了鱼喂食实验室生物测定，从海洋生物的组织评估次生代谢产物的Antipredatory活动

该程序的总体目标是评估来自海洋生物组织的次生代谢物的抗捕食活性。大家好，我是北卡罗来纳大学威尔明顿分校的 Joseph Pollock 博士，研究生 Michael Marty 也加入了我的行列，他是制作这段关于进行生物测定以测试海洋生物组织中化学防御的视频的团队负责人。我们在 1980 年代后期开始开发您将要看到的方法。

当时，天然产物化学家在没有任何实验证据的情况下将生态作用分配给次生代谢物。与此同时，生态学家正在从与生态无关的毒性分析中推断出防御作用。在这里，我们提出了一种旨在评估海洋生物组织中次生代谢物的抗捕食活性的方法。

这种方法满足补料生物测定的四个重要标准。第一，我们使用适当的多面手捕食者。第二，我们从组织中详尽地提取所有极性的有机代谢物。

第三，我们将这些代谢物以与生物体中发现的相同体积浓度放入实验食品中。第四，我们的实验设计和统计方法提供了一个有意义的指标来表示相对令人反感。在这些喂养实验中，我们使用了 fossum 的蓝头 thoma，这是一种适合使用加勒比海洋无脊椎动物组织进行分析的模型掠食性鱼类，因为这种鱼种在加勒比珊瑚礁上很常见，并且已知可以对各种各样的底栖无脊椎动物进行采样。

现在 Michael 将详细描述该协议。首先，必须提取组织。将二氯化物、甲烷和甲醇的一对一混合物加入刻度离心管中，最终体积为 30 mL。

然后从目标生物体上切下组织块。这可以用新鲜或冷冻的组织来完成。我们使用海绵，所以这个电影演示将展示橙色的象耳海绵、alus、plet roadies。

您可能需要切下非常小的组织块以获得正确的体积。使用体积置换法，您可以精确提取 10 毫升组织，盖上试管并倒置，然后在此期间搅拌 4 小时，水与甲醇结合，所得甲醇水相与二氯甲烷相分离。当试管被搅动时，组织交替暴露于每种提取介质中。

在此提取期之后，将有两个不同的阶段很明显。甲醇和水的极性相将使用通过移液器转移位于氯甲烷的非极性相之上。将二氯甲烷提取液从刻度离心管中放入圆底烧瓶中，刻度离心管应存放在冰箱中。

在接下来的几个步骤中，将圆底烧瓶连接到旋转蒸发器上，以完成旋转蒸发仪上的所有步骤。确保水浴的温度保持在 40 摄氏度以下。按照旋转蒸发仪的基本作程序，在圆底烧瓶中干燥二氯甲烷，使用极少量的二氯甲烷重悬干燥的非极性提取物。

一些搅动或涡旋可能有助于从圆底培养瓶的侧面去除干燥的材料。然后将氯甲烷提取物从圆底烧瓶转移到 20 毫升闪烁瓶中。无需将瓶盖放在闪烁瓶上，而是将旋转蒸发器适配器连接到闪烁瓶上，然后再次蒸发至干燥。在旋转蒸发器上，在接下来的几个步骤中，带有干燥的非极性提取物的闪烁瓶可以储存在冰箱中。

回到包含组织和甲醇水提取物的刻度离心管，我们将使用自制仪器，通过压缩将提取介质挤出组织，压缩组织。然后将甲醇水提取物转移到圆底烧瓶中，冷藏在冰箱中。将甲醇加入刻度离心管中，直到组织浸没，进行第二次萃取，持续 2 至 6 小时。

第二次甲醇萃取完成后，从冰箱中取出冷藏的圆底烧瓶，压缩刻度离心管的内容物，然后将这种新的甲醇提取物转移到原来的圆底烧瓶中，其中含有先前的甲醇水提取物。此时，如果担心组织尚未完全提取，可以重复 2 到 6 小时的甲醇提取步骤。将圆底烧瓶连接到旋转蒸发器上，并像以前一样擦干甲醇。

