Name: 小鼠模型的非侵入性成像检测和监测卵巢癌复发 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 了解如何使用非侵入性成像技术在小鼠异种移植模型中检测和监测卵巢癌复发。该方法利用mCherry荧光标记实现实时肿瘤追踪，无需牺牲动物即可评估治疗效果和疾病进展。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为RO1CA118678和RO1CA127913，同时得到桑兹家族基金会和“从发现到治愈”项目的支持。

耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准了所述的所有体内实验工作。样本采集已获得患者知情同意，并经耶鲁大学医学院人类研究委员会批准。
1. 人卵巢癌细胞的制备
<ol>
	<li>在准备细胞前，请确保下文所述子宫内注射所需的所有材料均已备妥并易于取用。细胞悬液准备好后应立即进行注射。
	<ol>
		<li>在培养基中培养荧光标记的癌细胞。我们使用第2代人源CD44+/MyD88+上皮性卵巢癌细胞（F2代），此前我们已证实这些细胞具有干性特性，如致瘤性、耐药性以及强大的肿瘤修复能力14-19。这些细胞通过慢病毒转导稳定表达mCherry荧光蛋白（F2-mCherry，图1），慢病毒由聚乙烯亚胺（PEI）法生产20,21。</li>
		<li>注射当天，用胰酶消化法收集细胞，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。</li>
		<li>计数细胞后，将细胞重悬于适当培养基中，浓度为3 × 106 个细胞/50 µl。对于卵巢癌细胞，我们使用含10%胎牛血清的RPMI 160培养基。细胞在注射前可短暂置于培养箱中，但存放时间不得超过15分钟。此剂量适用于一只小鼠的注射。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在裸鼠子宫内注射人卵巢癌细胞
请注意，以下操作需要第二位人员协助。此外，由于这是存活手术，需使用无菌外科器械。该存活手术操作应耗时约10至15分钟。
<ol>
	<li>使用 2% 异氟烷麻醉小鼠。通常使用 7 至 8 周龄的裸鼠。</li>
	<li>用手指或镊子轻捏足垫以确认动物是否完全麻醉。&#160;在开始手术前，动物应对疼痛无任何反应。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠仰卧置于无菌纱布垫上，头部朝向远离操作者的方向。</li>
	<li>使用棉签蘸取眼膏涂抹于眼睛表面，以防止麻醉期间角膜干燥。</li>
	<li>立即将小鼠头部置入连接异氟烷挥发罐的鼻罩系统中（图 2A），以在整个手术过程中持续供给麻醉气体。</li>
	<li>使用酒精棉片对小鼠腹部左侧（或右侧）进行消毒（图 2B），随后使用碘液再次消毒，然后在手术区域覆盖无菌手术巾。</li>
	<li>使用无菌手术剪和镊子在小鼠左下腹区域做 1–2 cm 的皮肤切口（图 2C）。</li>
	<li>提起腹肌并切开，以进入腹膜腔。</li>
	<li>分离斜肌以暴露腹腔。</li>
	<li>定位并识别左侧子宫角（图 2D）。</li>
	<li>使用无菌止血钳夹住子宫角的前后两端（图 2E）。前侧夹钳应置于输卵管下方，后侧夹钳应置于宫颈上方。</li>
	<li>由第二位操作者注射细胞悬液。将含有细胞的针头以 45° 角垂直于子宫角方向插入（图 2F），缓慢向子宫角腔内注入 50 µl 细胞悬液。</li>
	<li>拔出针头，并松开前侧夹钳。</li>
	<li>松开后侧夹钳，并将子宫角复位至腹腔内。</li>
	<li>使用合成可吸收缝线缝合腹膜，使用组织粘合剂闭合皮肤。</li>
	<li>将小鼠从鼻罩中取出并放回笼中。如有需要，更换垫料以确保术后环境清洁。&#160;务必确保所有动物在无人看护前已清醒并恢复活动能力。</li>
