Name: 跨膜蛋白的重组，电压门控离子通道，KvAP，进入巨人单层囊的显微镜和膜片钳研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学习将电压门控离子通道KvAP重组到巨型单层囊泡中的方法，利用脱水-再水化技术制备GUVs，并通过膜片钳技术测量离子电流以分析通道活性。该技术有助于深入理解膜蛋白功能。

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我们感谢 Susanne Fenz 讨论了通过琼脂糖溶胀法重建蛋白质的可能性，感谢 Feng Ching Tsai 进行电流测量，以及 Bassereau 课题组现任和前任成员提供的支持与帮助。本项目由法国国家科研署（项目编号 BLAN-0057-01）、欧洲委员会（NoE SoftComp 项目）、巴黎第六大学（FED21“复杂系统动力学”项目资助）提供经费支持。M.G. 获得了居里研究所国际博士奖学金的支持，S.A. 获得了法国医学研究基金会奖学金的支持，G.E.S.T. 获得了欧洲委员会玛丽·居里引进国际奖学金以及巴黎第六大学资助项目的支持。出版费用由“CelTisPhyBio”实验室卓越计划（ANR-11-LABX0038）承担。

1. 溶液配制
<ol>
	<li>配制5 ml含有5 mM KCl、1 mM HEPES（pH 7.4）或TRIS（pH 7.5）以及2 mM海藻糖的“SUV缓冲液”。使用0.2 µm注射器滤器过滤该缓冲液，并分装为1 ml等份，可于-20 °C保存。 
	注意：试剂和仪器的更多详细信息见材料清单。</li>
	<li>配制40 ml GUV“生长缓冲液”，用于在脂质膜再水化过程中填充GUV内部。对于“低盐”生长条件，将5 mM KCl、1 mM HEPES（pH 7.4）或1 mM TRIS（pH 7.5）以及约400 mM蔗糖混合；对于“生理盐浓度”生长条件，将100 mM KCl、5 mM HEPES（pH 7.4）或5 mM TRIS（pH 7.5）以及约200 mM蔗糖混合。</li>
	<li>通过混合100 mM KCl、5 mM HEPES（pH 7.4）或5 mM TRIS（pH 7.5）以及约200 mM葡萄糖，配制40 ml用于实验腔室外部溶液的“观察缓冲液”。 
	注意：这些缓冲液仅为示例。请参见讨论部分以调整适用于其他实验的缓冲液。</li>
	<li>使用渗透压计测量生长缓冲液和观察缓冲液的渗透压。加入蔗糖或葡萄糖颗粒，使两者的渗透压差异控制在1%以内，以防止GUV从生长腔室转移至观察腔室时发生破裂或塌陷。 
	注意：在此浓度范围内，每添加1 mM蔗糖（40 ml中加入13.7 mg）或葡萄糖（40 ml中加入7.2 mg），渗透压约增加1 mOsm。</li>
	<li>使用0.2 µm滤器过滤生长缓冲液和观察缓冲液，并在4 °C下储存以抑制细菌生长。</li>
	<li>将50 mg β-酪蛋白溶解于10 ml 20 mM TRIS（pH 7.5）缓冲液中，制成5 mg/ml的β-酪蛋白溶液，用于钝化实验腔室表面，防止GUV粘附、铺展和破裂。待β-酪蛋白完全溶解后（可在4 °C下持续数小时），经0.2 µm滤器过滤，分装为0.5 ml等份，可快速冷冻并在-20 °C长期保存（解冻后的等份样品在4 °C下通常可使用长达1周）。</li>
</ol>
2. SUV 的制备
<ol>
	<li>按照先前发表的详细方案制备并分装冷冻蛋白脂质体（proteo-SUVs）28使用Alexa-488马来酰亚胺荧光标记的KvAP，按蛋白质与脂质质量比1:10的比例重组到DPhPC SUVs（10 mg/ml）中。 
	注意：野生型 KvAP 每个单体含有一个半胱氨酸，位于胞内 C 末端附近（氨基酸 247）。</li>
	<li>荧光标记的纯脂质SUV： 
	注意：在通风橱内操作氯仿，佩戴腈类手套和护目镜。避免使用任何塑料制品，因为氯仿可溶解塑料。氯仿溶液应储存在带有聚四氟乙烯（Teflon）盖的棕色玻璃小瓶中，并使用玻璃注射器进行转移。在移取脂质前后，务必用氯仿至少冲洗玻璃器皿5至10次。
	<ol>
		<li>在1.5 ml棕色玻璃小瓶中，将100 µl DPhPC溶液（10 mg/ml，氯仿中）与8.2 µl Texas Red-DHPE溶液（1 mg/ml，甲醇中）混合，制备含0.5 mol%红色荧光脂质Texas Red-DHPE的100 µl 10 mg/ml DPhPC SUVs。</li>
		<li>在通风橱中，一边旋转小瓶，一边用氮气流吹干脂质。当脂膜看似干燥后，将脂质置于真空条件下3小时，以去除任何残留溶剂。</li>
		<li>向脂质中加入100 µl SUV缓冲液，充分涡旋振荡，直至管壁上无脂质残留，溶液呈均匀乳白色。</li>
		<li>将脂质溶液进行超声处理以形成小单层囊泡（SUVs）。调整样品瓶的位置，使超声在瓶内产生最大程度的流动和扰动，同时注意避免溶液不必要的加热。持续超声处理直至溶液变为半透明，或尽可能达到透明状态（探头超声处理时间为2–5分钟，水浴超声处理时间约为20分钟）。</li>
		<li>分装SUVs（例如， 10 µl 或 20 µl，于 -20 °C 冻存以备后续使用。 