请记住将水浴的温度保持在 40 摄氏度以下。圆底培养瓶中含有水性提取物，必须与 20 mL 闪烁瓶中的干燥非极性提取物混合。因此，将圆底烧瓶的内容物转移到 20 mL 闪烁瓶中。

如有必要，用少量甲醇冲洗圆底瓶，以收集所有剩余的提取物。闪烁瓶现在包含干燥的非极性提取物和极性提取物。然而，极性提取物悬浮在少量液体中。

使用真空浓缩器在小火下蒸发水提取物至干燥。闪烁瓶现在包含 10 毫升组织的干燥粗有机提取物，用染料氮气吹倒样品瓶，并在零下 20 摄氏度的冰箱中储存。为了测试这些组织提取物的适口性，必须首先将它们重构在营养上与目标生物体相当的食物基质中。

鱿鱼外套膜环是无脊椎动物组织生物测定的合适蛋白质来源，可以很容易地制备成冻干粉。为了开始这种生物测定，将鱿鱼外套膜的冷冻环置于温去离子水中。解冻后，倒出一些水，然后将戒指倒入搅拌机中。

高速充分混合，直到鱿鱼外套膜变成粘稠液体。如果材料太厚而无法混合，请添加水。将一层薄薄的液化鱿鱼外套垫倒在浅烤盘上，然后均匀涂抹。

将烤盘放入零下 20 摄氏度的冰箱中。冷冻鱿鱼片必须掰成小块，以促进冻干过程。较小的块更好，因为它们会更快地变干。

在冷冻干燥机中。将碎碎的冷冻鱿鱼片放入腔室中，并按照冷冻干燥机的作程序进行作。冻干后，鱿鱼片必须粉碎。

这可以通过搅拌机完成。将鱿鱼干片放入搅拌机中，高速运行，直到材料呈现均匀的粉末。下一步应在通风橱中进行，以减少吸入颗粒鱿鱼粉尘。

将冻干鱿鱼粉倒入旋转花筛中。将容器放在筛子下方，以捕获通过筛子的粉末。旋转曲柄以筛除冻干鱿鱼材料。

在前面步骤中未充分混合的大块结缔组织将保留在筛子中，必要时使用漏斗产生更细的粉末，将冻干鱿鱼粉转移到可密封容器中，用染料氮气吹扫并冷冻储存在零下 20 摄氏度。准备好冻干鱿鱼外套粉后，我们现在准备制作一批分析食品混合物。当在同一天进行多次连续分析时，制作大批量的食物混合物是可行的。

在这里，我们演示了 100 毫升体积混合物的制备过程，使用干净的乳清船，将 3 克海藻酸和 5 克冻干鱿鱼外套膜粉制成。在加水之前，将这些干原料放入 150 毫升烧杯中。用微刮刀轻轻搅拌干原料，帮助它们混合在一起。

加入 100 毫升去离子水并剧烈搅拌。可能需要几分钟才能使粉末完全水合。在完成此步骤之前，请确保您的混合物均匀。

如果您选择将食物基质染成一种一致的颜色，请在此步骤中添加彩色染料。在刻度注射器中装入 10 毫升食物混合物。在此步骤中，体积精度至关重要，因此要格外小心，避免包含气泡。

从冰箱中取出装有干燥粗有机提取物的 20 mL 闪烁瓶，加入一两滴甲醇。不要添加过多的甲醇。这将防止食物基质建立。

使用微刮刀和最少的溶剂将提取物重悬到均匀的混合物中。请务必刮擦样品瓶的侧面，以确保整个提取物被重悬。将装有 10 毫升食品基质的注射器弹出到装有重悬匀浆提取物的 20 毫升闪烁瓶中。

用微刮刀搅拌这种混合物，直到它变得均匀。加载非常小体积的提取物混合物。一毫升装进注射器就足够了。

将注射器尖端浸入 0.25 摩尔氯化钙溶液中，然后弹出注射器的内容物，形成一条长长的意大利面状股线。链在此溶液中会变硬。几分钟后，去除硬化的股线并将其放在玻璃砧板上。

