Name: 线粒体的制备及透气性评估，从骨骼肌组织通过穿刺活检获得的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 学习从骨骼肌穿刺活检样本中分离线粒体并进行呼吸功能评估的方法。该技术仅需20毫克组织即可分析线粒体功能，适用于临床研究中的线粒体功能障碍诊断。

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我们感谢波士顿大学医学院的Marc Liesa博士在本方案开发过程中提供的有益讨论；感谢来自维克森林医学院的Karin Murphy女士、Heather Gregory女士和John Stone先生在技术方面提供的宝贵协助。

注意：所描述的方案已获得维克森林医学院机构审查委员会的批准。已获得参与者的书面知情同意。所有参与者均为健康的老年人（65-79岁），性别不限，体重指数（BMI）范围为23-35。

1. 骨骼肌活检
<ol>
	<li>如先前所述，9所有活检均应在隔夜禁食后的清晨进行。要求受试者在活检前一周内避免服用阿司匹林、处方或非处方的非甾体抗炎药，以及其他可能影响出血、血小板或瘀伤的化合物。同时要求参与者在活检前至少36小时&#160;内避免任何剧烈活动。 
	注意：使用经皮穿刺针活检技术，在1%利多卡因局部麻醉下，从股外侧肌（Vastus lateralis）获取肌肉组织。本临床研究单位尚未发生与该操作相关的任何医学并发症或其他报告的不良事件。</li>
	<li>注意：所述活检操作步骤改编自Bergstrom10的方法。
	<ol>
		<li>简要地，局部注射1%利多卡因，注意避免浸润肌肉组织。随后等待10&#160;分钟&#160;，以确保充分麻醉。</li>
		<li>从肌腹（即肌肉起止点之间的中段区域）取活检样本，避开筋膜下区域和肌腱结合部。
		<ol>
			<li>使用经皮穿刺针（一种带有侧向切割窗和内部切割圆筒的负压辅助可重复使用装置），以筋膜“突破感”或筋膜阻力作为进针引导。&#160;</li>
			<li>先用麻醉针估算深度，再用窄刃手术刀感知深度，并穿过筋膜做4–5 mm的切口。&#160;将穿刺针经切口推进，直至插入肌肉内。&#160;</li>
			<li>通过旋转切割窗至不同方向，采集多个样本。&#160;使用60 mL注射器持续施加负压，在不同方向上将肌肉组织推入和拉出穿刺针2至4次。停止负压后取出穿刺针。 
			注意：每次穿刺（进针和退针）应少于一分钟。</li>
			<li>由助手在穿刺部位施加牢固压力5分钟&#160;，以实现止血。断开穿刺针与负压管路的连接，小心地从切割窗和针筒中取出肌肉样本。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>如需更多肌肉组织，可重复上述操作进行第二次穿刺。</li>
		<li>使用镊子去除肌肉样本中任何可见的血凝块，称重后立即放入含有冰冻DPBS的离心管中。 
		注意：采用该方法的平均收获量为150 ± 20 mg。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 线粒体分离
<ol>
	<li>在实验当天新鲜配制 Chappel-Perry (CP) 缓冲液和线粒体测定溶液 (MAS)（表 1），或分装后于 -20 °C 保存。将化合物用二甲基亚砜配制成 2.5 mM 的浓度，分装后于 -20 °C 保存。缓冲液和化合物分装样品在 -20 °C 保存期间，须在配制后 2 个月内使用完毕。</li>
	<li>使用锋利的剪刀和镊子去除样品中可见的结缔组织；如有需要，可在此步骤中使用解剖显微镜。用预冷的 DPBS 缓冲液彻底清洗样本 3–4 次，以去除血液。将样本保持在预冷的 DPBS 中，并尽快处理，注意从活检取样开始不得超过 45 分钟&#160;。需小心谨慎地从肌肉样本中去除任何肌腱或脂肪组织。</li>
	<li>立即使用无菌剪刀将肌肉组织剪成细小碎片，并悬浮于 500 μl 至 1 ml 含蛋白酶（Nagarse）的 CPI 缓冲液中，蛋白酶浓度为 0.2 mg/g 组织。随后在室温下孵育 5&#160;分钟&#160;，然后转移至冰上。</li>
	<li>使用自动匀浆器对经 Nagarse 处理的组织匀浆。整个过程中保持样本处于冰上。每个组织样本匀浆 4 次，每次脉冲 2 秒，匀浆器速度设定为 10,000 rpm。在处理不同组织之间，用 70% 乙醇清洗探头，再用蒸馏水冲洗。</li>
	<li>用等体积的 CP I（500 μl 至 1 ml）和两倍体积的 CP II（1 ml 至 2 ml）洗涤匀浆后的组织，将洗涤液收集至离心管中，在 4 °C 条件下以 600 × g 离心 10 分钟。将上清液通过湿润的纱布过滤，收集滤液并弃去沉淀物，从而去除大部分非线粒体组分。</li>
</ol>