	<li>术后前 48 小时内，在饮水中提供 0.11 mg/ml 的布洛芬。&#160;之后更换为正常饮用水。&#160;
	<ol>
		<li>注意：若使用裸鼠且皮肤采用组织粘合剂闭合而非缝线，则术后无需单独隔离饲养。SCID 小鼠更具攻击性，可能需要分笼饲养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>密切观察切口部位，防止因开放性伤口引发感染。</li>
</ol>
3. 活体检测腹膜内早期卵巢癌 在体 内 成像
通过活体检测腹腔内（i.p.）疾病的存在 体内 成像。本方案中使用了多模态动物旋转系统（MARS）。
<ol>
	<li>从 MI 软件中访问 MARS 采集软件。该模块在利用成像系统的采集和分析功能的同时，提供对 MARS 采集设置的协调控制。在进入第 3.4 步制定旋转方案之前，先通过单视图成像优化每种模态的单独采集参数。</li>
	<li>输入预设的采集参数。对于荧光采集，使用 10 秒曝光时间、2 × 2 binning、f 值 2.8、视场 120 mm、激发波长 550 nm、发射波长 600 nm 滤光片的采集设置。对于 X 射线采集，使用 10 秒曝光时间、2 × 2 binning、f 值 2.8、视场 120 mm、35 kVp、0.4 mm 铝滤光片的采集设置。</li>
	<li>将第 3.2 步中的参数保存为独立的会话文件。</li>
	<li>在系统界面的采集窗口中选择 创建/编辑方案 按钮，以创建旋转序列方案。</li>
	<li>选择先前保存的荧光会话文件，并将其保存为第一步；然后选择对应的 X 射线会话文件，并将其保存为第二步。</li>
	<li>选中第一步后，从 图像采集前 弹出菜单中选择 设置旋转序列，设定所需的起始角度、范围和增量，以确保特征的无缝可视化。具体参数包括起始角度为 -180 度、范围为 375 度、增量为 15 度。</li>
	<li>保存该方案，并点击 完成 按钮以初始化 MARS 并映射与每个角度增量对应的步进电机位置。</li>
	<li>按照以下说明执行最终校准，以对齐动物支撑装置中特定动物的腹侧、背侧和侧面视图，并设定软件方案将使用的具体旋转角度。</li>
	<li>使用医疗空气与 2% 异氟烷的混合气体（流速为 2 L/min）对小鼠进行麻醉。</li>
	<li>在采集菜单中点击 预览 按钮，打开旋转器选项卡，开始校准。为加快流程，请使用反射光模态，而非多波长或 X 射线模态。</li>
	<li>选择 装载小鼠 选项，并依次完成一系列定位菜单操作。</li>
	<li>确保可折叠鼻罩的管状端插入鼻罩凹槽中，并将小鼠以俯卧位放置，头部进入鼻罩。</li>
	<li>在 0 度位置开始校准，使动物腹侧朝下。使用旋转系统上的两个旋钮调整动物位置，使其在预览窗口中居中显示。</li>
	<li>根据提示依次重复上述操作，完成 -180、-90、+90 和 +180 度位置的校准，然后点击 完成。</li>
	<li>在主采集窗口中点击 执行方案 按钮，运行先前保存的方案。在方案执行过程中，观察状态窗口中实时更新的当前采集、曝光时长及整体方案步骤信息。</li>
	<li>使用旋转软件将单帧图像合成为视频格式。利用显示控制功能调节亮度/对比度、透明度，并设定荧光信号的显示颜色。</li>
	<li>将最终图像序列导出为 *.AVI 文件格式，用于展示。</li>
</ol>
4. 1的给药st 和 2nd 圆周化疗
<ol>
	<li>通过MARS进行腹腔内肿瘤检测后，使用标准二维定位法确定初始肿瘤负荷感兴趣区域（ROI）。该操作在成像系统配备的透明动物托盘上进行，具体步骤如下文第5节所述。确定初始ROI后，每隔三天腹腔注射一次12 mg/kg紫杉醇，共给药4次。紫杉醇购自Hospira Inc.，为含克列莫佛（cremaphor）作为载体的即用型制剂。我们先前已证实，与载体对照相比，该治疗方案对异种移植模型具有显著的抗肿瘤活性，并可完全清除可检测到的肿瘤负荷。 20然而，由于该疾病的特性，腹腔内肿瘤在治疗结束数天后复发 20.</li>