		注意：脂质（尤其是不饱和脂质）容易降解。请将脂质溶液在氩气环境中于 20 °C（或 80 °C）保存，并在 6 个月内使用完毕。可采用薄层色谱法检测脂质降解产物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过电形成法生长GUV
<ol>
	<li>准备电形成室。
	<ol>
		<li>如果电形成室未清洁，需拆下窗口，擦除所有密封剂和油脂，取出导线，然后交替使用水和乙醇（≥70%）冲洗并用擦镜纸擦拭清洗腔室。</li>
		<li>充分擦拭导线，将导线和腔室浸入丙酮中，超声处理5分钟。再用丙酮浸湿的擦镜纸重新擦拭所有部件。将腔室放入乙醇中，再次超声处理5分钟。</li>
		<li>将导线穿过腔室上的孔洞并重新组装腔室，旋转并擦拭导线以确保其清洁。将腔室置于去离子水中，超声处理5分钟，然后用氮气或空气流吹干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在SUV缓冲液中制备30 µl浓度为3 mg/ml的SUV悬浮液。为制备含蛋白的GUV，取8 µl蛋白-SUV（DPhPC 10 mg/ml，KvAP 脂质与蛋白质量比1:10）、2 µl荧光标记SUV（10 mg/ml DPhPC，0.5 mol% TexasRed-DHPE）和20 µl SUV缓冲液，加入1.5 ml微量离心管中，最终得到蛋白与脂质（质量比）为1:12.5、TexasRed-DHPE为0.1 mol%的混合液。剧烈混匀该溶液。
	<ol>
		<li>或者，若需使用仅含脂质的SUV练习本方案，可直接将10 µl荧光标记SUV（10 mg/ml DPhPC，0.5 mol% TexasRed-DHPE）与20 µl SUV缓冲液混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>滴加SUV溶液。
	<ol>
		<li>使用2 µl移液器或5 µl玻璃注射器，在导线上滴加少量（&#60;0.2 µl）SUV溶液液滴。沿1 cm长的导线形成一系列液滴约需1 µl溶液。确保液滴足够小且彼此间距足够大，避免相互接触或融合。</li>
		<li>将滴加的SUV在空气中干燥约30分钟。待所有液滴稳定后，旋转导线以便在显微镜下更易观察脂质沉积情况。 
		注意：若SUV未充分干燥，在加入生长缓冲液时可能被冲洗脱离导线；而过度干燥则可能损伤蛋白。由于空气湿度会影响干燥速率，可根据实际情况调整干燥时间或环境湿度以获得最佳效果30。导线上的脂质膜应在显微镜下可见。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组装腔室。
	<ol>
		<li>密封腔室底部：用注射器将真空脂涂抹于腔室底部三个孔周围，然后轻压一张40 mm × 22 mm的盖玻片使其紧密贴合，确保底部无间隙。用密封膏密封腔室两侧导线穿出处。再在腔室顶部涂抹真空脂，并围绕三个孔描边。</li>
		<li>缓慢加入生长缓冲液，直至每个孔完全充满。避免缓冲液在孔中快速流动，以防将导线上的脂质膜冲脱。</li>
		<li>轻轻将顶部盖玻片压到真空脂上以封闭腔室，注意不要使底部盖玻片移位。用擦镜纸吸除顶部盖玻片边缘的缓冲液液滴。 
		注意：此时可在显微镜下检查腔室，确认脂质膜仍附着在导线上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用两个鳄鱼夹将信号发生器连接至导线。设定频率（低盐缓冲液用10 Hz正弦波，高盐缓冲液用500 Hz正弦波），并使用万用表测量并调节导线间的电压，使低盐缓冲液条件下的均方根电压（Vrms）为0.7 V，高盐缓冲液条件下为0.35 V。用铝箔覆盖腔室以避免荧光染料暴露于光照。GUV在低盐缓冲液中培养2至3小时，在高盐缓冲液中则需培养12小时或过夜。</li>
	<li>断开腔室与信号发生器的连接，小心将其置于倒置显微镜上评估GUV的形成情况。操作时应缓慢平稳，避免孔中液体流动过快导致GUV提前从导线脱落。 
	注意：导线边缘的GUV通常可在相差模式下（使用40倍长工作距离物镜）观察到，而导线下半部分任意位置的GUV可通过落射荧光观察。若未见GUV，可尝试旋转导线以观察其上表面。GUV可在4 °C条件下于生长腔室内保存数天。</li>
</ol>
4. 通过凝胶辅助溶胀法生长 GUV
<ol>
	<li>通过将100 mg琼脂糖与10 ml纯水混合，配制10 ml的1%琼脂糖溶液。将混合物置于微波炉中，以480 W加热约20秒至沸腾。搅拌以确保琼脂糖完全溶解。 
	注意：该溶液可在4 °C下保存，并在需要时重新加热使用。</li>
	<li>对盖玻片进行等离子清洗（空气等离子）1分钟，以便琼脂糖溶液能够均匀铺展在其表面。请在等离子清洗后的15分钟内使用盖玻片，因为等离子处理效果会迅速减弱。</li>
	<li>将200 µl温热的琼脂糖溶液滴加至每张22 × 22 mm2的载玻片上，使溶液润湿整个表面。将载玻片垂直倾斜，并将底边轻触纸巾，以去除多余液体，仅在玻片表面留下一层薄而均匀的琼脂糖。</li>
	<li>将载玻片置于60 °C的加热板或烘箱中，干燥至少30分钟。琼脂糖薄膜肉眼几乎不可见。待玻片冷却至室温后，立即使用，或在4 °C下密封保存，最长可保存一周。</li>
	<li>将涂有琼脂糖的盖玻片放入标准的3.5 cm培养皿中。</li>