3. 线粒体的洗涤
<ol>
	<li>将上一步的上清液在 4 °C 条件下以 10,000 x g 离心 10 分钟。将沉淀重悬于 4 ml CP II 缓冲液中，再在 4 °C 条件下以 10,000 x g 离心 10 分钟。 
	注意：偶尔会在 mitochondrial 沉淀下方形成一层薄薄的血样沉淀。此时，需用 CPII 缓冲液轻轻吸除 mitochondrial 沉淀。若在步骤 2 中彻底洗去血液，则可避免此步骤。</li>
	<li>将获得的沉淀重悬于 2 ml CP I 缓冲液中。在此阶段，取少量该悬液用于蛋白质定量。将剩余样品用 CP I 缓冲液重新悬浮，并按上述条件离心。将最终的沉淀重悬于少量（200 μl）Mitochondrial Assay Solution（MAS）中。 
	注意：此阶段进行蛋白质测定，是因为 CP I 缓冲液不含 BSA，而后续样品所悬浮的 MAS 中含有 BSA。</li>
</ol>
4. 使用 BCA 蛋白质检测试剂盒通过测定蛋白浓度估算线粒体含量
注意：使用此浓度计算用于呼吸测定实验中24孔微孔板加样的线粒体量，或用于蛋白质印迹实验的线粒体量。计算蛋白质浓度时需考虑稀释倍数（10倍）。
5. 按照 Rogers, GW, et al.12 所述方法进行 XF 检测
注意：在数据输出中以 pMoles O2/min 为单位观察 O2 消耗速率（OCR），或观察 O2 和 pH 的绝对水平。
<ol>
	<li>使用1x MAS缓冲液配制待注射的化合物。将各化合物以10倍浓度分别加入A-D端口，最终浓度如下：A端口，ADP（腺苷-5'-二磷酸，2 mM，50 μl）；B端口，寡霉素（2 μM，55 μl）；C端口，FCCP［羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙，6 µM，60 μl］；D端口，抗霉素A（2 μM，65 μl）。根据所需检测孔数，配制足量的化合物溶液。</li>
	<li>通过滴定法确定线粒体的最佳用量。例如，在含有底物的50 μl冰冻1x MAS缓冲液中，每孔分别加入1.0 μg、2.5 μg和5.0 μg线粒体。为减少孔间差异，先将10倍浓度的线粒体在冰冷的1x MAS缓冲液（含底物）中稀释，然后向各孔（背景校正孔除外）加入50 μl该悬浮液。</li>
	<li>将微孔板在4 °C条件下以2,000 × g离心20分钟&#160;。离心后，向每孔轻柔加入450 μl的1x MAS缓冲液，其中含琥珀酸钠（10 mM）和鱼藤酮（2 μM）（初始条件；见下文）。在将微孔板转移至XF分析仪前，通过显微镜观察线粒体，确保其均匀贴附于孔底。 
	注意：初始条件的选择取决于呼吸是由电子传递链复合物I还是复合物II驱动。对于由复合物II驱动的呼吸，使用琥珀酸钠（10 mM）和鱼藤酮（2 μM）作为初始条件。鱼藤酮可抑制复合物I，而琥珀酸为复合物II（琥珀酸脱氢酶）提供底物。若研究由复合物I驱动的呼吸，可使用丙酮酸和苹果酸（终浓度均为5 mM），或谷氨酸和苹果酸（终浓度均为10 mM）作为初始条件。后者有助于区分三羧酸循环功能障碍与底物转运异常。若研究由复合物I和复合物II共同驱动的呼吸，则在初始条件中加入丙酮酸和琥珀酸，不加鱼藤酮或苹果酸。使用棕榈酰肉碱作为β-氧化的底物。</li>
	<li>按照先前描述的方法12设置呼吸测定仪，实时连续测定线粒体呼吸。采用表2中提供的呼吸测定仪参数。 
	注意：各种线粒体呼吸状态的简要说明如下：</li>
	<li>状态2 = 存在底物时的偶联呼吸状态；状态3 = 在饱和ADP存在下的磷酸化呼吸；状态4o = 由寡霉素诱导的非磷酸化呼吸；状态3u = 由解偶联剂FCCP刺激达到的最大解偶联呼吸；残余非线粒体呼吸 = 抗霉素A抑制复合物III后的残余耗氧。还需指出，氧耗率（OCR）测定的持续时间与线粒体浓度的组合可能在测定期间消耗氧气，从而影响实验数据。</li>
</ol>
6. 蛋白质印迹
注意：通过 Western 印迹法检测线粒体标志物 COX IV 和全组织 GAPDH，以确认最终样品中线粒体的富集情况
<ol>
	<li>通过12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶分离分离的线粒体和全组织提取物。</li>
	<li>将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。</li>
	<li>用COX IV抗体（1:20,000）孵育，随后使用辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗。检测GAPDH时，将膜剥离后用GAPDH单克隆抗体（1:2,000）重新孵育。 
	注意：若关注内质网污染的差异，可在分析中加入ERp72、钙联蛋白或钙网蛋白等内质网标志物。</li>
</ol>

