基因缺失在通过CRISPR / Cas9哺乳动物细胞系生成

该程序的总体目标是使用 CRISPR Cas 九核酸酶系统来创建基因组缺失。首先电尿酸盐，将两个 CRISPR 质粒和 A GFP 报告质粒同时进入细胞。然后使用荧光激活细胞分选，分离前 3% 的 GFP 表达细胞。

接下来，以有限稀释度对分选的细胞进行铺板，并使用常规 PCR 筛选生物等位基因缺失克隆。最终，CRISPR Cas 9 可用于通过产生功能缺失等位基因的缺失来研究基因和遗传元件。与单个向导 RNA 产生的移码突变相比，CRISPR Cas 9 核酸酶系统产生的大缺失有助于确保功能突变的丧失。这种方法还允许通过常规 PCR 轻松、廉价地进行筛查。

当我们发现筛选由单个向导 RNA 产生的小插入缺失在技术上具有挑战性、费力且昂贵的缺失等位基因对于非包被遗传元件的研究也特别有用时，我们首先有了这种方法的想法。对于每个 CRISPR 对沉淀，将悬浮液中生长的 6 个细胞的 2 倍乘以 10。将细胞重悬于 100 μL 电穿孔溶液中，然后转移到电穿孔 QAT 中。

加入 5 微克 CRISPR Cas 9 构建体 SG RNAA，加入 5 微克 CRISPR Cas 9。构建 SG、a、B 和 0.5 μg GFP 表达构建体，轻轻上下移液数次以混合。尽量避免使用电穿孔系统产生气泡。

用无菌移液管在 2 mm 的 vete 中用 250 伏特电纯化细胞 5 毫秒，立即将溶液转移到 1 毫升预热培养基中。将细胞在 30 摄氏度下孵育 24 至 72 小时。将细胞通过无菌 50 微米过滤器进入传真管。

然后对前 3% 的 GFP 阳性细胞进行传真分选，以富集接受高水平质粒的细胞。在优化目标细胞的有限稀释条件后，将细胞分选到 96 孔板中，每板稀释 30 个细胞，每孔 100 μL 细胞培养基。对于剩余的分选散装细胞，冷冻一半的细胞以备将来接种。

将另一半铺板用于筛选和引物验证。将这些散装细胞在 37 摄氏度下孵育 3 到 7 天。让克隆在 37 摄氏度下孵育 7 到 14 天，具体取决于细胞系的倍增时间。

用于分离基因组 DNA Resus，将亲本和大量细胞沉淀悬浮在 50 μL DNA 提取溶液中。在热循环仪中运行样品以提取基因组 DNA。然后测量 DNA 浓度。

现在通过混合 10 μL 两种 XPCR 混合物来组装 20 μL PCR 反应。0.5 μL 10 微摩尔正向引物 0.5 μL 10 微摩尔反向引物、50 至 100 ng 基因组 DNA 和高达 20 μL 的水。在单独的反应中对非缺失条带和缺失条带进行 PCR。

接下来，将样品放入热循环仪中，在 A 跪下温度为 60 摄氏度的情况下运行 35 次循环，如随附的书面方案中所述。使用一种 XTAE 缓冲液以每厘米 10 伏特的速度在 2%aros 凝胶上分离样品。然后检查样品是否存在非缺失和缺失条带。

考虑在单个反应中对缺失和非缺失 PCR 引物对进行多重检测的策略。或者，您可以分别进行缺失和非缺失 PCR 反应。对于悬浮细胞，将所有克隆转移到单个 96 孔板中，该板每孔已包含 50 μL 细胞培养基。

然后将 50 μL 从每个孔转移到 96 孔 PCR 板中。或者，对于贴壁细胞、胰蛋白酶、眼睛、克隆，在转移到单个 96 孔板之前。然后从每个孔中转移 50 μL 到 96 孔 PCR 板中，以 400 倍 G 离心 PCR 板 5 分钟，并在水槽上轻弹 PCR 板以去除上清液。

现在每孔加入 50 微升 DNA 提取溶液，并在基因组 DNA 提取运行 PCR 反应后重悬细胞沉淀，以检测克隆中的非缺失和缺失条带。在 2%aros 凝胶上以每厘米 10 伏特的速度分离 PCR 产物。使用一种 XTAE 缓冲液。

鉴定具有所需缺失的克隆，并在更大的板或培养瓶中扩增培养物。在示例中，从左到右观察亲本细胞、三个非缺失克隆、三个单等位基因缺失克隆和三个双等位基因缺失克隆。使用多个不重叠的 SG r NNA 对可能有助于控制脱靶效应。

每对都会导致产生唯一的缺失。靶向基因不同位置的 SG 对的断点可用于删除整个基因体以产生移码插入缺失，即使一个或两个等位基因未被删除或允许破坏特定亚型。在这个实验中。

关于整个基因的缺失，设计了 PIM 一两个 SG RNA 对，克隆到 PX 3 3 0 表达载体中，并通过电穿孔递送到 MEL 细胞。与 GFP 报告基因一起，将前 3% 的 GFP 阳性细胞克隆接种在限制缺失处，并通过 PCR 筛选该 PIM one 缺失的非缺失单等位基因和生物等位基因缺失克隆。选择生物等位基因缺失克隆，在扩增 5 天后进一步增殖。

通过基因组 DNA 的 PCR 重新检测每个克隆，以确认 BIC 缺失和缺失。对扩增子进行 Sanger 测序以鉴定精确缺失。从 BIC 缺失克隆中分离 RNA，并通过 R-T-Q-P-C-R 分析以确认 PIM one 表达的缺失。

一旦掌握，该技术可以在几周内完成，以识别重要缺失克隆。看完这个视频，您应该对如何使用 CRISPR CAS 九核酸酶系统通过孔化 CRISPR 质粒、分选 GFP 亮细胞以及通过常规 PCR 筛选单个克隆来产生基因组缺失 BioE 缺失克隆。