Name: 了鱼喂食实验室生物测定，从海洋生物的组织评估次生代谢产物的Antipredatory活动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 3 s
Description: 了解利用模式捕食性鱼类评估海洋生物组织中有机提取物抗捕食活性的生物测定方法。该技术为海洋化学生态学中次生代谢产物的生态功能提供实验证据。

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感谢 James Maeda 和 Aaron Cooke 在本视频拍摄与剪辑过程中提供的帮助。本研究由美国国家科学基金会（OCE-0550468，1029515）提供资助。

注意：本方案的第3步涉及脊椎动物实验对象。该操作程序的设计旨在尽可能对动物实施最人道的处理，并已获得北卡罗来纳大学威尔明顿分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1）组织提取
<ol>
	<li>使用处于自然含水状态的组织，避免挤压、干燥或过度湿润，因为这些情况会改变次生代谢产物的体积浓度。将组织切成小块或薄片，以便插入50 ml离心管中。注意：某些情况下可使用新鲜组织，但通常更建议切割或切碎冷冻组织，因其在切割时不易被挤压。</li>
	<li>在带刻度的离心管中加入组织块，并加入30 ml二氯甲烷（DCM）与甲醇（MeOH）按1:1比例配制的混合溶剂，直至总体积达到40 ml。所有涉及溶剂转移的操作均须在通风良好的通风橱中进行。</li>
	<li>盖紧管盖，反复倒置数次，并在4小时提取期间反复振荡。注意：在此过程中，水与MeOH混合，形成的MeOH:水相与DCM相分离。随着离心管振荡，组织交替暴露于DCM相和作为乳液存在的MeOH:水相中。</li>
	<li>将DCM提取液转移至圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪上用低温（&#60;40 °C）蒸干。使用最少溶剂将干燥提取物转移至20 ml闪烁小瓶中。为小瓶安装旋转蒸发仪适配器，再次在旋转蒸发仪上用低温（&#60;40 °C）蒸干。 
	注意：下一步需要使用一种自制压缩装置，可通过将以下部件依次拧到螺纹杆末端组装而成：(1) 螺母，(2) 垫圈，(3) 圆顶螺母。垫圈必须带孔或尺寸小于50 ml离心管的内径。</li>
	<li>回到含有组织和MeOH:水提取液的带刻度离心管，通过压缩将提取液从组织中挤出。将MeOH:水提取液转移至同一圆底烧瓶中，并冷藏保存（&#60;10 °C）。</li>
	<li>向带刻度离心管中加入MeOH，使已脱水的组织完全浸没，进行第二次提取，持续2至6小时，然后将新的MeOH提取液转移至含有MeOH:水提取液的冷藏圆底烧瓶中。若怀疑组织未被充分提取，可重复2至6小时的MeOH提取步骤。</li>
	<li>在旋转蒸发仪上用低温（&#60;40 °C）除去MeOH。用最小体积的MeOH冲洗圆底烧瓶，将剩余的水相提取物转移至含有干燥非极性提取物的闪烁小瓶中。</li>
	<li>在真空浓缩仪上用低温（&#60;40 °C）将水相提取物蒸干。此时闪烁小瓶中含有10 ml组织的总干燥粗有机提取物。用N2气体置换小瓶顶部空间以防止氧化，密封后冷冻保存（-20 °C）。</li>
</ol>
2）食物制备
<ol>
	<li>制备冻干鱿鱼胴体粉。 
	注意：鱿鱼外套膜提供的营养成分与其他底栖无脊椎动物相当，将在2.2步骤的子步骤中用作成分。
	<ol>
		<li>在温热的去离子（DI）水中解冻冷冻的鱿鱼外套膜环，然后用高速搅拌机打成匀浆。</li>
		<li>将切碎的鱿鱼外套膜倒入浅烤盘中，铺成薄层，于-20 °C冷冻，随后将冻结的鱿鱼匀浆薄片打碎成小块，用于冻干。</li>
		<li>按照冻干机的操作规程，对冷冻的鱿鱼外套膜糜进行冻干。</li>
		<li>将鱿鱼外套膜冻干粉在高速搅拌机中研磨成粉末。</li>
		<li>在通风橱中，将鱿鱼外套膜粉末倒入旋转面粉筛中过筛，以分离组织大块与细粉。</li>
		<li>将研磨成细粉的鱿鱼外套膜转移至可密封的容器中。用 N₂ 抽除容器顶部空间的空气2 气体以防止氧化，并在 -20 °C 冷冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备食物混合物。 
	注意：进行多个连续实验时，制备约 100 ml 食物混合物较为方便，但如有需要，此配方也可按比例缩小体积。
	<ol>