<ol><li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods. 26, 292-297 (2002).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+rat+brain+mitochondria+with+high+metabolic+activity%3A+effects+of+EDTA+and+EGTA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA.</a> Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).</li>
<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).</li>
<li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PloS One. 8, e82392(2013).</li>
<li>Chappell, J. B., Perry, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+and+adenosinetriphosphatase+activities+of+skeletal-muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria.</a> The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).</li>
<li>Tyrrell, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respirometric+Profiling+of+Muscle+Mitochondria+and+Blood+Cells+Are+Associated+With+Differences+in+Gait+Speed+Among+Community-Dwelling+Older+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. , (2014).</li>
<li>Nicklas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+physical+function+to+vastus+lateralis+capillary+density+and+metabolic+enzyme+activity+in+elderly+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women.</a> Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).</li>
<li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Percutaneous+needle+biopsy+of+skeletal+muscle+in+physiological+and+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746(2011).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6, e18317(2011).</li>
</ol>

作者 George Rogers 就职于 Seahorse Bioscience，该公司生产本文所用仪器。开放获取费用由 Seahorse Biosciences 资助。

分离的线粒体常用于研究电子传递链（ETC）功能以及其他线粒体活动，包括底物转运和三羧酸（TCA）循环功能。利用分离的细胞器进行呼吸测定实验，可直接检测氧化磷酸化的基础过程以及ETC的内在特性。与完整细胞或透化肌纤维相比，对分离线粒体进行呼吸测定分析具有数据解释相对简便、且不受非线粒体过程或线粒体质量/生物合成变化“干扰”的优势。数据归一化基于线粒体蛋白含量，从而便于不同样本间线粒体的直接比较。当研究目的是确定潜在机制并鉴定特定靶点（如ETC组分/复合物或线粒体转运机制）时，对分离线粒体进行呼吸测定分析是首选方法。