	<li>按照第3.2节方法配制SUV溶液，并将约15 µl的SUV溶液（3 mg/ml脂质）以约30个极小液滴的形式轻柔地滴加至琼脂糖表面。注意避免过度扰动琼脂糖层。</li>
	<li>将玻片置于温和的氮气气流下约10–15分钟，并通过肉眼观察缓冲液的蒸发过程，直至液滴完全干燥。</li>
	<li>一旦SUV完全干燥，立即加入生长缓冲液，使其覆盖玻片表面。对于小型3.5 cm培养皿，使用约1 ml缓冲液。</li>
	<li>让囊泡膨胀过程持续约30分钟，然后使用倒置显微镜结合相差或微分干涉差（DIC）观察腔室内GUV的形成情况。 
	注意：由于凝胶中荧光染料的强背景信号以及琼脂糖自身的自发荧光，共聚焦荧光观察较为困难。</li>
</ol>
5. GUV 的收集与观察
<ol>
	<li>钝化观察室（例如， 小培养皿或玻璃盖玻片），以防止GUVs黏附、铺展并在腔室底部破裂。用β-酪蛋白溶液覆盖腔室底部，孵育5分钟，用纯水冲洗去除酪蛋白溶液，用空气或氮气流吹干，最后加入观察用缓冲液（例如， 小培养皿中约 5 mm 深度。</li>
	<li>收获GUVs。将100 µl移液器吸头的末端剪开，使开口变大（直径约2 mm），吸取时动作要缓慢，因为移液产生的剪切应力容易破坏GUVs。
	<ol>
		<li>对于电形成的大单层脂质体（GUVs），轻轻取下顶部盖玻片以打开生长室。将移液枪头直接置于每根导线上方，边沿导线移动枪头边吸取约50 µl液体，以使GUVs脱离导线。 
		注意：旋转导线以在其“另一侧”收集GUVs可能会有帮助。</li>
		<li>对于“凝胶辅助膨胀”法制备的GUVs，首先轻敲培养皿侧壁数次，以帮助GUVs从盖玻片表面脱离。将移液器吸头置于盖玻片上方，紧贴表面，边缓慢后移吸头边吸取50 µl溶液。将收集的GUVs直接转移至观察室，或置于4 °C下保存于1.5 ml离心管中，最多可保存1周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将观察室置于倒置显微镜上，加入GUVs至观察室中，静置数分钟，使GUVs沉降至室底。</li>
	<li>使用相差显微镜或微分干涉相差显微镜观察腔室，快速定位表面光滑、呈球形（无缺陷）的“GUV候选体”。随后在落射荧光显微镜下逐一检查每个“GUV候选体”，排除内部嵌套有较小脂质体的结构。最后，确认脂质荧光强度均匀，符合单层膜特征即， 单层的 
	注意：在一些双层（或多层）囊泡中，膜之间的距离过近，无法在相差或微分干涉相差（DIC）图像中分辨，因此它们呈现为单层结构。然而，这些结构可通过其脂质荧光与真正的单层GUVs区分开来，前者的荧光强度为后者的两倍或更高。</li>
</ol>
6. GUVs 的膜片钳记录
<ol>
	<li>使用推荐用于拉制电极的程序，从标准硼硅酸盐毛细管玻璃中制备尖端直径为 1–2 µm 的膜片电极。 
	注意：无需进行火焰抛光等特殊处理，若将电极保存在密闭盒中，可在拉制后数天内继续使用。</li>
	<li>通过孵育 β-酪蛋白溶液（5 mg/ml）对腔室进行钝化处理，以确保 GUV 不会黏附、铺展或在腔室表面破裂。5 分钟后用缓冲液冲洗去除酪蛋白。</li>
	<li>插入接地电极，向腔室中加入观察缓冲液，按步骤 5.2 和 5.3 所述转移 10 µl GUV 悬液，并静置数分钟，使 GUV 沉降至腔室底部。</li>
	<li>用新溶液（观察缓冲液或其它等渗溶液）填充一支新的膜片电极，并将其安装至膜片钳放大器的头部。</li>
	<li>在腔室内寻找如第 5.4 节所述的“无缺陷” GUV，并检查其是否含有荧光蛋白。</li>
	<li>施加恒定正压（&#62; 100 Pa，或在压力计中约为 1 cm H2O），以保持膜片电极内部清洁，并将电极插入腔室。将膜片电极移入视野，施加测试脉冲以测量/补偿电极的电压偏移和电阻，并在荧光照明下检查电极，确认其尖端清洁无污染。</li>
	<li>将膜片电极移向 GUV，必要时同步降低正压，以避免电极流出的液体使 GUV “逃逸”。当膜片电极接近 GUV 时，施加负压（最高至 5 cm H2O），将 GUV 拉向电极。监测电阻变化，观察 GUV 膜“舌状”部分进入膜片电极并形成千兆欧姆密封的过程。</li>
	<li>若未形成千兆欧姆密封，需将膜片电极从腔室中取出，并返回步骤 6.4。若膜片已形成千兆欧姆密封，但 GUV 仍附着于电极上，可通过将电极从 GUV 拉离、使 GUV 在腔室底部破裂，或短暂将电极移出溶液等方式切除膜片。</li>
	<li>当 GUV 上的膜片已被切除形成稳定的内面向外膜片且千兆欧姆密封稳定后，关闭测试脉冲，并施加如图 13所示的电压程序。 
	注意：图 13遵循内面向外膜片的标准电生理学惯例，其中流入膜片电极的电流定义为“正”电流，且 V = V浴液– V电极。将膜片钳制在负电位（例如，V = -100 mV）约 30 秒，可使 KvAP 处于静息状态；随后施加正向电压阶跃（100 毫秒至 5 秒，例如，V = 100 mV），可驱动其进入导通（即，开放）的激活状态。</li>
	<li>完成对膜片的测量后，通过电击或压力脉冲破坏膜片，并检查膜片电极的电压偏移是否发生漂移。将膜片电极从腔室中取出，并返回步骤 6.4。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