		<li>将3 g海藻酸和5 g冷冻干燥的鱿鱼外套膜粉末混合，加入100 ml去离子水至150 ml烧杯中。用微型刮勺剧烈搅拌数分钟，直至粉末充分水合且混合物均匀。 
		注意：如有需要，可在该步骤加入食用色素：将染料添加到将用于制备处理组和对照组的饲料混合物中更为方便（可掩盖提取物处理组中提取物的天然色素），而不是通过向对照组添加染料来匹配提取物处理组的颜色。通常建议使用绿色或棕色的食用色素，以掩盖粗提物中的任何色素。</li>
		<li>将恰好10 ml的食物混合物装入刻度注射器中。操作过程中注意避免混入气泡。</li>
		<li>从冰箱中取出装有干燥粗有机提取物的20 ml 闪烁瓶。加入一至两滴甲醇，然后用微型刮勺将提取物搅拌成均匀的混合物。</li>
		<li>将装有10 ml食品基质的注射器推出至20 ml闪烁瓶中，并用微型刮勺搅拌，使提取处理后的食品混合物均匀。 
		注意：可分次少量推出注射器内的液体（即，推出2 ml并进行匀浆，然后重复操作，直至全部10 ml完成匀浆。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备检测用颗粒。
	<ol>
		<li>将极小体积的提取混合物（约1 ml）吸入注射器中，将注射器针头浸入0.25 M CaCl₂溶液中2推出注射器中的内容物，形成一条细长的、类似意大利面的丝状物。</li>
		<li>数分钟后，取出已硬化的条状物，在玻璃切板上用剃刀将其切成长度为 4 mm 的小段，然后用海水冲洗。</li>
		<li>重复步骤 2.3.1 和 2.3.2，但不加入组织提取物，以制备对照组沉淀。务必向对照组沉淀中加入与溶剂等体积的溶液，以控制溶剂添加的影响（参见步骤 2.2.3 中向处理混合物中添加甲醇的操作）。若需设置阴性对照以确认实验鱼类可被抑制摄食，可加入苯甲地那铵，浓度为 2 mg/ml-1 到生食混合物中27.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3) 适口性生物测定
<ol>
	<li>使用实验室水族箱中不透明侧壁的隔间内群体饲养（每组三条）的野生黄色型蓝头濑鱼（Thalassoma bifasciatum）进行摄食实验。</li>
	<li>使用带橡胶吸头的玻璃移液管，从盛有海水的烧杯中递送饲料颗粒。注意：可能需要数天时间训练鱼类以这种方式摄取食物。在投喂前施加条件化刺激（例如，用移液管轻敲水族箱玻璃数次），可能有助于训练鱼类预期饲料颗粒的投放。</li>
	<li>饲料颗粒评分标准：若鱼类迅速摄食，则视为接受该颗粒；若一条或多条鱼至少三次尝试将其送入口腔但未成功摄食，或仅接近但忽略该颗粒一次以上，则视为拒绝该颗粒。</li>
	<li>样品评分标准。注意：实验流程以流程图形式展示于图1中。在实验任一阶段拒绝摄食对照颗粒的鱼群组将不再纳入后续分析。单次实验运行有两种可能结果：样品被接受或被拒绝。
	<ol>
		<li>首先提供对照颗粒，以确认鱼群处于合作状态。随后提供处理过的颗粒。若鱼群接受处理颗粒，则记该样品为“接受”；若鱼群拒绝处理颗粒，则再提供一个后续对照颗粒，以判断鱼群是否已停止摄食行为。若鱼群接受了后续对照颗粒，则记该样品为“拒绝”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复实验。每种提取物需使用十组独立的鱼群重复实验流程。</li>
</ol>
4) 评估显著性
<ol>
	<li>使用 Fisher 精确检验的改进版本26评估对照组与处理组颗粒摄食量差异的显著性。修改该检验方法，使对照组和处理组颗粒的边缘总数固定，并将两者均视为随机样本。注意：当摄食颗粒数为 7 时，该检验给出 p = 0.057；因此，若摄食颗粒数为 6 或更少，则认为该提取物具有拒食效应；若摄食颗粒数为 7 或更多，则认为其可食。</li>
	<li>为比较不同提取物组之间的相对适口性，计算每组内摄食颗粒数的平均值。将阈值保持在 6 颗颗粒，因此若某组重复提取物的平均摄食颗粒数加标准误（SE）≤6，则认为该组具有拒食效应。注意：在代表性结果中，分组依据为物种，因此重复提取物来自不同个体，可在物种间比较其相对适口性。</li>
</ol>