本文描述了一种从少量组织样本中进行肌肉活检并分离功能性线粒体的实验方案。由于采用了自动匀浆器而非手动Dounce匀浆器，该方法在不同操作者之间具有良好的可重复性。仅需20 mg肌肉组织即可完成线粒体的分离。由此样本量所获得的线粒体数量足以进行Seahorse基于微孔板的呼吸测定，同时还能剩余足够的线粒体用于其他实验及后续分子分析的储存。值得注意的是，该方法也可应用于XF 96系统，在该系统中可使用更少量的线粒体（每孔1–2 μg）。
多种线粒体分离方案依赖Dounce匀浆器进行初始组织破碎。该方法的一个缺点是初始组织匀浆过程需要人工操作。不同操作者在使用匀浆器时，研杵施加的力度和速度可能存在显著差异6。这可能导致实验间以及实验室间的变异，使得不同实验之间的数据比较变得困难。在人体干预研究中这一问题尤为突出，因为受试者的数据通常在不同时间点（如治疗前后）采集，且可能在多个地点进行。我们采用自动化匀浆仪，以实现更一致的操作，获得可重复性更高的结果，并显著减少个体间差异。该方法的制备速度也使其适用于同时处理多个样本。通常情况下，单日内可完成多达三项实验。
本研究所述技术的潜在局限性源于分离细胞器的使用以及基于微孔板的实验形式。例如，Picard 等 已证明，分离的线粒体在功能特性上与透化肌纤维中完整的线粒体存在根本性差异。他们提出，线粒体分离技术会导致生物能量功能发生改变，例如与透化肌纤维相比，其呼吸控制比（RCR）显著升高，并伴随活性氧（ROS）产生增多13。与透化肌纤维相比，线粒体的分离需要更长的制备时间。此外，细胞内容物的丢失降低了其生理相关性，而完整细胞甚至透化纤维则能保留这种相关性。本方法中采用基于微孔板的呼吸测定技术，可对每个样本进行重复检测。然而，线粒体必须贴附于每个孔的底部，这种构型不同于其正常所处的环境，可能影响其功能特性。另外需要注意的是，采用本方案进行线粒体分离时，线粒体制备物中仍可能存在内质网（ER）的污染。内质网污染程度的差异可能影响线粒体得率的测定，并对实验结果产生影响。
综上所述，本研究提供的数据证实，采用该方法从组织中分离的线粒体具有功能活性，可用于需要从少量骨骼肌样本中获取高质量分离线粒体的研究或应用。该方法的优势在于：i）能够从极少量的骨骼肌组织中分离线粒体；ii）操作过程快速；iii）借助基于微孔板的技术，可同时处理多个样本；iv）在完成生物能量学检测后，仍有足够的剩余组织和分离线粒体可用于样本保存及其他分子生物学研究。

线粒体是细胞内主要的能量生成场所，在衰老以及多种与年龄相关的疾病（如心血管疾病、阿尔茨海默病、糖尿病、癌症和肥胖）中发挥重要作用。对分离线粒体进行呼吸测定分析可直接评估电子传递链（ETC）功能，显著推动了我们对线粒体生物学及其在健康与疾病中作用的理解。分离的线粒体可用于研究生物能量学的多个方面，例如底物转运、ATP合酶活性、质子漏逸 等等。 本文所述方法已优化，可用于对从人体骨骼肌组织活检样本中分离的线粒体进行呼吸测定分析。本论文所描述的活检方案已被本机构工作人员应用了过去12年。我们的团队已在不同年龄（最高至90岁）且伴有各种慢性疾病的成人受试者中完成了超过700例操作，未发生任何不良安全事件。该方案的一个关键特点是专为利用极少的组织量而设计，从而便于其在临床研究中的应用。
已开发出多种用于分离线粒体的实验方案。Fernandez-Vizarra 等1,2 描述了一种从多种大鼠组织及培养细胞中分离线粒体的方法。Garcia-Cazarin 等3 已有研究报道了一种从大鼠和小鼠骨骼肌中分离线粒体的方法。Iglesias-Gonzales 也报道了一种从大鼠脑组织中分离线粒体的方法。 等4 格罗斯, 等5 报道了一种使用巴氏循环仪和/或PCT破碎仪分离线粒体的方法。最近，Franko 等6 报道了一种使用抗TOM22磁珠分离高度富集线粒体的方法。
尽管这些方案能够获得良好的结果，但与本文所述方法相比，其对组织样本量的需求较大。例如，Gross 等5 使用了1.5–1.8 g的腓肠肌组织以及约2 g的肾组织。同样，Franco 等6 使用了500 mg的小鼠肝组织。根据我们的经验，经皮穿刺针吸活检获取的骨骼肌（股外侧肌）组织通常仅有100–200 mg。本方案能够在20–50 mg的肌肉组织中评估线粒体功能，使研究者可在单次活检样本中进行多项检测，并将剩余样本储存用于后续的其他分子生物学实验。这一特性在临床研究及其他需要高效利用样本的研究中至关重要。需要注意的是，由于线粒体外膜受损以及细胞色素C活性丧失，此前冷冻保存的线粒体不适合用于偶联呼吸的研究。本方法是在Chappell和Perry7发表的方法基础上进行改进和优化而建立的。
根据本文所述方法，我们近期报道了从人体Vastus lateralis分离的线粒体呼吸测定谱与身体功能能力（以步速衡量）呈直接相关性8。

