线粒体的制备及透气性评估，从骨骼肌组织通过穿刺活检获得的分离

该程序的总体目标是检查从活检的骨骼肌组织中分离的线粒体的呼吸控制。这是通过首先通过经皮穿刺活检获得少量肌肉来实现的。第二步是通过均质化将线粒体与活检的肌肉分离。

接下来，洗涤分离的线粒体，并通过离心将样品通过编织的粗棉布与非线粒体组分分离。最后一步是将分离的线粒体铺板，通过细胞外通量测定进行呼吸测量分析，以可视化耗氧率。最终，seahorse 细胞外通量分析仪用于检查离体线粒体中的呼吸控制。

与现有方法相比，该技术的主要优点是它需要最少的肌肉组织量，低至 20 毫克，并限制了实验间的可变性。这些特性使该技术适用于临床研究应用。该技术的意义在于诊断患者的线粒体功能障碍。

这种方法的视觉演示至关重要，因为肌肉活检和线粒体分离需要精确的作，最好以视觉方式演示，而不仅仅是用文字来描述。要在局部进行活检，请服用 1% 利多卡因，注意不要渗入肌肉。然后等待 10 分钟。

为了充分麻木，从插入点和起点之间的肌肉中间区域进行活检，避开筋膜下和肌腱区域。为此，首先使用经皮针头并遵循筋膜的爆裂或阻力作为指导。用麻醉针估计深度，然后用窄手术刀刀片感觉，并在筋膜上切开 4 到 5 毫米的切口。

将针头穿过切口，直到它插入肌肉。收集多个样品，并将窗口转向不同的方向。使用 60 立方厘米的注射器进行连续抽吸，同时将肌肉样本沿不同方向推进和抽出到经皮针头中 2 到 4 次。

停止抽吸并取出针头。让助手对穿刺部位施加 5 分钟的用力按压。要建立止血，请断开针头与抽吸管的连接，并小心地从窗口和桶中取出肌肉样本。

如果需要更多肌肉，请重复此过程，进行第二次通过。使用镊子从肌肉样本中去除任何可见的血凝块。然后称取样品并立即放入装有冰的试管中。

冷 ECCO 磷酸盐缓冲盐水或 DPBS。使用锋利的剪刀和镊子从样品中去除可见的结缔组织。彻底。用冰冷的 DPBS 缓冲液洗涤标本 3 到 4 次。

要去除血液，请将样品保存在冰冷的 DPBS 上并尽快处理。在活检后 45 分钟内，采取预防措施小心地从肌肉样本中去除任何肌腱或脂肪组织。取出一小部分多余的组织，在零下 80 摄氏度下储存。

这可用于其他实验，例如蛋白质印迹。立即将肌肉组织切成细块。使用一把无菌剪刀，然后悬浮在 500 微升至 1 毫升的西斯廷蛋白 ACE 抑制剂中，例如溶解在 CP one 缓冲液中的 nagars，浓度为每克组织 0.2 毫克。

将样品切碎，直到它看起来悬浮良好。随后在室温下孵育 5 分钟，然后转移到冰中，确保彻底清洗均质器。事先。将用 nagars 处理的碎组织匀浆。

使用自动均质器。在整个过程中将样品保持在冰上。将每个组织样品匀浆四次，每次 2 秒的脉冲。

使用自动均质器以 10， 000 RPM 的速度设置，将样品放回冰上。用 70% 乙醇清洗探针，然后在组织之间用蒸馏水清洗。现在，用等体积的 chapel Perry one 或 CP one 缓冲液洗涤匀浆的组织。

然后用两倍体积的 CP 2 缓冲液洗涤组织。通过在另一个锥形管中将水加热至相同体积来添加平衡管。将内容物收集在离心管中，并在 600 GS 下离心，4 摄氏度或预先润湿粗棉布 10 分钟，让所有颗粒通过而不会被布卡住。

将上清液穿过编织的粗棉布，收集滤液并丢弃沉淀，从而去除大部分非线粒体组分。然后将上清液在 10， 000 GS 4 摄氏度下超速离心 10 分钟。将沉淀悬浮在 4 mL CP 2 缓冲液中，然后在离心后以相同的方式第二次离心。

弃去上清液，将馅饼重悬于 2 mL CP one 缓冲液中。此时，将该悬浮液中的小等分试样放入单独的试管中，用于蛋白质估计。复苏，将剩余样品悬浮在 CP 1 缓冲液中并离心。

与以前一样，请注意，在早期的离心步骤中，应使用标准品设置蛋白质板。最后，将最终沉淀重悬于最少量的线粒体测定溶液或质量中。进行 XF 分析，以可视化耗氧率或 OCR（以每分钟皮摩尔氧气或氧气和 pH 值的绝对水平为单位）。

在数据输出中。将 10 x 浓度的 X 质量中的化合物添加到基于板的呼吸计的端口 A 到 D 中，得到文本方案中列出的最终浓度。为所需数量的孔准备足够体积的化合物。

使用之前测量的蛋白质计算来确定要添加的线粒体的浓度。通过滴定每孔 1 μg、2.5 μg 和 5 μg 线粒体来确定线粒体的最佳量。的 24 孔板，以最大限度地减少孔之间的差异。

首先在冷中稀释 10 x 线粒体，1 x 质量加底物。接下来，向每个孔中输送 50 微升这种悬浮液。留下四个仅含有 50 μL 质量的孔用作背景读数。

将预先浸泡的校准板与之前使用的上部墨盒一起放入呼吸计中，以执行仪器校准。准备测试板运行，在 4 摄氏度下以 2000 GS 离心板 20 分钟。离心后。

轻轻加入 450 微升 1 x 质量，加上琥珀酸盐和腐烂的物质。在将板转移到 XF 分析仪之前，在显微镜下观察线粒体，以确保均匀地粘附在孔上。顺序。使用呼吸计实时测量线粒体呼吸，方法是使用文本协议中提供的呼吸计设置对其进行编程，此处显示是由复数 2 驱动的典型呼吸计指标曲线，使用 1 微克、2.5 微克和 5 微克线粒体按预期。

总体而言，OCR 随着线粒体数量的增加而增加。该测定的计算呼吸控制比或 RCR 为 7.95，表明线粒体制备是高质量的，以便在分析不同量的线粒体变体或 Inova 分析时比较结果的一致性或进行 Inova 分析并计算平方和。状态 2、状态 3、状态 3、状态 3、状态 2 和状态 3 的解偶联抗霉素 A 和 RCR 的平方和或 SS 表示单向测量。

Innova 以及 ANTIMYCIN 和 RCR 均具有统计学意义。组间解耦状态 3 未见显著差异。这些结果表明，与其他浓度相比，每孔 5 μg 线粒体的 SS 最低。

该图用作指南，以指示根据初始肌肉样本量可以预期多少线粒体蛋白。正如预期的那样，加工的肌肉量与最终样品的总线粒体蛋白含量之间存在很强的相关性。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三个小时内完成。

肌肉活检后，重要的是要确保患者在接下来的三天内不服用任何阿司匹林或布洛芬或其他非处方非甾体类药物，以确保我们活检的组织愈合良好。接下来的事情是，我们要确保他们在接下来的一天半内也不做任何剧烈的活动，所以没有什么比不和谐的了。那将是篮球蹦床，但他们可以进行自己的正常活动。

我们还要求他们保持该区域 24 小时干燥，但第一次在淋浴时要弄湿，这样我们尚未清洁的皮肤上可能存在的任何类型的细菌都不会进入切口。看完这个视频，你应该对如何活检 S 外侧骨骼肌组织、分离线粒体和测量呼吸控制有更好的了解。