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<li>Pawlik, J. R., McFall, G., Zea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+the+odor+from+sponges+of+the+genus+Ircinia+protect+them+from+fish+predators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Does the odor from sponges of the genus Ircinia protect them from fish predators.</a> Journal of Chemical Ecology. 28 (6), 1103-1115 (2002).</li>
<li>Waddell, B., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defenses+of+Caribbean+sponges+against+invertebrate+predators.+I.+Assays+with+hermit+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Defenses of Caribbean sponges against invertebrate predators. I. Assays with hermit crabs.</a> Marine Ecology Progress Series. 195, 125-132 (2000).</li>
<li>Waddell, B., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense+of+Caribbean+sponges+against+invertebrate+predators.+II.+Assays+with+sea+stars%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars.</a> Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).</li>
<li>Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J. R., Ilan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+anti-predatory+defenses+of+Red+Sea+and+Caribbean+sponges.+I.+Chemical+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Comparison of anti-predatory defenses of Red Sea and Caribbean sponges. I. Chemical defense.</a> Marine Ecology Progress Series. 252, 105-114 (2003).</li>
<li>Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+for+defensive+synergy+in+Caribbean+sponges%3A+Bad+taste+or+glass+spicules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322 (1), 67(2005).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文所述方法提供了一种相对简单且具有生态相关性的实验室方案，用于评估海洋生物的抗捕食化学防御机制。以下是该方法体系所满足的重要标准：
（1）合适捕食者。 本摄食实验采用蓝头濑鱼（Thalassoma bifasciatum），这是广泛分布于加勒比海珊瑚礁中最常见的鱼类之一。蓝头濑鱼是一种广食性肉食性鱼类，已知会摄食多种底栖无脊椎动物19。在初步实验中，广食性捕食者是最佳选择，因为珊瑚礁上大多数捕食性鱼类均为广食性种类，因此可预期抗捕食防御机制主要针对这类捕食者，而非可能已进化出克服防御机制的专食性捕食者。在实验室中利用单一潜在捕食者进行化学防御筛选后，通常还需开展更为耗时且复杂得多的野外实验，后者依赖于在自然条件下全部潜在捕食者群落的反应情况28-33。
（2）提取步骤。 第一步组织提取使用等体积的二氯甲烷（DCM）和甲醇（MeOH）混合溶剂，可快速渗透组织，溶解膜结构并使细胞物质脱水。经过此步骤后，组织已被脱水，因此后续步骤使用...