<table><tbody><tr><td>仪器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>均质器 Bio-Gen PRO200</td><td>BioExpress</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 离心机 5804 R</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>深孔板转子&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mm 伦敦大学学院医院针头</td><td>Cadence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 cc 注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔板读板仪</td><td>Tecan (Genios-basic)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 24-3 分析仪</td><td>Seahorse Biosciences, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白凝胶系统</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak Gel Logic 112</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak 相机组件</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>耗材</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XF24 V7 细胞培养微孔板和 XF24 传感器 cartridge</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>100867-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾 (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>盐酸 (HCl)</td><td>Acros</td><td>12421-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's 磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾 (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁 (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>无脂肪酸 BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126575</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>细菌蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P-8038</td><td></td></tr><tr><td>D-甘露醇</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁 (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>PI23227</td><td></td></tr><tr><td>琥珀酸*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>苹果酸*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>2288</td><td></td></tr><tr><td>ADP(K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 盐)*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>XF 细胞线粒体应激检测试剂盒</td><td>Seahorse Biosciences</td><td>101706</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.&amp;nbsp;</td><td>SC-29113</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 12% Bis-Tris 凝胶</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0343BOX</td><td></td></tr><tr><td>Immobilin 转印膜 (0.45 μm)</td><td>Millipore</td><td>IPVH20200</td><td></td></tr><tr><td>MOPS SDS 电泳缓冲液 (20X)-500 ml</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 转印缓冲液 (20X)-1 升</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>一抗 (抗 VDAC1/Porin 单克隆抗体)</td><td>Abcam</td><td>ab14734</td><td></td></tr><tr><td>一抗 (抗 GAPDH 单克隆抗体)</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG (山羊)，HRP 标记</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF822E001EA</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 IgG (山羊)，HRP 标记</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF812E001EA</td><td></td></tr><tr><td>*ADP、琥珀酸、丙酮酸和苹果酸必须仅用 KOH 调节至 pH 7.4&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

经皮穿刺针活检获取的骨骼肌组织中分离线粒体的制备与呼吸测定评估

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

分离线粒体的呼吸测定分析常用于研究电子传递链功能。本文介绍一种获取人类Vastus lateralis（股外侧肌）样本、从少量骨骼肌组织中分离线粒体，并利用细胞外通量（XF）分析仪进行基于微孔板的呼吸测定分析的方法。通过比较使用1.0、2.5和5.0 μg线粒体所获得的呼吸测定谱图，结果表明1.0 μg线粒体已足以检测呼吸活性，而5.0 μg线粒体在标准误比较基础上可提供最一致的结果。对分离线粒体进行蛋白印迹（Western blot）分析，检测线粒体标志物COX IV和非线粒体组织标志物GAPDH，结果显示该实验方案的非线粒体污染有限。仅需20 mg肌肉组织即可开展线粒体呼吸测定研究，使研究者能够在临床研究项目中利用单个活检样本实现多个研究终点的分析。

