解剖，成像和药物治疗： 果蝇蛹睾丸和单身男性生殖系囊肿的体外培养

该程序的总体目标是准备果蝇、瞳孔睾丸和种系囊肿的离体培养物，以进行实时成像研究和抑制剂治疗以分析有瞳裂后肌生成，这是通过在纯形成后 24 小时首先从早期 puy 解剖完整睾丸来完成的。第二步是从这些睾丸中解剖单个种系囊肿，然后完整的睾丸和单个种系囊肿可用于实时成像实验。或者，下一步是将完整的睾丸或种系囊肿与抑制剂化合物一起孵育。

最终，使用南瓜、睾丸的免疫染色和荧光显微镜来监测治疗效果。与现有遗传方法相比，这种离体培养技术的主要优点是它允许在有瞳后阶段获得 dilo 精子发生。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为需要一些经验来解剖和处理瞳孔组织。

为了开始实验，将 80 微升防护罩和 San M 三种昆虫培养基与胎牛血清和抗生素分配到 10 厘米的培养皿中。接下来，使用一把宽镊子，挑选一个蛹并将其转移到培养皿上的一滴培养基中。然后将材料转移到配备有光纤照明器的立体显微镜中。

在解剖过程中，注意不要使用五号镊子将睾丸加热到室温以上。抓住蛹的最后端并将其固定到位。用另一对镊子抓住前球形，并在其前端烫发打开瞳孔。

剥去瞳孔盒，直到至少部分胸部暴露出来。继续将蛹的最后端固定到位，并通过将一对镊子的双臂插入蛹的头部区域来释放蛹的内部压力。接下来，通过打开镊子并向前移动镊子将蛹撕开，并确保第一次尝试时开口尽可能大。

避免在压力释放之前损坏蛹的后端。因为这可能会导致睾丸直接被推过小开口并损坏。一旦蛹被打开，蛹释放的内部压力就会通过大开口压出脂肪体细胞和组织的球囊。

然后使用一对镊子增加开口的大小，避免用镊子挤压蛹，因为这可能会损坏睾丸。接下来，将蛹的最后端合上。另一对镊子从后到前轻轻划出蛹的内容物，以将睾丸从蛹中释放出来。

检查瞳孔睾丸是否被推出。它们不会连接到任何其他组织。在 24 小时时，A PF 使用预先切割的 200 微升移液器吸头收集睾丸。

仅转移少量培养基以减少睾丸携带的脂肪体细胞数量。然后将睾丸放入新鲜培养皿中的培养基中。用培养基洗涤睾丸数次，直到只剩下少量脂肪体细胞进行实时成像。

将睾丸转移到装有培养基的玻璃底培养皿中，并使用倒置成像显微镜开始解剖。将一个或多个瞳孔睾丸转移到装满培养基的玻璃底培养皿中。使用带有光纤照明和两根不锈钢针的立体显微镜来解剖雄性种系囊肿。

小心地固定一根针，将一个睾丸固定在其前端或后端并将其固定到位。将另一根针插入睾丸，并通过将针头向侧面移动来破坏睾丸鞘，这将释放许多囊肿。继续用一根针将睾丸固定到位。

然后用另一根针轻轻地从睾丸中划出剩余的囊肿。接下来分离聚集的囊肿。使用 200 微升移液器吸头，将囊肿转移到含有培养基的新鲜培养皿中。

然后将培养皿移至倒置成像显微镜中，对单个囊肿进行实时成像。必要时再次用针头分散囊肿，使用相差和荧光显微镜确定囊肿的阶段。专注于所需阶段的囊肿。

经常确认囊肿的焦点和位置。在较长的成像实验中，囊肿不会粘附在培养皿的底部。打算漂浮在焦点之外。

用 500 μL 培养基填充 24 孔细胞培养板的每个孔，进行一次 12 次重复的实验。然后使用预先切割的 200 微升移液器吸头将一个瞳孔睾丸转移到每个孔中。接下来使用倒置荧光显微镜检查分离的睾丸中是否存在鱼精蛋白。

睾丸应不含鱼精蛋白、B-E-G-F-P 信号，这表明组蛋白到鱼精蛋白或 HP 的转换未在任何囊肿中发生。更换已经显示阳性囊肿的睾丸。向前 12 个孔中的每一个孔中加入 500 微升含有内卡酸（抑制化合物）的培养基，以达到 1 毫升 150 微摩尔的最终浓度。

通过添加 500 μL 含溶剂的培养基，将剩余的孔用作未处理的对照。然后将板在 5 摄氏度下避光孵育 24 小时。再次检查孵育的睾丸中是否存在鱼精蛋白。

对照睾丸现在应显示一个或多个鱼精蛋白 B-E-G-F-P 阳性囊肿，这表明通过 HP 开关的转变。接下来，使用带有 200 微升吸头的移液器，将睾丸转移到聚 L 赖氨酸涂层载玻片上。进行南瓜制备并用荧光抗体染色。

根据已发布的方案，使用这种解剖方法获得果蝇睾丸的相差图像。这是一个略微压扁的果蝇蛹的整个坐骑睾丸。在 PY 形成后 24 小时或 PF 精原细胞仅限于枢纽区域下方的前尖端。

剩余的睾丸充满精母细胞，在 Nevin 电流阶段具有圆形细胞和精子细胞，在伸长阶段具有相差不断增长的鞭毛覆盖，获得来自家庭安装瞳孔睾丸的 EGFP 和 RFP 荧光图像，以检测 H 2 A-V-D-R-F-P 和鱼精蛋白 B-E-G-F-P 在 24 小时 A PF。没有一个精子细胞经常进行 HP 切换。在这个阶段解剖的睾丸包含自发荧光结构。瞳孔睾丸解剖 36 小时 PF 显示第一个鱼精蛋白，B-E-G-F-P 阳性囊肿。

瞳孔睾丸 48 小时 A PF 有几个种系囊肿，细胞核可见鱼精蛋白阳性。可以记录在培养物中发育的整个睾丸的延时离体实时图像。使用这种方法，解剖 A 瞳孔睾丸 45 小时 A PF，在培养基中孵育 6 小时，每 5 分钟成像一次。

在此时间范围内，几个精子细胞囊肿从 HP 切换阶段出现，并显示明亮的鱼精蛋白 B-E-G-F-P 信号。观看此视频后，您应该对如何在培养中获得早期瞳孔睾丸和单个种系囊肿有很好的了解，以便进行体内成像或抑制剂治疗。