化学生态学是化学家与生态学家合作发展的成果。尽管陆地化学生态学作为一门分支学科已存在较长时间，而海洋化学生态学仅有数十年历史，但它已为海洋生物的进化生态学和群落结构研究提供了重要见解1-8。得益于水肺潜水（SCUBA）和核磁共振（NMR）光谱技术的兴起，有机化学家在20世纪70年代和80年代迅速发表了大量文献，报道了来自底栖海洋无脊椎动物和藻类的众多新颖代谢物9。这些研究普遍假设次级代谢产物必然具有某种生物学功能，因此许多文献在缺乏实验证据的情况下，便将生态学上的重要功能归因于新发现的化合物。与此同时，生态学家也借助水肺潜水技术的发展，开始描述以往仅通过效率较低的采样方法（如拖网）所获知的底栖动植物的分布与丰度。这些研究者的假设是，任何固着生活且身体柔软的生物必然依赖化学防御机制以避免被捕食者取食10。为了将实证性引入原本以描述物种丰度为主的生态学研究中，一些生态学家开始从毒性测试结果推断化学防御能力11。大多数毒性测试涉及将整条鱼类或其他生物暴露于无脊椎动物组织的粗提有机提取物的水相悬浮液中，随后测定导致一半测试生物死亡的干重浓度。然而，此类毒性测试并不能模拟潜在捕食者在自然条件下感知猎物的方式，后续研究也发现毒性与适口性之间并无关联12-13。令人惊讶的是，一些发表在知名期刊上的研究采用了生态相关性极低甚至毫无相关性的技术手段14-15，而这些研究至今仍被广泛引用。更令人担忧的是，基于毒性数据的研究至今仍在持续发表16-18。本文所述的生物测定方法于20世纪80年代末期开发，旨在为海洋化学生态学家提供一种具有生态相关性的评估抗捕食化学防御能力的方法。该方法要求使用一种模式捕食者，在营养成分相似的食物基质中，以自然浓度摄取目标生物的粗提有机提取物，从而获得比毒性数据更具生态学意义的适口性数据。
评估海洋生物组织抗捕食活性的总体方法包括四个重要标准：（1）在摄食实验中必须使用合适的广食性捕食者，（2）必须将目标生物组织中所有极性的有机代谢物进行彻底提取，（3）必须将这些代谢物以与其来源生物体内相同的体积浓度混入营养适宜的实验食物中，（4）实验设计和统计分析方法必须提供有意义的指标，以反映相对的难食性。
以下所述实验方案专用于评估加勒比海海洋无脊椎动物的抗捕食化学防御机制。我们采用蓝头濑鱼（Thalassoma bifasciatum）作为模式捕食性鱼类，因为该物种在加勒比海珊瑚礁中广泛分布，且已知会摄食多种底栖无脊椎动物19。首先提取目标生物的组织，然后将其与食物混合物结合，最后提供给多组 T. bifasciatum，以观察其是否拒绝摄食经提取物处理的食物。利用该方法获得的检测数据，已为深入了解海洋生物的防御化学机制12,20-21、生活史权衡关系22-24以及群落生态学25-26提供了重要依据。

<table><tbody><tr><td>二氯甲烷</td><td>Fisher Scientific</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A41220</td><td></td></tr><tr><td>无水氯化钙</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-500</td><td></td></tr><tr><td>低温冷却传热液</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-548-146</td><td>用于真空浓缩仪</td></tr><tr><td>高黏度海藻酸钠</td><td>MP Biomedicals</td><td>154723</td><td></td></tr><tr><td>鱿鱼胴体环</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>可在杂货店购买</td></tr><tr><td>苯甲地那铵</td><td>Aldrich</td><td>D5765</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 