图1展示了整个实验方案的详细流程图。
COX IV/GAPDH 的 Western 印迹图谱（图 2）显示了线粒体蛋白 COX IV 和非线粒体标志物 GAPDH 的表达情况。在整体肌肉裂解液中，COX IV 和 GAPDH 的表达均清晰可见。采用本方案所述方法分离线粒体后，在相同曝光条件下，COX IV 条带仍然明显，而 GAPDH 则无表达；延长曝光时间可能显示出微弱的 GAPDH 条带。这些印迹结果表明，所分离的线粒体中非线粒体污染极少。此外，不同样本间分离得到的线粒体中 COX IV 的表达具有一致性。
图3展示了使用1.0 μg、2.5 μg和5.0 μg线粒体时，由复合体II（琥珀酸和鱼藤酮）驱动的典型呼吸测定曲线。如预期所示，随着线粒体用量的增加，整体耗氧速率（OCR）也随之升高。本实验测得的呼吸控制比（RCR）为7.95，表明所制备的线粒体质量较高。此外，解偶联态3（state 3u）的OCR略高于态3（state 3），进一步证实了线粒体的良好质量。
为了比较在分析不同数量线粒体时结果的一致性，我们使用每孔分别加入1.0 µg、2.5 µg和5.0 µg线粒体的实验条件进行了方差分析（ANOVA），并计算了平方和（SS）作为实际方差值（图4）。SS值展示了状态2、状态3、状态3u、抗霉素A以及RCR的结果。在状态2和状态3的测量中，单因素方差分析具有统计学显著性（p&lt;0.01 和 p&lt;0.05，分别）。类似地，抗霉素A和RCR的单因素方差分析也具有统计学显著性（p&lt;0.01 和 p&lt;0.0001，分别）。各组之间在状态3u上未观察到显著差异。这些结果表明，每孔5.0 μg的线粒体所产生的SS值最低，相较于其他浓度，是本研究人群在XF 24系统中使用的最佳数量。
图5 用作指南，以指示根据初始肌肉样本量可预期获得的线粒体蛋白量。如预期所示，所处理的肌肉量（mg）与最终样本的总线粒体蛋白含量（mg）之间存在显著相关性。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Chappel-Perry 缓冲液 I (CPI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>化学物质</td>
			<td>浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Chappel-Perry 缓冲液 II (CPII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>化学物质</td>
			<td>浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无脂肪酸 BSA</td>
			<td>0.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">线粒体测定溶液 (MAS) (2X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>化学物质</td>
			<td>浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蔗糖</td>
			<td>35 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>甘露醇</td>
			<td>110 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>1.0 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无脂肪酸 BSA</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">含复合体 II 初始条件的线粒体测定溶液 (MAS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>化学物质</td>
			<td>浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X MAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>琥珀酸</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>鱼藤酮</td>
			<td>2 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">含复合体 I 初始条件的线粒体测定溶液 (MAS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>化学物质</td>
			<td>浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X MAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>丙酮酸</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>苹果酸</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">*所有缓冲液均需使用去离子水配制</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 溶液与缓冲液配方。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">实验步骤</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">开始实验流程</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>操作指令</td>
			<td>时间（分钟）</td>
			<td>通道</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>校准</td>
			<td>0.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>等待</td>
			<td>10.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混匀</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>等待</td>
			<td>3.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混匀</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>等待</td>
			<td>3.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混匀</td>
			<td>0.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>测量</td>
			<td>3.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混匀</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>测量</td>
			<td>3.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混匀</td>
			<td>0.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>注入</td>
			<td></td>
			<td>A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混匀</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>测量</td>
			<td>6.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混匀</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>注入</td>
			<td></td>
			<td>B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混匀</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>测量</td>
			<td>3.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混匀</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>注入</td>
			<td></td>
			<td>C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混匀</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>测量</td>
			<td>3.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混匀</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>注入</td>
			<td></td>
			<td>D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混匀</td>
			<td>1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>测量</td>
			<td>3.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">结束实验流程</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 呼吸计的混合、测量和混合循环设置。
<img alt="线粒体提取步骤流程图；包括活检、蛋白质测定和离心过程。" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 完整实验方案的流程图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="COX IV 和 GAPDH 在粗裂解液与纯化线粒体中的蛋白质印迹比较" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 全骨骼肌组织及分离线粒体的代表性蛋白质印迹图。 全组织提取物和分离的线粒体分别用 COX IV 抗体作为线粒体标记物，以及 GAPDH 抗体作为非线粒体对照进行免疫印迹。在分离的线粒体中未观察到 GAPDH 条带，表明几乎没有或完全没有来自非线粒体来源的污染。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Mitochondrial respiration graph; OCR vs. time, ADP, oligomycin, FCCP, antimycin-A analysis." src="/files/ftp_upload/52350/52350fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 人源线粒体分离后的代表性呼吸测定曲线 股外侧肌. 三种浓度的分离线粒体， 5.0 μg, 2.5 μg，以及 1.0 μg 本实验中使用了以下化合物。加样后各化合物的终浓度为：2 mM ADP（A孔）； 2 μM 寡霉素（B通道）； 6 μM FCCP（C孔）；以及 2 μM 抗霉素A（D孔）。本实验计算的RCR为7.95。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="线粒体呼吸条形图；基础状态、State 3/3u、抗霉素A影响、统计P值。" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 平方和。 使用5.0 μg、2.5 μg和1.0 μg线粒体时，不同线粒体呼吸状态及呼吸控制比（RCR）的平方和。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肌肉与蛋白质相关性分析；散点图显示线性回归，y=mx+c，斜率=0.0062。" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. 本图可用于根据初始肌肉样本重量估算预期获得的线粒体蛋白量。 肌肉量（mg）与总线粒体蛋白产量（mg）的回归分析。如预期所示，肌肉量与获得的总线粒体蛋白量之间存在直接的正相关关系。