仿生模型系统是研究蛋白质与膜的性质及其相互作用的重要工具。与BLM或支撑脂质膜等其他重建系统相比，基于GUV的系统具有多项优势，包括对膜的组成、张力和几何形态具有较强的可控性，且真正实现了无油环境。然而，将KvAP等跨膜蛋白整合到GUV中，需要对仅含脂质的GUV常规制备方法进行重大改进。本文所介绍的电形成方法此前已被表征，并用于研究膜蛋白在曲面膜上分布与动态的生物物理原理2,4,35。本研究展示了一种新的凝胶辅助溶胀法，进一步丰富了GUV中蛋白重建的方法体系。这两种方法均可制备出无缺陷且含有高密度KvAP的GUV，内面向外膜片的测量结果证实，这些GUV中包含功能性的、具有钾离子选择性和电压依赖性的离子通道。
这两种方法各有优缺点。当可以使用低盐条件时，电致形成法在大单层囊泡（GUV）产率和蛋白质密度均一性之间提供了良好的折中方案。尽管在生理盐浓度下电致形成法仍能获得较为合理的产率，但不同GUV之间的蛋白质密度差异可能很大（见图8和图11）。这种密度差异似乎与电致形成持续时间有关，因为即使在低盐...

在研究支配生命系统的物理原理时，自下而上的方法使实验者能够控制系统的组分及其他参数，而这些参数在基于细胞的系统中通常难以操控1。对于基于膜的过程，巨大单层囊泡（Giant Unilamellar Vesicles, GUVs，直径约 1–100 µm）已被证明是一种非常有用的生物模拟系统2–7，因其非常适合显微镜观察和微操作8–10。尽管存在多种不同的GUV制备方案，但大多数方法可分为两类：基于乳液的方法11,12和基于脂质膜再水化的方法13–16。在基于乳液的方法中，GUV膜的内层和外层通过在水/油界面处的脂单层逐步组装而成。该方法非常适合在GUV内部包封可溶性蛋白质，以及构建具有不对称脂双层组成的GUV。然而，由乳液法制备的GUV可能残留溶剂痕迹，从而改变膜的力学性质17，且该方法在跨膜蛋白的重构方面并不十分理想。
薄膜再水化方法基于以下事实：干燥（脱水）会导致许多脂质混合物形成多层膜堆叠。若将此膜堆与水性缓冲液接触，溶剂会渗入膜堆内部及表面，使膜堆中的各层膜相互分离，并在表面处形成单个脱离的巨型脂质体（GUVs）13,18（同时也会产生大量其他类型的脂质结构）。然而，即使在最优的缓冲液和脂质组成条件下，这种经典的“自发膨胀”方法所获得的无缺陷GUVs产率仍相对较低。一种广泛用于提高无缺陷GUVs产率的方法是“电致形成法”（electroformation），即在薄膜再水化过程中施加交流电场（AC）。尽管其作用机制尚不明确，但“电致形成法”在低盐浓度缓冲液（&#60; 5 mM）中可实现极高的GUVs产率（&#62; 90%，理想条件下）14,19；甚至在生理盐浓度缓冲液（~100 mM）中，使用更高频率的交流电场（500 Hz 对比 10 Hz）和铂电极也可实现有效成球15。另一种提高无缺陷GUVs产率的替代方法是“凝胶辅助膨胀法”（gel-assisted swelling），该方法将脂质溶液沉积于聚合物凝胶基底上，而非经典“自发膨胀”法中所用的惰性基底（e.g.，玻璃、PTFE）。当所得的脂质/凝胶薄膜再水化时，即使在生理缓冲液条件下也能快速形成GUVs16,20。
所有这些方法均可制备仅含脂质的GUV，可用于研究膜相关现象，例如可溶性蛋白质与膜之间的相互作用。然而，若要将跨膜蛋白整合到GUV中，则需要进行重大改进，以确保蛋白在整个重建过程中保持功能状态。尽管有机溶剂（例如氯仿、环己烷）中的脂质溶液非常适合用于制备脂质膜，但跨膜蛋白通常仅在其疏水性跨膜结构域嵌入脂双层中，或被去垢剂胶束包围（例如在蛋白纯化过程中）时才稳定。因此，重建的起始材料通常是天然膜、含有去垢剂的纯化蛋白溶液，或通过在脂质存在下除去去垢剂而形成的含蛋白小单层囊泡（proteo-SUV）和/或多层囊泡（proteo-MLV）。将这些膜蛋白整合到GUV中的大多数方法可分为三类。
直接插入法：将悬浮在去垢剂中的跨膜蛋白与预先形成的、仅含脂质且经低浓度去垢剂轻微溶解的GUVs混合，随后使用生物珠（biobeads）去除去垢剂21。尽管该方法在概念上较为简单，但需要精确控制去垢剂浓度，因为过高的去垢剂浓度会溶解GUVs，而过低的浓度则可能导致蛋白质去折叠或聚集。
GUV/蛋白-小单层囊泡融合：将含有蛋白质的蛋白-小单层囊泡与预先形成的仅含脂质的GUV混合，并通过特异的促融合肽22或去垢剂21促进融合。通常融合程度有限，导致GUV上的蛋白密度较低。
脱水/再水化：通过部分脱水含有蛋白质的小单层囊泡（proteo-SUV）或大单层囊泡（proteo-MLV）溶液形成含蛋白质的脂质膜，随后按照纯脂质膜的方法生长巨单层囊泡（GUVs）。该方法明显存在的挑战是在部分脱水步骤中保护蛋白质的活性23，但该技术已成功用于将细菌视紫红质、钙离子-ATP酶、整合素和电压依赖性阴离子通道蛋白（VDAC）等跨膜蛋白重组到GUVs中7,23–25。
本文介绍了通过脱水/再水化方法制备含有来自超嗜热古菌Aeropyrum pernix的电压门控钾离子通道KvAP的巨大单层囊泡（GUV）的技术流程。KvAP与真核生物的电压依赖性钾通道具有高度同源性26，且其晶体结构已被解析27，因此是研究电压门控机制的理想模型。蛋白-小单层囊泡（proteo-SUVs）的制备方法已有详细报道，不属于本教程内容26,28,29。重要的是，KvAP蛋白-SUVs无需每次制备GUV时重新制备，可分装成小份（例如，10 µl）于-80 °C长期保存（&#62; 1年）。随后可通过电场成形法或凝胶辅助溶胀法由KvAP蛋白-SUVs（或蛋白-多层囊泡，proteo-MLVs）生长形成GUV。
电穿孔实验方案的关键步骤如图所示 图1含有蛋白质的SUV溶液液滴被滴加到铂丝上（如图所示） 图2）。SUV悬液的部分脱水会导致SUV融合，从而形成脂质蛋白膜。在再水化过程中，向电极施加交流电场，以促进脂质层剥离并形成GUV。当使用“低盐”（&#60; 5 mM 重悬缓冲液28 而 GUVs 需要数小时才能生长。相比之下，生理缓冲液（含约 100 mM 盐）在较低电压、500 Hz 交流电场下效果良好，但需要较长的（约 12 小时）溶胀期15该方法基于先前使用ITO载玻片的实验方案24，但使用一个定制的腔室，其中包含两根铂丝，如图所示 图2 （有关设计细节以及更简单、可自行制作的腔室建议，请参见讨论部分）。
图3 展示了凝胶辅助溶胀法。该方法适用于生理盐浓度的缓冲液，操作快速，且产生的GUVs具有更均一的蛋白质分布。然而，分离出的、明显无缺陷的GUVs的产率（即， GUV 膜在光学尺度上是均匀的，且不包裹任何物体）的数量较低，但已足以满足膜片钳和微操作实验的需求。该方法基于一种使用琼脂糖凝胶制备仅含脂质的 GUV 的方案16 且所需专用设备少于电泳法。
描述了使用荧光显微镜对GUVs进行表征的方法，以及利用标准膜片钳装置在“内面向外”膜片上测量KvAP活性的操作步骤。
制备含蛋白质的GUV比仅含脂质的GUV更具挑战性。特别是，最终GUV的产率可能对SUV溶液的滴加方式及脱水形成膜堆叠的过程高度敏感。对于没有GUV制备经验的研究人员，建议首先采用常规方法15,16制备仅含脂质的GUV，即通过将脂质从有机溶剂中沉积形成膜薄膜。当常规方法能够稳定获得良好结果后，可进一步使用仅含脂质的SUV来掌握SUV的沉积和部分脱水操作。在优化新脂质组分的实验方案时，仅含脂质的SUV同样具有重要帮助。一旦能够稳定地从仅含脂质的SUV生长出GUV，接下来从蛋白脂质体SUV（proteo-SUV）制备含蛋白质的GUV就只需很小的调整即可实现。

