跨膜蛋白的重组，电压门控离子通道，KvAP，进入巨人单层囊的显微镜和膜片钳研究

以下实验的总体目标是将电压门控离子通道掺入巨大的单层囊泡中，并通过膜片钳测量表征它们的活性。这是通过首先部分脱水来实现的，这是一种含有离子通道 KVAP 的小囊泡溶液，用于形成脂质蛋白膜。接下来，脂质膜再水化，导致细胞大小的巨型 ALR 囊泡或包含通道的 GVS 的形成和生长。

然后将 GVS 转移到我们的记录室中，并用膜片移液管切除一块 GUV 膜以测量离子电流。结果表明，根据对电流记录的分析，GUV 膜中的离子通道响应膜电压的变化而激活。巨型单侧物理学可以帮助回答生物物理学领域与膜蛋白相互作用相关的关键问题。

例如，跨膜蛋白与脂质膜的物理性质的相互作用。虽然这种方法可以深入了解电压门控铁通道 KVAP 的功能，但它也可以应用于其他铁通道、转运蛋白和泵，以及一般的跨膜蛋白。这种方法的视觉演示至关重要，因为涉及纵巨大囊泡的步骤是。

如何只阅读文章 准备含有 KVAP 的溶液和小 unal 囊泡后。根据文本协议，首先将电线插入孔中，然后旋转和擦拭电线，以确保它们在氮气或空气流下清洁、晒干和干燥，从而准备电形成室。如文本方案中所述，在 SUV 缓冲液中制备 30 微升每毫升 3 毫克 SUV 悬浮液，剧烈混合溶液以沉积 SUV 溶液。

使用 2 微升移液管或 5 微升玻璃注射器将 SUV 溶液的小液滴滴放在导线上。确保液滴足够小，并且间隔足够远，以免它们接触或融合。让存放的 SUV 在露天干燥约 30 分钟。

当液滴沉淀后，旋转金属丝，以便更容易用显微镜观察脂质沉积物。接下来，使用注射器将真空润滑脂涂抹在三个孔周围的腔室底部，然后轻轻按压 40 毫米 x 22 毫米的盖玻片以密封腔室底部，使其粘附而没有间隙。然后使用天花板糊密封腔室的侧面，并在腔室顶部涂抹真空润滑脂，勾勒出三个孔的轮廓。

缓慢添加生长缓冲液，直到每个孔都填充到顶部。避免溶液在孔中快速移动，因为这可能会。从电极上剥离脂质膜。

将顶盖滑块轻轻按压到润滑脂上，关闭腔室。注意不要使底盖滑落。使用两个鳄鱼夹将信号发生器连接到电线。

根据所用缓冲液的盐浓度设置频率，并使用万用表测量并调整导线两端的电压。此外，根据您的缓冲区，使用铝箔覆盖腔室以保护 flora fours 免受光线照射。让 G UUV 在低盐缓冲液中生长 2 到 3 小时，在高盐缓冲液中生长 12 小时或过夜。

孵育后，断开腔室与发生器的连接，并小心地将其放在倒置显微镜上。要评估 GUV 生长血浆，请清洁盖玻片一分钟，以便 ARO 溶液在其上很好地涂抹。在清洁盖玻片后 15 分钟内，涂抹 200 微升根据文本方案制备的温热 aro 溶液，使其润湿整个表面。

垂直倾斜载玻片并触摸纸巾上的下边缘以去除多余的液体，在载玻片上留下一层薄而光滑的 aros。将玻片放在 60 摄氏度的热板或烤箱上，晾干至少 30 分钟。接下来，将 AROS 涂层的盖玻片放入标准的 3.5 厘米培养皿中。

然后在制备 SUV 溶液后，将约 15 微升分约 30 滴轻轻涂抹在 aros 表面上。注意不要将 aros 图层扭曲太多。将玻片置于温和的氮气流下约 10 至 15 分钟，然后用肉眼观察缓冲液蒸发。

由于 SUV 干燥后液滴立即干燥，因此添加约 1 毫升生长缓冲液以覆盖载玻片表面。让肿胀持续约 30 分钟，然后使用具有相差或 DIC 的倒置显微镜 为了检查生长室中 GU UUV 的生长，以通过添加每毫升 5 毫克的 β Caine 溶液来阻止 Gus 粘附， 扩散和破裂。孵育 5 分钟并冲洗，插入接地电极，并使用观察缓冲液填充腔室。

接下来，将 G UUV 转移到电铸 GU UUV 的观察室。轻轻取下顶盖衬片，打开生长室。将移液器吸头直接放在每根导线的正上方，并分离 GU UUV，缓慢吸出约 10 微升，同时沿导线移动移液器吸头，以进行凝胶辅助溶胀 GU UUV。

首先轻敲培养皿的侧面几次，将 GU UUV 从盖玻片表面分离。将移液器吸头放在盖玻片的正上方并吸出 10 微升，同时将吸头拉回表面，将收获的 GVS 直接转移到观察室中。等待几分钟，让 Gus 沉降到底部以膜片钳 GVS。

使用观察缓冲液填充新的补片移液管并将其安装在膜片钳头载物台上。搜索腔室以找到无缺陷的 GUV 并检查它是否含有荧光蛋白。施加超过 100 帕斯卡的恒定正压，以保持补片移液器内部清洁，并将补片移液器插入腔室。

将贴片移液器置于视野中，并应用测试脉冲来测量或补偿移液器电压偏移和电阻。然后在荧光灯下检查移液器，确认吸头干净。将补液管朝向 GUV，如有必要，同时降低正压，以便从补液管向外流动不会使 GUV 跑掉。

当膜片移液管靠近 GUV 时，施加负压以将 GUV 拉向膜片移液管。当 GUV 膜的舌头进入膜片移液器并形成千兆密封时，监测阻力。当从 GUV 中切除由内而外的膜贴片并且千兆密封稳定时，关闭测试脉冲并应用文中所述的电压协议。

该图显示了无缺陷 GUV 的 DIC 和 Epi 荧光图像。GUV 膜中均匀的蛋白质荧光证实 KVAP 掺入 GUV 中，而不是留在脂质膜中，并且没有形成聚集体，使用这三种方法产生的 Gus 在这里可以看到。荧光脂质和蛋白质信号已缩放到相同的平均密度，因此具有低或高蛋白质密度的 g UUV 在叠加图像中具有洋红色或绿色阴影，而具有平均蛋白质密度的 GVS 为白色。

确定了孤立的无缺陷 G UUV，GUV 尺寸分布如图所示。通常，电形成比凝胶辅助溶胀产生更多的无缺陷 G UUV，但电形成产生的 GUS 更小。此处显示的是从 GUV 荧光推断的蛋白质密度分布。

用高盐缓冲液进行电形成可产生具有不同蛋白质密度的 GU UUV。使用低盐缓冲液进行电形成的密度变化要小得多，并且凝胶辅助溶胀产生的 GU UUV 的蛋白质密度非常均匀，具体取决于切除贴片中的蛋白质浓度。当前迹线显示单个通道或通道集合。

KVAP 显示电压相关开路。在尝试此程序时，重要的是要记住脆弱物体的巨大囊泡，这些囊泡不能抵抗纯粹和渗透压。按照这个程序，可以执行诸如拉动脂质纳米管之类的方法，以回答其他问题，例如蛋白质的曲率感应。

看完这个视频后，您应该对如何生产含有功能重组蛋白的 GVS 有了很好的了解。