本文描述了Vastus lateralis的活检方法、线粒体的纯化制备以及呼吸测定分析。由于所需肌肉样本量小，该技术适用于临床研究应用。

分离线粒体的呼吸测定分析常用于研究电子传递链功能。我们描述了一种获取……的方法

本实验的总体目标是检测从经活检获取的骨骼肌组织中分离出的线粒体的呼吸控制能力。首先通过经皮穿刺针活检法获取少量肌肉组织，随后通过匀浆法从活检所得肌肉中分离线粒体，以此实现上述目标。接下来，通过离心并使样品穿过折叠的纱布，将分离得到的线粒体进行洗涤，并与非线粒体组分分离。最后一步是将分离的线粒体接种至培养板，通过细胞外通量检测进行呼吸测定分析，以观察其耗氧速率。最终，使用Seahorse细胞外通量分析仪检测分离线粒体的呼吸控制状态。该技术相较于现有方法的主要优势在于，仅需低至20毫克的肌肉组织即可完成检测，且可最大限度减少实验间的变异性。这些特点使该技术适用于临床研究应用。该技术的应用意义在于对患者线粒体功能障碍的诊断。该方法的可视化演示至关重要，因为肌肉活检和线粒体分离需要精确的操作，而这些操作通过视觉展示比单纯文字描述更为有效。进行局部活检时，应注射1%利多卡因，并注意避免浸润肌肉组织。随后等待10分钟。为确保充分麻醉，应从肌肉起点与止点之间的中段区域取活检，避免损伤筋膜下区域及肌腱结合部。为实现此操作，首先使用经皮穿刺针，并以筋膜的“弹响”感或筋膜阻力作为进针引导。先用麻醉针估算深度，再用细小的手术刀片探查确认，随后在筋膜上做4至5毫米的切口。将针头穿过切口，直至插入肌肉。在窗口朝向不同方向时采集多个样本。使用60立方厘米的注射器持续抽吸，同时将肌肉样本在经皮针头内前后推进2到4次，方向应各不相同。停止吸引并拔出针头。请助手在穿刺部位施加牢固压力持续五分钟。为实现止血，断开针头与吸引管路的连接，并小心地从针窗和针筒内取出肌肉样本。如果需要更多肌肉组织，可重复此步骤进行第二次取材。使用镊子去除肌肉样本中可见的血凝块。随后称重样本，并立即放入含有冰的离心管中。冰冷的ECCOs磷酸盐缓冲液或DPBS。使用锋利的剪刀和镊子彻底去除样品中可见的结缔组织。用冰冻的DPBS缓冲液彻底清洗标本三到四次。为去除血液，需将样本置于冰冻的DPBS中，并尽快处理。在活检后45分钟内，小心去除肌肉样本中的任何肌腱或脂肪组织。将多余组织的小部分取出，于-80摄氏度保存备用。此样品可用于其他实验，例如蛋白质印迹。立即将肌肉组织切成细小碎片。使用无菌剪刀将其悬浮于500微升至1毫升的Sistine蛋白ACE抑制剂中，例如将nagars溶解于CP1缓冲液中，终浓度为每克组织0.2毫克。将样品切碎至呈现均匀悬浮状态。室温孵育5分钟，随后转移至冰上，并确保匀浆器已彻底清洗。预先用纳加酶处理切碎的组织，然后进行匀浆。使用自动匀浆器。整个过程中保持样品置于冰上。每个组织样品匀浆四次，每次持续两秒。使用自动匀浆仪，将转速设定为 10,000 RPM，将样品放回冰上。在不同组织之间，先用 70% 乙醇清洗探头，再用蒸馏水冲洗。接着，用等体积的 CP1 缓冲液（chapel Perry one 或 CP one 缓冲液）洗涤匀浆后的组织。然后用两倍体积的CP2缓冲液洗涤组织。在另一支锥形管中加水至相同体积，作为平衡管。将内容物收集到离心管中，在4°C条件下以600 ×g离心10分钟。预先将纱布用液体浸润，以确保所有颗粒均可通过，不会被纱布截留。