<table><tbody><tr><td>DPhPC（1,2-二植烷酰-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷脂酰胆碱）</td><td>Avanti Polar Lipids&amp;nbsp;</td><td>850356P</td><td></td></tr><tr><td>卵磷脂 L-&amp;alpha;-磷脂酰胆碱（鸡蛋，鸡源）&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids&amp;nbsp;</td><td>840051P</td><td></td></tr><tr><td>卵磷脂 L-&amp;alpha;-磷脂酸（鸡蛋，鸡源）</td><td>Avanti Polar Lipids&amp;nbsp;</td><td>840101P</td><td></td></tr><tr><td>18:1 (&amp;Delta;9-&lt;em&gt;顺式&lt;/em&gt;) PC（DOPC）1,2-二油酰-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷脂酰胆碱</td><td>Avanti Polar Lipids&amp;nbsp;</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇（绵羊毛来源，&gt;98%）&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids&amp;nbsp;</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>TRed-DHPE</td><td>Invirtogen</td><td>T-1395MP</td><td>标记脂质</td></tr><tr><td>BPTR-神经酰胺</td><td>Invirtogen</td><td>D-7540&amp;nbsp;</td><td>标记脂质</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>VWR</td><td>22711.290</td><td>AnalaR Normapur</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>VWR</td><td>20066.296</td><td>AnalaR Normapur</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td>AnalaR Normapur</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 注射器&amp;nbsp;</td><td>Hamilton Bonaduz AG</td><td></td><td>多种规格</td></tr><tr><td>棕色小瓶和聚四氟乙烯杯</td><td>Sigma</td><td>SU860083 和 SU860076</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>291-1214</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>多种规格</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Euromex</td><td>LM3（1670-B，Tg 25.7°C，Tm 64°C）</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>84097-1kg</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8270-1kg</td><td></td></tr><tr><td>海藻糖</td><td>Sigma</td><td>T9531-25G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-100G</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Euromex</td><td>EU0011-A</td><td></td></tr><tr><td>渗透压仪</td><td>Wescor</td><td>Vapro</td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Schott instruments</td><td>Lab850</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Elmasonic</td><td>S 180 H</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Sartorius steim</td><td>Minisart 16532</td><td></td></tr><tr><td>函数发生器</td><td>TTi</td><td>TG315</td><td></td></tr><tr><td>铂丝</td><td>Goodfellow</td><td>LS413074</td><td>纯度 99.99+%，直径 = 0.5 mm</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯</td><td>Goodfellow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>道康宁“高真空润滑脂”</td><td>VWR</td><td>1597418</td><td></td></tr><tr><td>密封膏</td><td>Vitrex medical A/S, 丹麦</td><td>REF 140014</td><td>Sigillum Wax</td></tr><tr><td>盖玻片 22 × 40 mm，No1.5</td><td>VWR</td><td>631-0136</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 22 × 22 mm，No1.5</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>631-0125</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G</td><td>空气等离子，设置为“高”</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Falcon BD</td><td>REF 353001</td><td>3.5 cm × 1 cm</td></tr><tr><td>膜片钳放大器</td><td>Axon instruments</td><td>Multiclamp700B</td><td></td></tr><tr><td>数据采集卡</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6221</td><td></td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments</td><td>版本 8.6</td><td></td></tr><tr><td>玻璃移液管，硼硅酸盐，外径 1&amp;nbsp;mm，内径 0.58&amp;nbsp;mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-15</td><td></td></tr><tr><td>电极夹持器</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>Q45W-T10P</td><td></td></tr><tr><td>微操纵器</td><td>Sutter&amp;nbsp;</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>移液管拉制仪</td><td>Sutter&amp;nbsp;</td><td>P-2000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>ProSilica&amp;nbsp;</td><td>GC1380</td><td></td></tr><tr><td>蔡司显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 135</td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>40X 长工作距离，相差</td></tr><tr><td>物镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>100X Plan-Apochromat NA 1.3</td></tr><tr><td>GFP 滤光片组（用于 Alexa-488）</td><td>Horiba</td><td>XF100-3</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 滤光片组（用于 TexasRed）</td><td>Horiba</td><td>XF101-2</td><td></td></tr><tr><td>β-酪蛋白</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C6905-1G</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon Eclipse TE 2000-E</td><td></td><td>D-Eclipse C1 共聚焦头</td></tr><tr><td>物镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>Plan Fluor 100X NA 1.3</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>用于图像处理和电流轨迹分析</td></tr></tbody></table>