	<li>每3天使用标准二维定位成像监测治疗反应。</li>
	<li>在给予第四剂紫杉醇后，根据观察到的荧光信号，将小鼠分为完全缓解（ROI 小于 2,000）、部分缓解（较步骤 4.1 获得的初始 ROI 下降不超过 35%）、疾病稳定（较初始 ROI 增加不超过 50%）或治疗期间进展（较初始 ROI 增加超过 50%）。</li>
	<li>对于完全缓解的小鼠，每3天通过成像监测一次复发情况。一旦观察到复发（感兴趣区域与4.1步骤中初始感兴趣区域相同），则按照4.1步骤所述重新启动第二轮紫杉醇治疗。</li>
	<li>在疾病部分缓解、病情稳定或治疗后进展的小鼠中，于第4次给药后3天重新启动第二轮紫杉醇治疗th 紫杉醇剂量。同样，每三天成像一次。</li>
</ol>
5. 使用标准二维定位监测治疗反应
<ol>
	<li>使用流速为 2 L/min 的医用空气与 2% 异氟烷混合气体对需成像的小鼠进行麻醉。</li>
	<li>将麻醉后小鼠的头部置于成像腔室内的透明动物托盘中，每个小鼠分别接入独立的鼻罩（图 3）。</li>
	<li>输入预设的荧光成像参数（曝光时间 10 秒，2 × 2 binning，光圈 f-stop 2.8，视场 120 mm，激发波长 550 nm，发射波长 600 nm）和 X 射线成像参数（曝光时间 20 秒，2 × 2 binning，光圈 f-stop 2.8，视场 120 mm，35 kVp，0.4 mm 铝滤片）。</li>
	<li>点击 Expose 以顺序采集两张图像。</li>
	<li>在 Bruker MI 软件中打开图像，进行视觉检查和感兴趣区域分析。</li>
</ol>
6. 图像叠加与分析
为了对时间序列图像进行有效的视觉和定量分析，应对所有前景和背景图像采用相同的方式进行处理。
<ol>
	<li>在软件中同时打开前景图像（即 荧光图像）和背景图像，并从顶部的“窗口”菜单中选择拼接功能（图4A）。</li>
	<li>处理前景图像：在顶部工具栏中打开“图像显示”选项卡（图4A，红色箭头），并将最小值/最大值分别设置为260和5,000（图4A，蓝色箭头）。 
	注意：图像显示范围因研究而异，取决于图像中捕获的荧光信号强度。应调整对比度，使肿瘤组织可见，同时避免动物自身荧光产生的背景信号被显示出来。</li>
	<li>接下来，在左侧的导航面板中打开“自动ROI”选项卡（图4B，红色箭头），然后从菜单中选择“新建ROI集”（图4C，红色箭头）。将参数设置为使用630灰度级的阈值算法，并取消勾选“限制最大尺寸”，以确保记录所有可能的ROI（图4C）。 
	注意：阈值设置因研究而异，取决于图像中捕获的荧光信号强度。应设置阈值以定量肿瘤组织的信号，同时排除来自动物自身荧光的背景信号。</li>
	<li>在图像显示窗口中，选择“掩膜”功能。此时仅显示灰度值等于或超过630级的像素区域。</li>
	<li>要查看定量结果，请从顶部菜单栏选择“分析”选项卡，然后选择“显示”选项卡（图4D，红色箭头）。</li>
	<li>在“显示”菜单中，选中“序列号”、“总和”、“均值”和“面积”复选框，然后点击“确定”。</li>
	<li>保存图像，以便在所有荧光图像处理完成后导出数值。</li>
	<li>接下来，选中X射线图像，并再次从顶部菜单栏打开“图像显示”选项。调整最小值、最大值和伽马值，以获得小鼠骨骼的最佳可视化效果。 
	注意：由于不对X射线图像进行定量分析，因此可以针对时间序列中的每一张X射线图像单独调整（即 最小值、最大值和伽马值），以获得该数据集的最佳视觉呈现效果。</li>
	<li>再次选中X射线图像，勾选“叠加”复选框，并从下拉菜单中选择对应的荧光图像文件名（图4E）。</li>
	<li>为提取叠加后的输出结果，请从左侧的导航菜单中选择“注释”选项卡（图4B，蓝色箭头）。选择适当的选项卡以添加其他数据或文本，最后添加荧光强度标尺，以便从图像中快速判断荧光强度数据。</li>