将上清液通过折叠的纱布过滤，收集滤液并弃去沉淀，从而去除大部分非线粒体组分。然后在4°C条件下以10,000 ×g超速离心10分钟。离心后，将沉淀用4毫升CP2缓冲液重悬，随后以相同条件再次离心。弃去上清液，并将沉淀重悬于 2 mL CP one 缓冲液中。此时，从此悬浮液中取出少量等分试样，置于另一支试管中，用于蛋白质浓度测定。将剩余样品在 CP one 缓冲液中重悬，随后离心。与之前相同，注意应在早期离心步骤期间，同时设置含标准品的蛋白板。最后，用最小量的线粒体检测溶液或质量缓冲液重悬最终沉淀。进行 XF 检测，以可视化每分钟每分钟皮摩尔氧气或氧气和 pH 的绝对水平的氧消耗速率（OCR）。在数据输出中。根据文本方案中列出的最终浓度，将化合物以 10 倍浓度加入质量为 X 的板式呼吸计的 A 至 D 孔中。为所需数量的孔准备足量的化合物溶液。利用先前测得的蛋白质计算结果，确定需添加的线粒体浓度。通过在24孔板的每个孔中分别加入1微克、2.5微克和5微克线粒体，滴定确定线粒体的最佳用量，以尽量减少孔间差异。首先将10倍浓缩的线粒体在冰冷的1×质量缓冲液加底物中稀释。接着，向每个孔中加入50 µL该悬浮液。保留四个孔，每孔仅含50 µL缓冲液，用于作为空白对照读数。将预先浸泡的校准板连同之前使用的上部插件一并放入呼吸仪中，以进行仪器校准。为准备测试板运行，将板在4°C条件下以2000 ×g离心20分钟。离心结束后。向每个孔中轻柔加入 450 微升（µL）的 1 倍质量缓冲液，以及琥珀酸盐和腐霉素。在将培养板转移至 XF 分析仪之前，需先在显微镜下观察线粒体，以确保其在孔内均匀贴壁。随后，使用呼吸测定仪实时测量线粒体呼吸，通过本文所示实验方案中提供的呼吸测定仪设置进行程序化操作。此处展示的是典型的呼吸测定曲线，该曲线由复合体 II 驱动，分别使用了 1 微克（µg）、2.5 微克（µg）和 5 微克（µg）的线粒体，结果符合预期。总体而言，线粒体数量越多，氧消耗率（OCR）越高。本实验测得的呼吸控制率（RCR）为 7.95，表明线粒体制备物质量较高，可用于在分析不同数量线粒体、变异体或 Inova 时比较结果的一致性。已进行方差分析，并计算了平方和。平方和（SS）分别呈现为状态 2、状态 3、解偶联状态、抗霉素 A 处理后的状态，以及状态 2 和状态 3 测量值的单向分析结果。Innova组在ANTIMYCIN和RCR方面也具有统计学显著性。各组之间的解耦联状态三无显著差异。这些结果表明，每孔5微克线粒体与其他浓度相比，产生的SS最低。该图用于指导根据初始肌肉样本量预估可获得的线粒体蛋白量。正如预期，所处理的肌肉量与最终样本中的总线粒体蛋白含量之间存在显著相关性。一旦掌握该技术，若操作得当，可在三小时内完成。肌活检术后，需确保患者在接下来的三天内不要服用阿司匹林、布洛芬或其他非处方非甾体类药物，以保证所取活检组织的正常愈合。其次，需确保患者在术后一天半内避免任何剧烈活动，例如剧烈震动类运动，如篮球、蹦床等，但可进行日常正常活动。我们还要求他们在24小时内保持该区域干燥，但若首次沾水，应在淋浴时进行，以确保皮肤上可能残留的任何未被彻底清洁的细菌不会进入切口。观看本视频后，您应能更好地理解如何对骨骼肌组织进行活检、分离线粒体以及测定呼吸控制。

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