将跨膜蛋白——电压门控离子通道kvap——重组入巨大单层囊泡，用于显微镜与膜片钳研究

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

巨大单层囊泡（GUVs）是研究膜相关现象的一种常用仿生系统。然而，为了形成含有功能性跨膜蛋白的 GUVs，通常使用的 GUVs 制备方案必须经过修改。本文介绍了两种脱水-再水化方法——电场成形法和凝胶辅助膨胀法，用于制备含有电压门控钾离子通道 KvAP 的 GUVs。在这两种方法中，先将含有蛋白质的小单层囊泡溶液部分脱水，形成膜堆叠，再使其在再水化缓冲液中膨胀。在电场成形法中，将膜沉积在铂电极上，以便在膜再水化过程中施加交流电场。相比之下，凝胶辅助膨胀法则使用琼脂糖凝胶基底以促进膜的再水化。这两种方法均可在低盐（例如，5 mM）和生理盐浓度（例如，100 mM）条件下生成 GUVs。所获得的 GUVs 通过荧光显微镜进行表征，并采用内面向外式膜片钳构型测量重组通道的功能。尽管在交变电场存在下膨胀（即电场成形）可获得较高产量的无缺陷 GUVs，但凝胶辅助膨胀法能实现更均一的蛋白质分布，且无需特殊设备。