	<li>完成注释后，选中“注释”页面上的所有对象，从顶部“编辑”菜单中选择“复制”，然后将叠加图像数据粘贴到适当的文件中（例如 Word、PowerPoint 和/或 Photoshop）用于展示。</li>
	<li>对序列中所有荧光图像与X射线图像的配对重复执行步骤6.1–6.11。关闭图像前务必保存所有文件。</li>
	<li>进行最终定量分析时，同时打开所有荧光图像，并从顶部“窗口”菜单中选择“拼接”功能。</li>
	<li>接着选择“导出所有打开的文档”以查看数据。 
	注意：若无Excel程序，请取消勾选该选项。MI将生成一个制表符分隔的文本文件（即 .txt文件），可传输至适当计算机进行进一步分析。</li>
</ol>

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</ol>

本文的出版费用部分由Bruker Corporation资助。

我们描述了一种建立腹腔内人卵巢癌动物模型的方案，该模型可模拟患者中观察到的临床特征。此外，我们介绍了使用一种动物旋转装置的方法，以克服二维成像的灵敏度局限性。综合而言，这些技术可作为发现靶向化疗耐药性复发性卵巢癌新化合物的平台。同时，该模型也可用于研究癌症复发与进展的生物学机制。
由于卵巢癌异种移植灶位于腹膜后间隙，通过物理检查小鼠几乎无法检测到早期腹腔内（i.p.）的肿瘤。大多数情况下，当肿瘤可通过触诊发现时，肿瘤负荷已相当显著，从而限制了对治疗效果的评估。使用荧光标记的细胞可使我们实时评估腹腔内肿瘤的形成情况，进而确定开始治疗的最佳时机。同样，荧光标记的异种移植模型可用于监测治疗反应。然而需要指出的是，无论使用何种报告系统，深度超过1 cm的腹腔内肿瘤通常均无法被检测到。
使用人卵巢癌干细胞14,15,17,22可生成模拟患者临床特征的异种移植模型。作为原发性疾病，该模型对紫杉醇敏感，但停止治疗后最终会发展为耐药性复发疾病。按照方案部分规定的密度通过子宫角接种细胞，通常在10天内形成卵巢肿瘤，并伴有少量腹膜种植灶，从而模拟了早期疾病状态。使用荧光标记的细胞可让我们实时评估腹腔内肿瘤的建立情况，进而确定开始治疗的最佳时机。类似地，荧光标记的异种移植模型可用于监测对治疗的反应。如果使用其他类型的癌细胞系（无论是否为卵巢癌来源），可能无法观察到该特征。例如，已有报道称，使用SKOV3细胞时，初始的腹腔内肿瘤即已具有耐药性23。然而，若用荧光等报告分子进行标记，则可对腹腔内疾病进行实时追踪。
如果使用其他荧光报告基因，务必先对对照动物（无肿瘤）进行初步成像。这有助于优化成像方案，以获得最佳的背景信号比。根据我们的经验，使用GFP采集参数成像时，裸鼠通常会产生较高的背景信号。
将细胞注入子宫时，必须确保细胞处于单细胞悬液状态，以避免在子宫内形成肿瘤。同时，应避免刮伤子宫上皮层，因为刮伤会促进癌细胞在子宫内的植入，从而导致子宫内肿瘤的形成，而非腹腔内疾病。此外，在进行数据分析时，应将伽马值（gamma value）设为1，以确保图像的强度呈线性关系，从而实现不同图像之间的有效比较。
在采集 MARS 图像期间，必须确保可塌陷鼻锥的管状末端位于鼻锥凹槽内。鼻锥作为与小鼠接触的定位点，对于获得精确校准的角度至关重要。对于较长时间的成像流程（即 超过1小时时，皮下注射100 μl无菌生理盐水，以帮助预防脱水。应通过系统输送约37°C的暖风以维持动物体温。MARS系统的局限性在于每次只能对一只动物进行成像，每只动物的总运行时间约为1小时。
综上所述，我们描述了一种动物模型的建立，该模型能够很好地模拟卵巢癌，包括原发性和复发性疾病。此模型可用于评估新型诊断或治疗方法的疗效。

动物模型是生命科学研究中不可或缺的工具。尤其是在癌症研究领域，来自动物实验的数据为启动新型诊断或治疗方法的人体试验提供了必要的信息1-3。实体瘤的动物模型通常通过皮下接种建立，因为这种方法便于测量肿瘤负荷并评估治疗效果，而无需处死动物。事实上，腹腔内（i.p.）模型需要处死动物才能检测和测量肿瘤生长的变化。然而，对于卵巢癌等腹腔内癌症，原位模型具有优势，可使其在合适的微环境中研究疾病4-6。为了使此类模型能够有效用于抗肿瘤活性的评估，必须开发非侵入性成像技术，以实现对活体小鼠腹腔内肿瘤负荷的定量分析。