带刻度离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>20 ml 闪烁瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7</td><td></td></tr><tr><td>一次性巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管用橡胶吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>用于沉淀递送的红色吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-27</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 圆底烧瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-067E</td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪用闪烁瓶适配器</td><td>Fisher Scientific</td><td>K747130-1324</td><td></td></tr><tr><td>称量舟</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202B</td><td></td></tr><tr><td>微型药匙</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 带刻度注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-53</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 带刻度注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-54</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17302</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于评估海洋生物组织中次级代谢产物抗捕食活性的鱼类摄食实验室生物测定法

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

海洋化学生态学是一门新兴学科，起源于20世纪80年代天然产物化学家与海洋生态学家的合作，旨在研究海洋生物组织中次级代谢产物的生态功能。这一合作推动了一系列实验方法的不断改进，使其生态相关性日益增强。本文介绍了目前最新版本的鱼类摄食实验室生物测定法，该方法可使研究人员评估海洋生物组织中次级代谢产物的抗捕食活性。将目标生物组织中各种极性的有机代谢物进行完全提取，并在营养适宜的食物基质中重新配制成自然浓度。在实验室摄食实验中，将制备的实验性食物颗粒提供给广食性捕食者，以评估提取物的抗捕食活性。本文所述方法采用蓝头鱼（Thalassoma bifasciatum）来测试加勒比海海洋无脊椎动物的适口性；然而，该实验设计可轻松适用于其他系统。利用该实验室生物测定获得的结果，对于依赖全部潜在捕食者摄食反应的野外实验具有重要的前期指导意义。此外，该生物测定还可用于通过生物测定导向的分级分离方法，定向分离出摄食抑制性代谢物。该摄食生物测定法深化了我们对控制加勒比海珊瑚礁上海洋无脊椎动物分布与丰度因素的理解，并可能为药理学、生物技术及进化生态学等多个研究领域提供重要启示。

