Name: 中血红素的合成水平在哺乳动物细胞中测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 了解使用放射性前体测量哺乳动物细胞中血红素合成水平的方法。该技术可比较不同细胞系中的血红素水平，为癌症生物学和代谢研究提供敏感可靠的检测手段。

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HCC4017 和 HBEC30KT 细胞系由 John Minna 博士的实验室惠赠。本工作由 Li Zhang 博士获得的 Cecil H. 和 Ida Green 基金资助。

警告：操作放射性物质时，应采取适当预防措施，避免实验人员和周围环境受到污染。所有废弃物须按照当地的辐射安全指南进行处理。
1. 细胞的制备
<ol>
	<li>在3.5 cm培养皿中接种细胞，使检测当天细胞融合度达到80%–90%。
	<ol>
		<li>注意：细胞的接种密度取决于细胞类型及其生长速率。当使用试剂处理细胞若干天时，应使检测血红素当天细胞融合度为80%–90%。如果从3.5 cm培养皿中获得的细胞数量不足，可使用6 cm培养皿，并在下一步中加入与之前相同量的放射性ALA。 
		注意：建议使用单独的培养皿，因为单独操作培养皿更方便。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血红素检测前一天，在适合操作放射性物质的工作区域，向每孔培养皿中加入0.1–0.3 µCi [14C] 5-ALA和未标记ALA，使总ALA终浓度为20 µM，随后将培养皿放回培养箱。理想情况下，用放射性ALA孵育16小时。 
	注意：不同细胞系所需的放射性标记5-ALA可能不同。为尽量减少计数误差，每分钟放射性计数（cpm）至少应达到100。建议确定所研究细胞系所需的最低量的[14C] 5-ALA。大多数实验中，0.1–0.3 µCi即可获得良好的检测结果。添加未标记ALA为可选步骤。</li>
</ol>
2. 血红素提取
<ol>
	<li>将细胞培养皿置于冰上，并转移至适合进行放射性工作的区域。
	<ol>
		<li>整个提取和蒸发过程均需在防爆通风橱中进行。由于储存的乙醚可能发生爆炸，应使用小瓶装乙醚，并将残留液体蒸发处理，切勿将乙醚在敞口瓶中储存超过一个月。丙酮高度易燃，切勿在明火或加热器附近使用。含丙酮的试剂应储存于玻璃瓶中，因其可溶解组织培养用塑料器皿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用移液器吸除培养基。用1 ml 1×冷PBS洗涤细胞一次，随后吸除PBS。</li>
	<li>向培养皿中加入1 ml 1×冷PBS，使用橡胶刮刀收集皿底的细胞。将每块培养皿收集的细胞转移至已标记的预冷2 ml离心管中。将所有细胞收集至2 ml离心管中。 
	注意：每块培养皿刮取细胞时应使用新的橡胶刮刀。每块培养皿需准备四个2 ml离心管、一个1.5 ml离心管和一个闪烁计数小瓶。</li>
	<li>在4 °C条件下，以15,000 × g离心1分钟。</li>
	<li>用移液器吸除PBS，短暂离心后彻底去除残留PBS。用100 μl 1× PBS重悬细胞。涡旋振荡使细胞充分重悬，并置于冰上保存。</li>
	<li>从第5步中取10 μl转移至1.5 ml微量离心管中，置于冰上保存，用于测定蛋白浓度。 
	注意：应向细胞中加入细胞裂解缓冲液，并置于冰上，以备后续测定蛋白浓度。</li>
	<li>将第5步剩余的90 µl在4 °C条件下以5,000 × g离心30秒，使用200 µl移液器吸头彻底去除PBS。</li>
	<li>向每管中加入300 µl血红素提取缓冲液（见材料列表），涡旋振荡15秒以混匀，置于冰上1分钟，重复此步骤3次。
	<ol>
		<li>加入血红素提取缓冲液（HEB）后迅速涡旋振荡，以重悬沉淀，每次仅处理一至两管，因为沉淀必须快速重悬，避免在HEB中长时间静置。当所有管均加入HEB并完成初步重悬后，再按第8步所述进行15秒涡旋和1分钟冰浴的循环操作。请注意，若沉淀在HEB中停留时间过长且未及时重悬，可能无法完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每管中加入1.2 ml乙醚，涡旋振荡30秒。在4 °C条件下以15,000 × g离心5分钟。 
	注意：乙醚从移液器吸头中流失较快。为控制此现象，可在吸取乙醚后上下吹打一至两次，有助于将乙醚保留在吸头内。每次更换新的移液器吸头时均需重复此操作。</li>
	<li>用1 ml移液器将上层（乙醚相）转移至新的微量离心管中。加入0.5 ml 2 N HCl，涡旋混匀后按第9步条件离心。 
	注意：乙醚相与HCl相之间的界面不易观察。因此，可在实验所用的2 N HCl溶液中加入少量台盼蓝，使其呈现淡蓝色即可。这有助于区分两相：下层为蓝色，上层乙醚相为无色。将上层无色乙醚相转移至新管，弃去下层HCl（蓝色）相。</li>
	<li>重复第10步两次，用2 N HCl洗涤乙醚相。每次重复时仅转移上层乙醚相至新管，弃去下层HCl相。</li>
	<li>第三次HCl洗涤后，用1 ml移液器将上层相转移至闪烁计数小瓶中。将样品置于化学通风橱中过夜（O/N），通过蒸发去除乙醚使样品干燥。</li>
</ol>
3. 放射性测量
<ol>
	<li>第二天，向步骤 2.12 中干燥的样品中加入 5 ml 闪烁液。</li>
	<li>充分振荡混匀，使用闪烁计数器测定放射性。</li>
</ol>
4. 计算
<ol>
	<li>使用等量的CelLytic M缓冲液（见材料列表）裂解步骤2.6中的细胞，并在4 °C下以14,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>取上清液一份 aliquot，使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。 
	总蛋白量（毫克，TP）=（90 µl × 蛋白浓度 µg/µl）/ 1,000 
	血红素合成水平（放射活性/TP）= pmol/mg 蛋白。</li>
</ol>