使用剃须刀片将股线切成四毫米长的颗粒。收集经过提取物处理的颗粒并在海水中冲洗。制备对照颗粒。

遵循相同的程序，不添加任何组织提取物。可能需要添加食用色素以匹配对照和处理颗粒的颜色。准备一个阴性对照，鱼肯定会拒绝吃。

如米勒和波洛克所述，将地炎和苯甲酸盐粉以每毫升 2 毫克的浓度添加到生食混合物中。2013 年，进行饲喂测定 用野生捕获的黄相蓝头 RAs 鱼将 thala 以三人一组保存在实验室水族箱的不透明侧面隔间中。用于输送食物颗粒的合适器具是带有橡胶球的玻璃移液器。

如果鱼很容易食用颗粒，则认为颗粒是可以接受的。如果一条或多条鱼在至少三次尝试将其带入口腔后仍未食用颗粒，则认为该颗粒被排斥。或者，如果在一次这样的尝试后接近并忽略了颗粒。

在分析中不得考虑拒绝食用对照颗粒的不合作鱼群。该流程图显示了在所有情况下的检测程序都从对照颗粒开始，以确认该组鱼是合作的。提供经过处理的颗粒。

如果鱼接受了处理过的颗粒，则该样本被评分为已接受。如果鱼拒绝处理过的颗粒，则必须提供后续控制以确认鱼是否已停止摄食。如果鱼接受后续的对照颗粒，则样品被评分为不合格。

每个样品必须与 10 组独立的鱼一起运行。这是这种饲喂测定的示例运行。首先，向鱼提供对照颗粒，让鱼接受对照颗粒。

其次，提供经过处理的颗粒。在这种情况下，鱼会拒绝处理过的颗粒。因此，必须提供后续的对照沉淀。

鱼接受后续控制，样品可能被评分为不合格。每个样品必须与 10 组独立的鱼一起运行。对照与处理颗粒消耗量差异的显着性应使用 Low 和 Pollock 2014 提出的 Fisher 精确检验的修改版本进行评估。

对测试进行修改，以便对照和处理的颗粒的边际总数是固定的，将它们都视为随机样品。当吃掉 7 个颗粒时，这提供了等于 0.057 的 P 值。因此，如果食用了 6 个或更少的颗粒并且可口，则任何提取物都被认为是具有威慑力的。

如果吃了 7 个或更多颗粒。在比较提取物组之间的适口性时，应使用食用的平均颗粒数，如代表性结果所示。在这里，我们报告了六种常见加勒比海绵的生物测定结果。

这些数据最初由 Pollock 等人于 1995 年发表，并证明了这种方法在阐明共存分类群之间化学防御策略差异方面的能力。Y 轴上的每个类别代表一种海绵的提取物。对每个物种的几个个体进行采样、提取和测试，用物种名称后面括号中的数字表示。

结果报告为食用的平均食物颗粒数加上每个物种的标准误差。在用来自 alus、pleth、pheon、compressor 和 lycine 的粗有机提取物（称为 foris）的分析中，几乎没有吃掉颗粒。相比之下，用 Vais 的 Cali 海绵提取物制成的颗粒。

Geo Osa 和 Michel lavis 在测定中很容易食用。前三个物种吃掉的颗粒少于 6 个，因此它们可能被认为具有显着的威慑力。相比之下，后三个物种与对照没有显著差异，它们可能被认为是可口的。

刚刚演示的方法为研究反掠夺性化学防御系统以及纵性现场实验和调查提供了一种强大的方法。这些生物测定的结果帮助我的研究小组了解控制加勒比珊瑚礁上海洋无脊椎动物分布和丰度的因素。重要的是，这种方法满足了化学生态学之外的化学生态学相关性的需求。

这些生物测定的结果可能为不同研究领域的研究提供信息，包括药理学、生物技术和进化生态学。