在使用腹腔（i.p.）动物模型时，一个主要挑战是难以通过体格检查准确量化肿瘤负荷。准确量化腹腔肿瘤通常需要处死小鼠以进行解剖。这种方法需要使用大量动物，并在不同时间点处死。除了成本较高外，由于每只动物个体间的固有差异，还会引入较大的数据变异性。非侵入性&#160;in vivo&#160;光学成像技术为在活体小鼠中监测腹腔肿瘤负荷提供了更为合适的方法。&#160;
目前，在临床前研究中已有多种非侵入性成像方法用于监测肿瘤生长及治疗反应。这些方法包括计算机断层扫描（CT）、超声（US）、磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET）以及光学成像（如荧光和生物发光）7-12。CT 是一种结合X射线与计算机技术的透射成像过程，可生成高能光子束穿过生物体后不同速度衰减的横截面图像。US 属于反射成像，通过向体内发射高频声波，产生因组织密度不同而以不同速度反射的声波信号，计算机识别这些信号后生成可视化图像。MRI 和 PET 均为发射型成像技术，分别利用磁能和核粒子来生成图像。MRI 通过产生强磁场，诱导细胞发射自身的射频信号，进而用于图像重建；而 PET 则需要使用高灵敏度相机来检测注射后的标记物 2-氟脱氧-D-葡萄糖的放射性信号7,9,11。最后，光学成像基于对生物发光或荧光报告分子或探针所发射光信号的检测9,12。
在本报告中，我们描述了荧光成像技术的应用，该技术相较于其他成像方式具有一些优势。通过荧光成像，细胞可被基因改造以持续表达荧光蛋白，而无需添加底物或基于连接的探针——后者分别为生物发光成像和磁共振成像所必需。荧光报告系统通常还能产生更强的信号，从而可采用灵敏度较低的检测方法8,12。此外，荧光成像能够检测直径小于1 cm的肿瘤，而这一能力是CT所无法实现的7-9。最后，与生物发光不同，荧光信号的产生不依赖于有氧环境，因此在缺氧环境中信号不会受限，而缺氧环境通常存在于较大肿瘤的核心区域13。
然而，与其他技术一样，基于荧光的成像方法也存在其局限性。其中之一是仪器产生的低能量光子无法穿透到足够的深度。因此，为了尽量减少组织散射的光子数量，应对动物从不同角度进行成像。本文描述了一种在裸鼠中建立腹腔内卵巢癌模型的方案，以及一种通过旋转实现全动物成像的腹腔肿瘤监测方法。该旋转装置可将小鼠固定于特定且可重复的位置，减少光源与探测器之间常出现的组织干扰，从而优化对可能被遗漏的小肿瘤的可视化效果。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>23400-021</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>T75 细胞培养瓶</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Butler Schein</td><td>NDC 11695-6776-1</td><td></td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td>Fischer Scientific</td><td>06-669-62</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>25 号针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>合成可吸收缝线</td><td>Covidien</td><td>SL-636</td><td></td></tr><tr><td>组织粘合剂</td><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>VWR</td><td>82027-584</td><td></td></tr><tr><td>手术镊</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td></td></tr><tr><td>止血钳</td><td>VWR</td><td>82027-422</td><td></td></tr><tr><td>紫杉醇</td><td>Hospira, Inc.