顶部乙醚相从每个试管转移到新的微量离心管中。向每管中加入 0.5 毫升两种正盐酸。

酸中添加了少量的三分蓝，使其呈淡蓝色，这将有助于以后区分这两个相。涡旋试管混合，离心后在 4 摄氏度下以 15， 000 G 离心 5 分钟。下相为蓝色，上相为无色。

将上层无色乙醚相转移到新管中。用盐酸重复洗涤乙醚相，每次再洗涤两次。在新试管中收集无色的上层相，丢弃下层蓝色相。

将顶部相转移到闪烁瓶中。通过将样品放在化学罩中过夜来干燥样品。第二天蒸发达乙醚。

向每个干燥的样品中加入 5 毫升闪烁液，并充分摇匀。使用闪烁计数器测量放射性。血红素合成水平计算为每毫克总蛋白的放射性量（以皮摩尔为单位）。

本视频中演示的方案用于比较正常肺细胞和癌性肺细胞之间血红素合成的水平以及线粒体解偶联的存在和存在。CCCP.在没有 CCCP 的情况下，在癌细胞中检测到更高水平的血红素合成。正如预期的那样，在正常细胞和癌细胞中存在 CCCP 的情况下，血液合成水平都会降低。

在存在和不存在老年丙酮或 SA 的情况下，还计算了 helo 细胞中的血红素合成水平SA 是血红素生物合成途径中第二种酶的有效和特异性抑制剂，先前已被证明可以抑制血红素合成。结果表明，在 sa 存在下，血红素合成水平下降了 10 倍以上。为了进一步证明该测定法的用途，测量并比较了四种癌症和 HEK 2 9 3 T 细胞系的血红素合成水平以进行统计分析。

比较癌细胞和 HT K 2 9 3 T 细胞中的血红素合成水平与 HCC 4 0 1 7 细胞中的血红素合成水平。星号表示开发后小于 0.005 的 P 值。这项技术为癌症领域的研究人员探索改变血红素代谢以进行可能的癌症诊断和治疗铺平了道路。

观看此视频后，您应该对如何使用氦合成的特定放射性前体 LA 测量哺乳动物细胞中氦合成水平有很好的了解。