本文报告了该生物测定法对六种常见加勒比海海绵物种的测定结果（图2）。这些数据最初由Pawlik et al.12于1995年发表，展示了该方法在调查共存分类群之间化学防御策略差异方面的有效性。结果以每种海绵物种被取食的食物颗粒平均数加标准误（SE）表示。在含有Agelas clathrodes、Amphimedon compressa和Aplysina cauliformis粗有机提取物的实验中，几乎未发生取食。相比之下，含有Callyspongia vaginalis、Geodia gibberosa和Mycale laevis提取物的颗粒在实验中被迅速取食12。前三种海绵对应的颗粒被取食数少于6个，因此被认为具有显著的拒食效应；而后三种海绵的取食量与对照组无显著差异，被视为可被取食。
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本生物测定法采用一种模式捕食性鱼类，通过营养成分相似的食物基质，检测海洋生物组织有机提取物中天然浓度下的摄食抑制代谢物的存在。

海洋化学生态学是一门年轻的学科，20世纪80年代由天然产物化学家与海洋生态学家合作而兴起，其……

本实验的总体目标是评估海洋生物组织中次级代谢产物的抗捕食活性。大家好，我是北卡罗来纳大学威尔明顿分校的 Joseph Pollock 博士，与我一同参与的是研究生 Michael Marty，他作为团队负责人，主导完成了本视频的制作，用于展示如何开展生物测定实验，以检测海洋生物组织中的化学防御物质。我们自20世纪80年代末期开始建立您即将看到的这些实验方法。当时，天然产物化学家在没有实验依据的情况下，为次级代谢产物分配生态功能。与此同时，生态学家则从缺乏生态相关性的毒性检测结果中推断出防御作用。本文介绍了一种旨在评估海洋生物组织中次级代谢产物抗捕食活性的研究方法。该方法满足了生物测定喂养实验的四个重要标准。第一，我们使用了合适的广食性捕食者。第二，我们从组织中全面提取了所有极性的有机代谢物。第三，我们将这些代谢产物以与生物体内相同的体积浓度加入实验食物中。第四，我们的实验设计和统计方法提供了一个有意义的指标，用于表示相对的难吃程度。在这些摄食实验中，我们使用蓝头托马鱼（Thoma by fossum），这是一种适用于利用加勒比海海洋无脊椎动物组织进行检测的模式捕食性鱼类，因为该鱼种常见于加勒比海珊瑚礁，并且已知会摄食多种底栖无脊椎动物。现在由 Michael 详细描述该实验方案。首先，必须提取组织。向量筒形离心管中加入二氯甲烷与甲醇按1:1比例混合的溶液，定容至30毫升。然后从目标生物体上切取组织块。可以使用新鲜或冷冻的组织进行操作。我们研究的是海绵动物，因此本视频演示将以橙色象耳海绵（Alus, Plet roadies）为例。可能需要切割非常小的组织块以获得准确的体积。通过体积排液法，可精确提取10毫升组织，盖紧管盖后倒置，然后振荡四小时；在此期间，水与甲醇结合，形成的甲醇水相与二氯甲烷相分离。在振荡过程中，组织交替接触每种提取介质。经过此提取过程后，将出现两个明显的相层。甲醇和水的极性相将位于氯甲烷的非极性相之上，使用移液管进行转移。将分液漏斗中的二氯甲烷提取物转移至圆底烧瓶中，而刻度离心管应保存在冰箱中。在接下来的步骤中，将圆底烧瓶连接至旋转蒸发仪，所有在旋转蒸发仪上进行的操作均需如此。确保水浴温度始终保持在40摄氏度以下。按照旋转蒸发仪的基本操作规程，将圆底烧瓶中的二氯甲烷干燥，然后用极少量的二氯甲烷重新溶解干燥后的非极性提取物。轻微振荡或旋转可能有助于将干燥的物质从圆底烧瓶的瓶壁上移除。然后将圆底烧瓶中的氯甲烷提取物转移至一个20毫升的闪烁小瓶中。不要将瓶盖盖在闪烁小瓶上，而是将旋转蒸发仪接头连接到闪烁小瓶上，并再次使用旋转蒸发仪蒸发至干燥。含有干燥非极性提取物的闪烁小瓶可在接下来的几个步骤期间存放在冰箱中。回到含有组织和甲醇水提取液的刻度离心管，我们将使用一种自制装置，通过压缩将提取介质从组织中挤出，压紧组织。然后将甲醇水提取液转移至圆底烧瓶中，并在冰箱中冷藏保存。向刻度离心管中加入甲醇，直至组织完全浸没，进行第二次提取，提取时间为2至6小时。第二次甲醇提取完成后，将冷却的圆底烧瓶从冰箱中取出，压紧刻度离心管中的内容物，并将此次新的甲醇提取液转移至最初的圆底烧瓶中，该烧瓶内含有先前的甲醇水提取液。