我们无任何披露事项。

血红素在通过呼吸作用产生细胞能量的过程中起着关键作用26。已知血红素代谢异常与多种疾病相关，包括癌症28,41。抑制血红素的合成已被证实可导致Hela细胞发生细胞周期阻滞和凋亡26,41。已有研究表明，高水平的血红素合成与肺癌细胞的进展相关28。因此，测量不同条件下细胞内血红素生物合成水平具有重要意义。本文讨论的方法并不定量细胞中血红素的总量，因此无法提供细胞内血红素的绝对值。目前已有多种比色法和试剂盒可用于测定细胞中血红素的总量。例如，可将细胞和线粒体中的血红素用丙酮与盐酸的混合液提取，并与50%（v/v）乙腈混合。随后将混合物上样至3.9 x 300 mm C18 Bondclone色谱柱，使用含0.05%（v/v）三氟乙酸的乙腈梯度洗脱血红素，并在400 nm处鉴定血红素化合物44,45。
此前，为了测定哺乳动物组织和细胞提取物中的血红素生物合成水平，曾使用[14C]-甘氨酸和[14C] 5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）<su...

血红素是亚铁离子与原卟啉IX形成的复合物，在几乎所有生物体的氧气运输和利用过程中起着核心作用1-3。血红素独特的结构使其能够作为双原子气体和电子的载体，并执行多种其他功能1-5。例如，血红素在血红蛋白和肌红蛋白中与氧气结合，实现氧气的转运和储存6,7；在呼吸过程中，它作为细胞色素中的电子载体，并作为细胞色素P450酶催化的氧化还原反应中的电子供体8,9。血红素最重要的特性之一是其在细胞和分子过程（如基因转录、蛋白质合成以及微小RNA的生成）中发挥调控作用4。例如，血红素通过调控哺乳动物转录抑制因子Bach1和哺乳动物核受体Rev-erbα的活性，影响多个基因的转录10-15。血红素还调控血红素激活蛋白（Hap）1的活化，后者在响应血红素或氧气时，对参与呼吸作用及控制氧化损伤的基因激活具有重要作用16。血红素还可通过神经生长因子（NGF）信号通路调控神经元细胞中的基因转录3,17-20。此外，血红素通过调节血红素调控的eIF2α激酶（HRI）的活性，在哺乳动物红系细胞中调控蛋白质合成21-24。血红素还影响关键信号蛋白（如酪氨酸激酶Jak2和Src）的活性，这些蛋白对细胞正常功能和细胞生长至关重要4,20,25。研究发现，在HeLa细胞中，血红素的抑制会导致细胞周期阻滞，并激活与衰老和凋亡相关的标志物26。人体内血红素缺乏或水平升高均与严重的健康问题相关27。近期的分子和流行病学研究显示，高血红素摄入与2型糖尿病、冠心病以及多种癌症（包括肺癌、结直肠癌和胰腺癌）风险增加呈正相关27,28。作者实验室利用一对匹配的正常肺细胞和肺癌细胞发现，癌细胞中氧气消耗、血红素合成以及参与血红素摄取和氧气利用的蛋白质水平均升高28。有趣的是，抑制血红素合成可降低癌细胞的氧气消耗、增殖、迁移和克隆形成能力28。因此，内源性血红素水平的波动在分子和细胞过程的调控中起着重要作用3,4,28,29。
在哺乳动物中，血红素的生物合成包括八个步骤，涉及位于线粒体和细胞质中的酶4（图1）。血红素的生物合成起始于线粒体基质，由ALA合酶（ALAS）催化甘氨酸与琥珀酰辅酶A缩合生成5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）4,31，此为非红细胞细胞中血红素合成的限速步骤。随后，5-ALA被转运至细胞质，在细胞质中经过接下来的四个步骤生成粪卟啉原III（CPgenIII），之后CPgenIII被重新转运回线粒体，并在线粒体中转化为原卟啉IX（PPIX）。最后，在原卟啉IX（PPIX）中插入一个铁分子生成血红素，该反应由亚铁螯合酶（FECH）催化完成2,4。