可通过显微镜下观察生长室快速评估 GUV 的生长情况。在电场成形过程中，GUV 通常沿铂丝成簇生长，如图 4所示。在凝胶辅助溶胀过程中，GUV 呈现为迅速生长并相互融合的球形结构（图 5）。
无缺陷的GUV在转移至观察室后更容易被识别和评估。需要进行校准测量以严格评估GUV的质量，此前已有系统性定量方法发表。28。然而，作为经验性参考，“良好”的GUV应为分离的（即， 不呈簇状，具有单一、光滑、球形的外膜，不含任何内部结构即， 管状结构，嵌套囊泡 等等。）内部，且具有“标准”脂质荧光水平（较亮的物体通常为双层或多层结构）。 图6 显示转移至等渗葡萄糖溶液后一个“无缺陷”GUV的微分干涉相差（DIC）和落射荧光图像。DIC中的对比度源于充满蔗糖的GUV与含葡萄糖的浴液之间光学密度的差异。尽管KvAP本身不应通透蔗糖或葡萄糖，但含KvAP的GUV的折射率对比度常随时间推移而降低。GUV膜中均匀的蛋白质荧光证实K...

展示了两种脱水-再水化方法——电形成法和凝胶辅助溶胀法，将跨膜蛋白KvAP重组到巨大单层囊泡（GUVs）中的过程。在这两种方法中，含有该蛋白的小区单层囊泡融合形成GUVs，随后可通过荧光显微镜和膜片钳电生理技术进行研究。

