的16S核糖体RNA基因的扩增子的新一代测序
August 29th, 2014
表征微生物群落一直是环境微生物学的一个长期目标。新一代测序方法现在可以以前所未有的深度对微生物群落进行表征，同时将成本和劳动力降至最低。我们在这里详细介绍了我们使用台式测序仪对细菌 16S 核糖体 RNA 基因进行测序的方法。
该程序的总体目标是对 16 个 S-R-R-N-A 进行排序。使用台式测序机从环境样品中扩增基因。这是通过首先使用修饰的引物扩增 16 个 S-R-R-N-A 基因来实现的。
第二步是纯化扩增产物，定量并合并。接下来，将扩增子库连接到在乳液 PCR 过程中克隆扩增的测序球体上，并在台式测序仪上进行测序。最后一步是分析生成的序列数据集。
最终 16 S-R-R-N-A。基因扩增子测序用于确定环境样品中微生物群落的组成和多样性。与 DGG 或克隆测序等现有方法相比，该技术的主要优势在于，它可以更深入、更清晰地了解微生物群落的组成和多样性。
这种方法可以帮助您回答微生物生态学中的一个关键问题，谁在那里开始正向和反向引物？两个 X 热启动 tac 加预混液和样品，正向和反向引物的顺序符合所示模板。该序列包含 ion torrent 特定的适配器。
一个 Sequencing Key，用于在排序开始时校准信号强度。运行模板特异性引物和 10 碱基对条形码。然后在使用前彻底混合引物和样品。
制备 PCR 反应。每个反应混合 20 μL，其中包含 0.5 μmol 的反向引物、0.4 mg/mL 的 BSA 和 1 X 热启动 tac 加预混液。接下来，将 18.5 微升预混液移液到每个 PCR 管中，向将要一起测序的每个样品中加入 0.5 微升含有不同条形码的 20 毫摩尔正向引物储备液。
然后在 PCR 通风橱外，向 PCR 管中加入 1 微升浓度为 1 至 10 纳克/微升的样品。设置一个初始变性为 95 摄氏度的程序，持续 5 分钟。然后 25 次 95 摄氏度的循环，持续 30 秒。
55 摄氏度持续 30 秒，72 摄氏度持续 45 秒。最终伸长应在 72 摄氏度下持续 10 分钟。将试管放入 PCR 机器中并启动程序。
最终的 PCR 产物可以放置在 4 摄氏度或负 20 摄氏度下，直到使用。使用可用的最大梳子制备 2%aros 凝胶。然后，将 5 微升 6 x 凝胶上样染料与每个 PCR 反应混合，并将样品上样到凝胶上，用空样品分离每个样品。
将凝胶在 70 伏特下运行50分钟。凝胶电泳后，拍摄凝胶照片并使用手术刀切割条带。每个条带预计有大约 250 个碱基对，其中包含一个 190 个碱基对产品，其中 63 个碱基对构成接头和条形码。
接下来，称量切除的条带并继续进行 PCR 产物的凝胶提取和纯化。使用皮划艇快速凝胶提取试剂盒等试剂盒，然后用 pico green 定量每个 PCR 产物并稀释以获得 5 乘以 10 至第 9 个分子/微升的储备液，即大约每微升 1 纳克。如果某些样品的扩增率较低，请根据需要调整浓度，但不要低于 1.57 乘以 10 至第 7 个分子/微升。
混合 10 μL 每种稀释的 PCR 产物以获得等摩尔的样品池，为每次计划的测序运行准备一个单独的池。混合的 PCR 产物可以保存在冰箱中，直到用于进行乳化。PCR：首先，将混合的 PCR 产物稀释至 26 皮摩尔，体积为 25 μL，并从离子 PGM 模板试剂盒中取出试剂。
然后在 PCR 通风橱中工作并制备乳剂 PCR。混合混合的 PCR 产物，在工作台上工作时可以添加球状颗粒。充分混合溶液，然后将混合物插入滤芯中，小心地在上面撒上乳化油。
接下来，缓慢倒置滤芯并将滤芯加载到自动乳化液 PCR 仪上。然后选择适当的程序并启动该过程。自动乳剂 PCR 完成后，从收集管中取出上清液，并在管底部取回球状颗粒。复苏。
将球体悬浮在 100 μL 洗涤液中，取 2 μL 等分试样进行文库定量。要对 PCR 产物进行测序，请准备一份测序运行计划，指定测序运行的详细信息。然后打开仪器，单击初始化，出现提示时，将 2 号洗涤液、1 号洗涤液和自动 pH 缓冲溶液安装到测序仪中。
接下来，继续初始化过程，并在出现提示时，将 D-A-T-P-D-G-T-P-D-C-T-P 和 DTTP 核苷酸添加到各自的 50 毫升试管中。然后将试管拧到测序机上并继续初始化过程。初始化程序完成后，立即启动样品加载程序以准备用于测序的样品。
将乳剂 PCR 中富集的球体以 15， 500 倍 G 离心 1.5 分钟，以收集管底部的球体。然后去除 S natin，在试管中正好留下 3 微升。接下来，向试管中加入 3 微升测序引物，上下移液以重悬颗粒并彻底混合溶液。
将试管在 95 摄氏度下孵育 2 分钟，然后在 37 摄氏度下孵育 2 分钟。孵育完成后，加入 1 微升聚合酶并充分混合，然后在室温下孵育混合物 5 分钟。在混合物孵育时，将测序芯片加载到测序仪上并执行芯片质量检查。
然后通过快速离心和微量离心机从芯片中去除液体。通过缓慢移液 7 μL 酶球混合物并避免在芯片中引入气泡，将样品加载到芯片中。将样品加载到芯片中后，将芯片放入仪器中并开始测序运行。
要开始分析数据，请连接到测序数据服务器并下载快速 Q 文件。然后创建一个选项卡，其中包含引物和条形码信息的分隔寡核苷酸文件。接下来，从 mother 网站下载 Green Genes 参考文件，启动 mother，然后执行分析。
使用屏幕底部显示的命令将 FASTQ 文件转换为快速质量文件。确定每个序列的组成员资格并修剪序列。使用此命令，然后在 Green Genes 分类法中对序列进行分类。
使用此命令，在 ion torrent PGM 上使用 3 14 飞船进行测序时，平均输出约为 0.3 至 50 万。在 mother 中过滤结果后，质量良好的读数。以下是该下一代测序程序每个步骤后读取数的典型细分，此处显示的是所有 36 个多重环境样品在门类水平上的平均群落组成，这些样品用靶向 16 s 核糖体的 V 3 至 4 区域的引物扩增，并使用 mother One master 进行分析。
如果执行得当，这项技术可以在两天内完成。看完这个视频，你应该对如何使用台式测序机对 16 s 核糖体 RNA 申请人进行测序有了很好的了解。
概述
本文详细介绍了一种使用台式测序仪对环境样本中的细菌16S核糖体RNA基因进行测序的方法。该方法允许对微生物群落进行深入表征，增强了我们对微生物生态学的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 环境微生物学
- 微生物生态学
- 下一代测序
背景
- 对微生物群落的表征在环境微生物学中至关重要。
- 下一代测序为这种表征提供了一种经济高效的方法。
- 16S核糖体RNA基因测序是研究微生物多样性的标准技术。
- 该方法比传统的测序技术具有优势。
研究目的
- 对环境样本中的16S rRNA基因进行测序。
- 确定微生物群落的组成和多样性。
- 提供对微生物生态学更清晰的视角。
使用的方法
- 使用修改的引物对16S rRNA基因进行扩增。
- 扩增产物的纯化和定量。
- 用于测序球体克隆扩增的乳化PCR。
- 在台式测序仪上进行测序和后续数据分析。
主要结果
- 成功扩增和测序了16S rRNA基因。
- 生成高质量的序列数据用于微生物群落分析。
- 增强了对环境样本中微生物多样性的理解。
- 相比传统技术，展示了该方法的效率。
结论
- 该方法为微生物群落表征提供了一个稳健的框架。
- 它促进了对微生物生态学的更深入的洞察。