</td><td>NDC 61703-345-50</td><td></td></tr><tr><td>布洛芬</td><td>Walgreens</td><td></td><td>儿童布洛芬 100 (100 mg/5 ml)</td></tr><tr><td>Puralube Vet 软膏</td><td>Pharmaderm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>In vivo MS FX PRO</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MI 软件</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>裸鼠（无胸腺裸鼠）</td><td>Harlan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于非侵入性成像检测与监测卵巢癌复发的小鼠模型

Murine Model for Non-invasive Imaging to Detect and Monitor Ovarian Cancer Recurrence

上皮性卵巢癌是美国致死率最高的妇科恶性肿瘤。尽管患者最初对目前的标准治疗方案——即减瘤手术联合铂类与紫杉烷类药物的化疗——具有应答，但近90%的患者在数年内出现复发。在这些患者中，化疗耐药性疾病的出现限制了现有化疗药物的疗效，从而导致较高的死亡率。为了探索能够靶向复发性疾病的新疗法，需要建立能够紧密模拟复发性卵巢癌患者临床特征的合适动物模型。由于腹腔内（i.p.）疾病监测存在困难，限制了i.p.模型的应用，因此大多数异种移植模型均建立于皮下。我们开发了一种灵敏的光学成像平台，可实现对腹腔内肿瘤组织的检测及其解剖定位。该平台采用从可见光到近红外波段的光学报告系统，结合二维X射线共定位技术，可提供分子信号的解剖位置信息。通过使用一种旋转系统，使动物处于多个角度位置进行360度成像，显著提高了检测灵敏度，能够识别在单一角度下不可见的肿瘤。该平台为无创监测肿瘤生长以及评估预防或治疗复发性卵巢癌新疗法的疗效提供了独特的模型。

非侵入性活体成像技术可实现对同一只小鼠腹腔内肿瘤进展过程的动态监测。采用所述方案将标记mCherry的F2卵巢癌细胞注入子宫内，可在第5天观察到明显的腹腔内肿瘤，第32天出现癌腹膜转移（图5）。图6展示了活体成像结果与小鼠处死后所观察到的癌腹膜转移之间的一致性。
使用MARS成像可检测到腹膜内肿瘤，而仅从单一平面获取图像时可能遗漏这些肿瘤。 图7 （上图）显示，即使在肿瘤负荷明显的对照组小鼠中，肿瘤大小也可能因图像拍摄角度不同而被低估。在实验结束时，确保不遗漏或低估肿瘤质量显得尤为重要st 完全缓解、部分缓解或无缓解的动物被分别归类时的化疗周期图 7 中图所示）。类似地，在维持治疗期间，检测极微小的复发性肿瘤至关重要，以便准确确定复发时间，从而界定无进展生存期（图 7 中图面板）。
通过旋转动物可优化对肿瘤负荷的定量评估。将动物旋转至特定角度，可最大限度减少激发光和发射光穿透的深度，从而最准确地捕获来自荧光的光子信号，该信号反映了肿瘤细胞的数量，进而反映肿瘤负荷。因此，根据动物在旋转序列中的位置，可针对特定肿瘤实现最佳的定量效果。
在展示旋转数据集的图像时，必须为图像设定合适的最小/最大对比度范围，以有效显示所有肿瘤组织，同时能够清晰分辨各个独立的肿瘤组织。本研究中，理想的对比度范围为最小50计数、最大1,200计数。这些数值可为其他研究提供参考，但最佳对比度范围会因肿瘤负荷水平、细胞中荧光肽表达水平、成像系统配置及采集参数的不同而有所差异。