血红素的生物合成水平主要取决于ALAS酶的水平，而ALAS酶受到细胞内铁和血红素的严格调控4血红素的生物合成可能受到遗传缺陷、某些矿物质和维生素的可利用性的影响（例如， 核黄素，锌），暴露于毒素（例如， 铝、铅）、缺氧、发热以及某些类固醇的水平（例如， 雌激素32-35在多种疾病状态下，血红素的合成水平会发生改变。血红素生物合成减少可导致贫血以及神经系统疾病。3,36或者，血红素生物合成的增加在某些癌症的发展进程中起着重要作用28,37血红素已被证明对哺乳动物脂肪细胞、红系细胞和神经元细胞的生长、分化及存活至关重要4,38-41例如，血红素缺乏通过抑制谷氨酸NMDA受体，导致原代小鼠皮层神经元的神经突损伤N-甲基-D-天冬氨酸) 受体17此外，血红素合成的抑制可导致人宫颈上皮癌HeLa细胞发生程序性细胞死亡。26,41因此，在不同条件下测定各种细胞中的血红素生物合成水平，对于研究多种疾病的病因和进展具有重要意义。
本文介绍一种利用[4-14C] 5-氨基乙酰丙酸快速且灵敏地测定细胞内血红素合成水平的方法。该方法可作为使用55Fe或59Fe的其他方法的替代方案。我们更倾向于使用14C，因其辐射极弱；相比之下，操作铁同位素时需要严格的防护措施。此外，本方法旨在快速平行测定并比较不同细胞中的血红素合成情况。若需测定血红素的绝对含量，可采用先前建立的高效液相色谱法（HPLC）42,43。

<table><tbody><tr><td>丙酮</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>HCl（盐酸）</td><td>Fisher</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>液体闪烁液&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>882470</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Gibco</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>放射性标记的4-&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;C氨基乙酰丙酸</td><td>Perkin-Elmer life sciences</td><td></td><td>于-80 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>CelLytic M</td><td>Sigma</td><td>C2978</td><td>哺乳动物细胞裂解试剂</td></tr><tr><td>Pierce BCA蛋白定量检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;特异性试剂&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;组分&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;分装&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>血红素提取缓冲液：&lt;br /&gt;丙酮:盐酸:水（25:1.3:5）</td><td>丙酮&lt;br /&gt; 浓盐酸&lt;br /&gt;水</td><td>25 ml&lt;br /&gt;1.3 ml&lt;br /&gt;5 ml</td><td></td></tr></tbody></table>

哺乳动物细胞中血红素合成水平的测定

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

血红素是多种被称为血红蛋白的蛋白质的辅基，例如血红蛋白、肌红蛋白和细胞色素。它参与多种分子和细胞过程，如基因转录、翻译、细胞分化和细胞增殖。血红素的生物合成水平在不同组织和细胞类型中各不相同，并在贫血、神经病变和癌症等疾病状态下发生改变。该技术使用[4-14C] 5-氨基乙酰丙酸（[14C] 5-ALA）——血红素生物合成途径中的早期前体之一——来测定哺乳动物细胞中血红素的合成水平。该检测方法包括将细胞与[14C] 5-ALA共孵育，随后提取血红素并测量掺入血红素中的放射性活性。该方法准确且快速。此方法测定的是血红素生物合成的相对水平，而非总血红素含量。为展示该技术的应用，测定了几种哺乳动物细胞系中的血红素生物合成水平。

