通过庆大霉素诱导损伤实现成年斑马鱼的肾脏再生

以下实验的总体目标是利用成年斑马鱼研究肾脏再生。通过将肾毒素庆大霉素注入鱼的腹腔，诱发急性损伤反应，从而实现这一目标。随后，将鱼分别置于独立的水族箱中过夜，以进行观察。

在此期间，由于受损的肾单位上皮细胞脱落并聚集在肾小管和输尿管的管腔中，从而形成管型。可根据次日管型的形成情况鉴定受伤的鱼类，并可用于进一步研究肾脏再生的实验。当我们注意到受伤鱼类会排出管型（这是人类肾脏损伤的已知指标）时，首次提出了该方法的想法。

与现有的庆大霉素注射方法相比，该技术的主要优势在于听觉囊泡（CAS）的形成可作为损伤的直观视觉指标。在饲养6至12月龄的成年斑马鱼，并按照文本方案配制庆大霉素和三卡水后，使用塑料移液管制作一个鱼捞：将移液管的吸头部分剪成勺状，并在底部剪出两个槽口以排水。然后用配制好的庆大霉素溶液装填1毫升注射器，并分别卸下30½号针头。接着排除所有气泡，将针头拧紧在注射器上，确保针尖朝外，注射器刻度朝前且便于读取。

准备若干带盖的透明小容器（每容器半升），用于注射后过夜观察鱼类，以及观察鱼类脱落的白色上皮管型。每个容器中加入足量的养鱼用水，确保鱼只能在其中自由游动。根据文本方案将鱼麻醉后，使用鱼勺从鱼头向鱼尾方向轻轻舀取，以避免损伤鳃部或鳍。将鱼舀出后，轻柔地侧向倒在纸巾上，吸去多余水分，并轻轻抖掉鱼勺上残留的水分。

接着，再次用铲子捞起鱼，将其放入已归零的天平上的小船中，称量鱼的重量，精确至最接近的 0.25 克，并计算出应注射的庆大霉素剂量。再次用铲子捞起鱼，将其放置在一张折叠干燥的纸巾上。若进行注射，用右手持注射器，左手握住纸巾，使鱼头朝左，腹部朝上。

易于操作。如果难以固定鱼体，可将肘部紧贴躯干以稳定手臂。接着，用一只手握住注射器，使针头与肛门前方腹部皮肤呈45度角。

将针头轻轻刺入皮下，然后降低角度，使针头在皮下向前滑动，避免刺入内脏器官。根据需要推动针栓至适当位置，并暂停片刻，确保针头周围无液体渗出。在拔出针头前，将鱼放入单独的容器中，确保其从麻醉状态中恢复。

将鱼在 28.5 摄氏度下过夜。注射后的第二天，将注射过的鱼连同其容器放置在深色表面上。受伤鱼排出的白色死亡上皮组织碎片应可见，将该鱼分离出来，并继续检查其他鱼。

若注射了适当剂量的庆大霉素，80%至90%的注射鱼类应产生囊肿。若未产生囊肿，可能是由于鱼类未因庆大霉素注射而受损，或受损严重，导致输尿管完全阻塞以及钙化组织与软组织结合。每500毫升养鱼用水中，每个处理组饲养的鱼类不得超过六条，并应尽可能每天换水，以保持水质清洁。

损伤后第三天。开始每天一次少量喂食鱼类。根据此处所述文本方案分析受损肾脏，使用不同剂量的庆大霉素诱导成年野生型AB zebrafish肾损伤，并通过观察水中肾上皮管型的存在在视觉上确认损伤效果。

损伤后一天。低剂量庆大霉素导致大多数鱼无管型，而较高剂量则导致超过75%的鱼出现管型，如此处所示。不同剂量的庆大霉素导致再生肾脏中LHX1阳性细胞聚集体的数量逐渐增加。

在本实验中，使用每千克80毫克的庆大霉素造成损伤后，产生管型的鱼类被分为两组。其中一组每天接受16小时37摄氏度的热激处理，随后在28.5摄氏度下休息。如图所示，单独的热激处理不会诱导损伤反应，这可通过LHX1阳性聚集体的密度观察到。

然而，此示例表明，与未进行热激的对照组相比，热激处理使受伤鱼类在损伤后七天内的反应加快，但在损伤后的各组之间已不再存在显著差异。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何使用肾毒素基因对成年斑马鱼进行损伤，并通过观察CAS结构的形成来直观判断其损伤程度，从而研究肾脏再生过程。在遵循该操作步骤的基础上，还可采用其他方法，如添加信号通路的激活剂或抑制剂，以确定哪些信号参与了再生反应。