<img alt="细胞活力检测；显微镜图像；荧光分析；细胞计数比较。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51815/51815fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：F2卵巢癌细胞稳定表达mCherry荧光。（A）相差图像；（B）荧光图像；（C）A与B的叠加图像。请注意，100%的细胞均表达该荧光报告基因。
<img alt="实验设置中啮齿动物腹部的手术操作；六步法示意图。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51815/51815fig2highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2： 卵巢癌细胞的子宫内注射。（A）通过鼻罩持续给予麻醉；（B–E）切开皮肤以定位并夹闭子宫角；（F）将癌细胞缓慢注入子宫腔内。
<img alt="电隔离孵育装置；幼鼠实验；多个孵育腔室示意图。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51815/51815fig3highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3：（A）成像室内配备透明动物托盘，该托盘具有温度控制和闭路通风功能，用于二维成像；（B、C）托盘配有鼻罩以输送麻醉气体，最多可容纳五只小鼠。
<img alt="体内成像分析工作流程；软件界面；荧光定量示意图。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51815/51815fig4highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4： 来自分析软件的代表性窗口界面，用于辅助数据分析。请参见正文中的说明。
<img alt="长期肿瘤生长成像；小鼠在32天内的生物发光扫描中被捕获。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51815/51815fig5highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5： 在长期成像序列中检测到 mCherry 荧光与 X 射线共定位。对3只腹腔接种肿瘤的小鼠进行时间追踪，以评估腹腔肿瘤的进展。需注意，肿瘤进展可能存在差异。该图展示了3只小鼠的代表性图像，其肿瘤进展速率不同，因此在不同时间点的肿瘤负荷也有所变化。
<img alt="小鼠成像、荧光标记、分析、生物研究流程、解剖结果。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51815/51815fig6highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6：腹腔内肿瘤负荷（上图）与荧光/X射线叠加图像（下图）之间的相关性。在注射F2-mCherry卵巢癌细胞约32天后，进行二维成像，随后处死小鼠，以将实际肿瘤负荷与所获得的图像进行对照。红色箭头指示肿瘤负荷位置。
<img alt="小鼠肿瘤成像；紫杉醇治疗效果；生物发光检测；科学结果。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51815/51815fig7highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 7"> 
图 7： 旋转数据集实现了多角度成像，可用于检测对照组（上图）、紫杉醇治疗组（中图）和复发组小鼠（下图）中的肿瘤。该图展示了每组中一只小鼠在MARS系统中旋转时的成像情况。需要注意的是，即使在肿瘤负荷显著的对照组小鼠中，肿瘤大小也可能因成像角度不同而被低估。