- 这种方法可以应用于各种环境样本进行全面研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput 16S rRNA gene amplicon sequencing enables rapid, in-depth profiling of microbial communities, supporting early discovery and mechanistic de-risking in biopharma R&D. The approach increases predictive confidence in microbiome-related target validation and facilitates scalable, reproducible workflows for environmental and host-associated studies. Benchtop sequencing platforms democratize access, allowing smaller teams to generate actionable data for portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of microbial community composition for hypothesis-driven research.
- Supports functional target validation by clarifying microbial diversity and abundance in disease-relevant systems.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing quantitative taxonomic profiles for candidate selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microbial DNA samples for downstream sequencing and analysis workflows.
- Standardizes amplicon generation and barcoding, ensuring reproducibility and scalability across projects.
- Delivers quantitative sequence outputs suitable for comparative screening and assay optimization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microbial profiling with translational biomarker discovery when microbiome composition is relevant.
- Enables continuity from environmental sampling through preclinical model validation for microbiome studies.
- Supports risk-adjusted advancement by providing robust, reproducible community data for decision points.
Pipeline & Workflow Integration
This sequencing workflow bridges early discovery, screening, and translational research by providing standardized, high-resolution microbial community data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through detailed taxonomic profiling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative sequence data for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Generates high-quality reads and taxonomic assignments for robust statistical comparison across samples.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and preclinical model validation when microbiome composition is a factor.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable sequencing capability for diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in microbiome-driven target validation.
- Operational Value: Streamlines sample processing, sequencing, and data analysis for reproducible outputs.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management in microbiome research.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of microbiome-related assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in PCR, next-generation sequencing, and bioinformatics analysis.
- Needs access to benchtop sequencers, emulsion PCR instrumentation, and computational infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of primer design, barcoding, and data processing.
- Adaptation across sample types and environmental matrices may require protocol optimization.
- Sequencing depth and read quality must be monitored to ensure reliable taxonomic resolution.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:28
16S rRNA Gene Amplicon Library Preparation by the Fusion Method
3:21
Amplicon Purification, Quantification, and Pooling
4:58
Emulsion PCR and Sequencing
8:12
Basic Sequence Data Analysis
9:15
Results: Sequence Analysis of the 16S rRNA Gene
9:57
Conclusion