将跨膜蛋白——电压门控离子通道KvAP——重组入巨大单层囊泡，用于显微镜与膜片钳研究

巨大单层囊泡（GUVs）是研究膜相关现象的一种常用仿生系统。然而，目前常用的GUVs制备方案在生长……

以下实验的总体目标是将电压门控离子通道整合到巨型单层囊泡中，并通过膜片钳测量表征其活性。该过程首先将含有离子通道KVAP的小囊泡溶液部分脱水，以形成脂质-蛋白质薄膜。随后，将该脂质膜重新水化，促使含有该通道的细胞尺寸大小的巨型单层囊泡（giant unilamellar vesicles, GUVs）形成并生长。然后将GUV转移至记录室，并使用膜片钳电极从GUV膜上切除一片膜，以测量离子电流。结果表明，根据电流记录的分析，GUV膜中的离子通道会响应膜电位的变化而被激活。巨型单层囊泡可帮助解答生物物理学领域中与膜蛋白相互作用相关的关键科学问题。例如，跨膜蛋白与脂质膜物理特性之间的相互作用。尽管该方法可为电压门控铁离子通道KVAP的功能提供见解，但也可应用于其他铁离子通道、转运蛋白、泵蛋白以及一般的跨膜蛋白。由于涉及巨囊泡操作的步骤较为复杂，对该方法进行可视化演示至关重要。如何在制备含有 KVAP 的溶液和小单层囊泡后开始阅读文章。根据文本方案，首先将导线穿过孔洞，旋转并擦拭导线以确保其清洁，然后在氮气或空气流下进行溶剂化和干燥，从而制备电形成室。按照文本方案所述，制备 30 微升浓度为 3 毫克/毫升的 SUV 悬浮液于 SUV 缓冲液中，剧烈混合溶液以使 SUV 溶液充分分散。使用2微升移液器或5微升玻璃注射器将SUV溶液的小液滴置于金属丝上。确保液滴足够小，并且彼此间距足够远，以避免相互接触或融合。将沉积的SUV在空气中干燥约30分钟。当液滴沉降后，旋转金属丝，以便在显微镜下更易于观察脂质沉积。接下来，使用注射器将真空脂涂抹在样品室底部三个小孔周围，并轻轻将一块40毫米×22毫米的盖玻片压紧在底部，以密封样品室底部，确保其粘附且无间隙。然后使用天花板胶密封样品室的侧面，并在样品室顶部三个小孔周围涂抹真空脂。缓慢加入生长缓冲液，直至每个孔完全充满。避免孔中溶液发生快速流动，以免影响实验。将脂质膜从电极上剥离。轻轻将顶部盖玻片压在油脂上，关闭样品室，注意不要移动底部盖玻片。使用两个鳄鱼夹将信号发生器连接到导线上。根据所用缓冲液的盐浓度设置频率，并使用万用表测量并调节导线两端的电压。根据所用缓冲液，用铝箔覆盖电泳室，以保护荧光物质免受光照。将 G UUVs 在低盐缓冲液中培养 2 至 3 小时，在高盐缓冲液中培养 12 小时或过夜。孵育结束后，将腔室从发生器上断开，并小心地将其放置在倒置显微镜上。为了评估GUV的生长等离子体，用等离子体清洁盖玻片一分钟，以便ARO溶液能够均匀铺展。在清洁盖玻片后的15分钟内，加入200微升按照文本方案制备的温热ARO溶液，使其润湿整个表面。将载玻片垂直倾斜，用其下边缘接触纸巾以去除多余的液体，使载玻片上留下一层薄而均匀的 aros。将载玻片置于60摄氏度的加热板或烘箱中，至少干燥30分钟。接着，将一片涂有AROS的盖玻片放入标准的3.5厘米培养皿中。然后，在制备 SUV 溶液后，将约 15 微升溶液分成大约 30 个极小的液滴，轻柔地滴加到 aros 表面。注意不要过度破坏 aros 层的结构。将载玻片置于温和的氮气气流下约 10 到 15 分钟，并用肉眼观察缓冲液的蒸发情况。由于小单层脂质体（SUVs）干燥后液滴会立即干燥，因此需加入约一毫升生长缓冲液以覆盖载玻片表面。让溶胀过程持续约30分钟，然后使用配备相差或微分干涉差（DIC）的倒置显微镜观察生长室中GU UUVs的形成情况。通过向室内加入5毫克/毫升的β-半乳糖苷酶溶液对GU UUVs进行膜片钳实验，该溶液可防止GU细胞黏附、铺展和破裂。孵育5分钟后冲洗，插入接地电极，并用观察缓冲液填充室内。接下来，将 G UUVs 转移至用于电形成 GU UUVs 的观察室。通过轻轻移除顶部盖玻片打开培养室。将移液枪头直接置于每根导线正上方，缓慢吸取约 10 µL 以使 GU UUVs 脱离，同时沿导线移动移液枪头，从而实现凝胶辅助膨胀的 GU UUVs。首先轻敲培养皿侧壁数次，使GU UUVs从盖玻片表面脱离。将移液枪头置于盖玻片上方，边缓慢后撤枪头边吸取10微升液体，直接将收获的GVS转移至观察室。等待数分钟，待Gus沉降至底部后，进行GVS的膜片钳记录。使用观察缓冲液填充一支新的膜片钳电极，并将其安装到膜片钳头架上。在样品腔内寻找一个无缺陷的GUV，并确认其内含有荧光蛋白。施加持续大于100帕斯卡的正压，以保持膜片钳电极内部清洁，随后将膜片钳电极插入样品腔中。将膜片电极移入视野，并施加测试脉冲以测量或补偿电极的电压偏移和电阻。随后在荧光照明下检查电极，确认尖端清洁。将膜片电极移向GUV，必要时同时降低正压，以避免电极向外流出的液体导致GUV移动偏离。当膜片钳电极接近GUV时，施加负压以将GUV拉向膜片钳电极。监测随着GUV膜舌部进入膜片钳电极时电阻的变化，并观察吉伽封接的形成。当GUV上的膜片已被切除形成内面向外的膜片构型，且吉伽封接稳定后，关闭测试脉冲，按照文中所述施加电压程序。该图展示了无缺陷GUV的微分干涉差（DIC）和落射荧光图像。GUV膜中均匀的蛋白荧光信号证实KVAP已整合入GUV中，而非残留在脂质膜上，且未形成聚集体。此处显示了采用三种方法制备的GUV。荧光脂质和蛋白信号已被调整至相同的平均密度，因此在叠加图像中，蛋白密度较低或较高的GUV呈现品红色或绿色色调，而蛋白密度适中的GUV则呈现白色。已鉴定出无缺陷的独立 GUV，并在此展示 GUV 的尺寸分布。通常，电致膨胀法产生的无缺陷 GUV 多于凝胶辅助溶胀法，但电致膨胀法生成的 GUV 较小。此处展示的是根据 GUV 荧光推断出的蛋白质密度分布。使用高盐缓冲液进行电致形成可产生蛋白密度不同的GU UUVs。使用低盐缓冲游戏副本形成的GU UUVs蛋白密度变化较小，而通过凝胶辅助溶胀法产生的GU UUVs蛋白密度则取决于切除膜片中的蛋白浓度，表现出显著的均一性。电流迹线显示为单个通道或通道集合。KVAP表现出电压依赖性开放。在进行该操作时，需注意巨型囊泡为脆弱物体，不耐受剪切力和渗透压应力。完成该操作后，可进一步开展诸如拉制脂质纳米管等方法，以探究蛋白质的曲率感应等其他科学问题。观看本视频后，您应能充分理解如何制备含有功能重建蛋白的GVS。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

跨膜蛋白的重组，电压门控离子通道，KvAP，进入巨人单层囊的显微镜和膜片钳研究

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用于成像和膜片钳电生理学研究的巨型脂质体的制备

本文描述了将一种原型电压门控钾通道完全重建到脂质膜中的操作步骤。重建后的通道适用于生化分析、电生理记录、配体筛选以及电子晶体学研究。这些方法可能普遍适用于其他膜蛋白的结构与功能研究。...

将Kv通道重构至脂质膜中用于结构与功能研究

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从巨大单层囊泡中拉取膜纳米管

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响应局部钙离子梯度的巨型囊泡膜重塑

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体外 在巨大单层囊泡内重建肌动蛋白细胞骨架

本方案描述了使用倒置乳液法将无细胞表达（CFE）系统包裹于巨型单层囊泡（GUV）内，以研究模型膜蛋白在脂双层中的合成与整合。...

通过包封无细胞表达系统重构细菌谷氨酸受体通道

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在哺乳动物细胞中异源表达离子通道的诱变与功能分析

使用膜片钳技术记录BK通道的离子电流。通过向非洲爪蟾卵母细胞Xenopus...

膜片钳与灌流技术在研究离子通道表达中的应用 非洲爪蟾 卵母细胞

学习将电压门控离子通道KvAP重组到巨型单层囊泡中的方法，利用脱水-再水化技术制备GUVs，并通过膜片钳技术测量离子电流以分析通道活性。该技术有助于深入理解膜蛋白功能。

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