我们描述了一种非侵入性动物成像平台，可用于检测、定量和监测卵巢癌的生长及复发。这种腹腔内异种移植模型模拟了卵巢癌患者的临床特征。

上皮性卵巢癌是美国致死率最高的妇科恶性肿瘤。尽管患者对目前的标准治疗方案最初有反应，但……

本实验的总体目标是建立一种模拟卵巢癌患者临床特征的腹腔内卵巢癌异种移植模型。该模型通过将表达mCherry荧光标记的卵巢癌干细胞经子宫内注射至裸鼠体内来实现。随后，通过检测荧光强度作为肿瘤负荷的替代指标，评估肿瘤的形成、进展及对治疗的反应。这使得无需处死小鼠即可实时监测肿瘤进展或对治疗的反应。我们在此展示的模型B重现了卵巢癌患者中观察到的临床特征，因此不仅有助于我们研究该疾病的生物学机制，还能用于发现新的治疗方法，特别是针对复发性卵巢癌的治疗策略。该模型可让我们监测肿瘤的进展，以实时确定其对化疗的反应，同时还能判断若停止化疗，疾病是否会复发。开始此操作时，使用 2% 异氟烷麻醉一只 7 至 8 周龄的裸鼠（无胸腺裸鼠）。随后通过轻捏其足垫确认小鼠已完全麻醉。接下来，将动物置于其右侧，身下垫无菌纱布垫，头部朝向远离实验操作者的方向。在麻醉后，为双眼涂抹眼膏以防止角膜干燥。迅速将动物头部插入与异氟烷挥发器相连的鼻罩系统中。使用酒精棉片对小鼠腹部右侧进行消毒，随后使用碘伏。然后用无菌手术剪和无菌镊子将无菌手术巾覆盖于该区域。在小鼠左下腹象限做一至二厘米的皮肤切口。随后，提起肌肉并做切口以到达腹膜。接着解剖斜肌以暴露腹腔。然后使用无菌止血钳夹住左侧子宫角，分别夹住该子宫角的前侧和后侧。将前部钳夹置于输卵管正下方，后部钳夹置于宫颈正上方。此时，由第二位实验人员操作。将含有细胞的针头以与角成45度角的方向垂直插入，注射细胞悬液。然后缓慢将50微升细胞悬液注入子宫角管腔内。接着，先松开前部夹钳，再松开后部夹钳。之后，将子宫角放回腹腔内。使用合成可吸收缝线缝合腹膜。然后使用组织粘合剂闭合皮肤。操作完成后，将小鼠从鼻罩中取出，并放回其笼中。在离开动物无人看管之前，确保其已清醒并处于活跃状态。术后前48小时在饮水中提供布洛芬。现在打开分子成像软件，然后打开Mars Capture软件。该模块在利用成像系统的采集与分析功能的同时，对火星成像参数进行协调控制。接下来，输入预设的采集参数值，随后将这些参数保存为独立的会话文件。然后，通过点击系统界面采集窗口中的“创建编辑协议”按钮，创建一个旋转序列协议，选择之前保存的荧光会话文件，并将其保存为第一步。接下来，选择对应的X射线会话文件，并将其保存为第二步。在选中第一步的情况下。使用图像采集前弹出菜单中的“设定旋转序列”来设置所需的起始角度范围和增量。为确保特征的无缝可视化，具体参数包括：起始角度为负180度，范围为375度，增量为15度。保存协议后，单击“完成”按钮以初始化Mars系统。然后，在采集菜单中选择预览按钮以打开旋转器选项卡，使用为 M cherry 成像指定的荧光捕获设置。在预览期间保持门打开以加快定位速度，同时也可在校准过程中对小鼠的定位进行目视检查。接下来，选择加载小鼠选项，并依次完成一系列定位菜单操作。确保可折叠鼻锥的管状端位于鼻锥凹槽内。然后将麻醉后的小鼠呈俯卧位放置，头部置于鼻锥中。从零度位置开始校准，使动物的腹面朝下。使用旋转系统上的两个旋钮来调整动物的位置，使其在预览窗口中居中显示。根据提示，依次重复操作：-180°、-90°、+90° 和 +180° 位置，然后点击完成。以下是由采集图像生成的示例视频。该图显示了腹腔内肿瘤负荷与荧光X射线叠加图像之间的相关性。在注射F2M樱桃卵巢癌细胞约32天后，对小鼠进行二维成像，随后处死小鼠，以将获得的图像与实际的肿瘤负荷进行比对。此处展示的是旋转数据集，可实现多角度成像，并用于检测对照组、紫杉醇治疗组以及复发组小鼠中的肿瘤。图中显示了使用Mars系统旋转单只小鼠的成像效果。请注意，即使在肿瘤负荷显著的对照小鼠中，肿瘤大小也可能因成像角度不同而被低估。观看本视频后，您应能够通过子宫内途径建立腹膜内卵巢癌异种移植模型，并能够使用多模态旋转系统进行活体动物成像。

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