该方法用于比较正常（HBEC30KT）与癌变（HCC4017）肺细胞中血红素合成的水平。图2显示，癌细胞（HCC4017）中的血红素合成水平高于正常肺细胞（HBEC30KT）。在存在线粒体解偶联剂羰基氰化物-3-氯苯腙（CCCP）的情况下，也测定了正常细胞和癌细胞中的血红素合成水平。在测定血红素合成水平前，细胞经10 μM CCCP处理24小时。如预期所示，血红素合成水平（图2）在正常和癌细胞中均因CCCP的存在而降低。先前研究表明，血红素合成可被乙酰丙酮（SA）抑制，SA是一种强效且特异性的5-氨基乙酰丙酸脱水酶（ALAD）抑制剂，ALAD是血红素生物合成途径中的第二个酶41。利用该方法，在0.5 mM SA存在或不存在的情况下测定了HeLa细胞中的血红素合成水平。图3显示，在SA存在时，血红素合成水平下降了10倍以上。为进一步展示该技术的应用，测定了4种癌细胞系和HEK293T细胞系中的血红素合成水平，并进行了比较，结果如图4所示。
<p class="jove_con...

细胞内血红素水平的改变与癌症等常见疾病相关。因此，有必要在多种细胞中测定血红素生物合成水平。本实验方案旨在提供一种快速且灵敏的方法，用于测定和比较不同细胞中血红素合成的水平。

血红素是多种蛋白质（称为血红蛋白）的辅基，如血红蛋白、肌红蛋白和细胞色素。它参与……

本实验的总体目标是利用血红素合成的特异性放射性前体物质，测定哺乳动物细胞中血红素的合成水平。首先将细胞与碳-14标记的δ-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid）共同孵育，使其掺入血红素中；第二步通过刮取收集细胞，随后使用血红素提取缓冲液裂解细胞。接着加入乙醚以萃取血红素，并收集乙醚相。最后一步是用盐酸洗涤乙醚相，以将卟啉与血红素分离。最终可在细胞系中测定血红素合成水平，结果展示了不同癌细胞以及HK 293T细胞中血红素合成水平的差异。与现有方法（如使用 C 14 甘氨酸或铁 59）相比，该技术的主要优势在于 C 14 ELA 具有高度特异性，能够测量整个通路的通量。此外，C 14 辐射远弱于铁 59。该技术的应用前景涵盖癌症和神经系统疾病的诊断与治疗，因为代谢异常与包括癌症和神经系统疾病在内的多种疾病相关。血红素检测中细胞的接种密度取决于细胞类型及其生长速率，建议在3.5厘米培养皿中接种细胞，使其在血红素测定当天融合度达到80%至90%。推荐使用单独的培养皿，因为在测定前一天更便于操作单个培养皿。向细胞中加入放射性标记的5-氨基乙酰丙酸（C14-ALA）。由于不同细胞系所需的放射性标记LA的量可能有所不同，应预先确定所研究细胞系所需的最低用量。对于大多数实验，每份培养物加入0.1至0.3 µCi的放射性标记即可获得良好的检测结果。在培养皿中加入0.1至0.3 µCi的放射性标记LA，并可选择性地加入未标记LA，使LA的终浓度达到20 µM。加入未标记LA为可选步骤。采取适当的预防措施，避免实验人员和周围环境受到污染，并遵循当地的放射性安全指南处理所有废弃物。将细胞与放射性5-氨基乙酰丙酸（ALA）共同孵育16小时。开始该操作时，将含有放射性标记细胞的细胞培养皿置于冰上，并转移至指定的放射性工作区域。整个提取和蒸发过程必须在防爆通风橱中进行。使用移液器吸除培养基，用一毫升冷的一倍浓度 PBS 洗涤细胞一次，吸除 PBS 后，加入一毫升冷 PBS。使用橡胶刮刀刮取并收集细胞。将细胞转移至预冷的 2 毫升微量离心管中。从所有培养板中收集细胞后，在 4°C 条件下以 15,000 G 离心 1 分钟。吸去 PBS 并离心。短暂去除残留的 PBS，将细胞重悬于 100 微升 PBS 中，涡旋混匀后置于冰上。从每支 2 毫升离心管中转移 10 微升细胞悬液至 1.5 毫升微量离心管中。立即加入细胞裂解缓冲液，并置于冰上保存。此Eloqua后续将用于蛋白质浓度测定。将两毫升离心管中剩余的90微升细胞悬液在4摄氏度下以5,000 G离心30秒。使用 200 微升移液枪头彻底去除 PBS。向每根试管中加入 300 微升血红素提取缓冲液（HEB），并涡旋振荡以重悬沉淀。每次仅处理一到两根试管，因为沉淀需快速重悬，避免在 HEB 中放置过久。将HEB加入所有离

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

中血红素的合成水平在哺乳动物细胞中测量

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