此时，若怀疑组织尚未完全提取，可重复进行两到六小时的甲醇提取步骤。将圆底烧瓶连接至旋转蒸发仪，同前法蒸发除去甲醇。注意保持水浴温度低于40摄氏度。圆底烧瓶中含有水相提取物，需将其与20毫升闪烁瓶中的干燥非极性提取物混合。因此，将圆底烧瓶中的内容物转移至20毫升闪烁瓶中。如有必要，用少量甲醇冲洗圆底烧瓶，以收集所有残留的提取物。此时，闪烁小瓶中含有干燥的非极性提取物和极性提取物。然而，极性提取物悬浮在少量液体中。使用真空浓缩仪在低温下将水相提取物蒸发至干燥。此时闪烁瓶中含有10毫升组织的干燥粗有机提取物，用染料氮气吹扫该小瓶后，于-20摄氏度冰箱中保存。为了测试这些组织提取物的适口性，必须首先将其重新溶解于在营养成分上与目标生物体相近的食物基质中。鱿鱼外套膜环是无脊椎动物组织生物测定中合适的蛋白质来源，可轻松制备成冻干粉末。开始本生物测定时，将冷冻的鱿鱼外套膜环置于温热的去离子水中。待其解冻后，倒去部分水分，将外套膜环倒入搅拌机中。高速充分搅拌，直至鱿鱼外套膜变为黏稠液体。若混合物过稠无法搅拌，可加入水。将液化的鱿鱼外套膜倒入浅烤盘中，铺成一层薄薄的均匀液层。将烤盘放入零下20摄氏度的冰箱中冷冻。为了便于冻干，必须将冷冻的鱿鱼片打碎成较小的碎片。碎片越小越有利于加快干燥速度。在冷冻干燥机中。将冷冻的鱿鱼碎块放入干燥室，按照冷冻干燥机的操作规程进行操作。冻干完成后，必须将鱿鱼块研磨成粉末。此步骤可使用搅拌机完成。将干燥的鱿鱼块放入搅拌机中，高速搅拌直至材料呈均匀的粉末状。下一步应在通风橱中进行，以减少吸入鱿鱼颗粒粉尘。将冻干鱿鱼粉倒入旋转花筛中。在筛子下方放置一个容器，以接住通过筛网的粉末。旋转手柄，对冻干鱿鱼材料进行过筛。在之前步骤中未充分混合的较大结缔组织条会残留在筛子中，必要时可使用漏斗，从而获得更细的粉末。将冷冻干燥的鱿鱼粉转移至可密封容器中，用高纯氮气吹扫，于零下20摄氏度冷冻保存。在制备好冷冻干燥的鱿鱼外套膜粉末后，我们现在可以配制一批检测用食物混合物。若在同一天连续进行多次检测，配制大量食物混合物是较为高效的做法。此处我们演示制备 100 毫升体积混合液的过程：使用洁净的称量船称取 3 克海藻酸和 5 克冷冻干燥的鱿鱼外套膜粉末。将这些干成分加入 150 毫升烧杯中，然后加水。用微型刮刀轻轻搅拌干成分，以助其混合均匀。加入 100 毫升去离子水并剧烈搅拌。粉末完全水合可能需要几分钟时间。在进入下一步之前，请确保已形成均匀的混合物。如果选择将食物基质染成单一均匀的颜色，可在该步骤加入染色剂。用刻度注射器准确加载 10 毫升食物混合物。此步骤对体积精度要求极高，因此需格外小心，避免混入气泡。从冰箱中取出装有干燥粗有机提取物的20毫升闪烁瓶，加入一至两滴甲醇。切勿加入过多甲醇，以免食物基质凝固。使用微量刮勺并加入少量溶剂，将提取物重新悬浮成均匀的混合液。务必刮取离心管内壁，以确保全部提取物均被重新悬浮。将含有10毫升食品基质的注射器注入装有重新悬浮的均质提取物的20毫升闪烁瓶中。用微型刮勺搅拌此混合物，直至其均匀。吸取极少量的提取混合物，一毫升已足够，注入注射器中。将注射器尖端浸入0.25摩尔的氯化钙溶液中，推出注射器内的内容物，形成一条类似意大利面的长丝状物。该丝状物在此溶液中会硬化。数分钟后，取出已硬化的丝状物，平铺在玻璃切板上。使用剃须刀片将纤维切成长度为 4 毫米的颗粒。收集经提取物处理的颗粒，并用海水冲洗。用于制备对照颗粒。采用相同的步骤操作，但不添加任何组织提取物。可加入食用色素，以使对照组和处理组的颗粒颜色一致。制备鱼类必定会拒绝摄食的阴性对照。按照 Miller 和 Pollock（2013）所述，将 deton 和苯甲酸粉末以每毫升 2 毫克的浓度添加到生食混合物中。取野外捕获的黄色型蓝头鱼（Thalassoma bifasciatum）进行摄食实验，鱼体以每组三条的方式饲养于实验室水族箱中不透明侧壁的隔间内。用于投喂饲料颗粒的合适工具是带有橡胶吸球的玻璃移液管。如果鱼 readily 摄食，则认为颗粒饲料被接受。如果一条或多条鱼至少尝试三次仍未能将其摄入口中，或仅接近并尝试一次后即忽略未食用，则认为颗粒饲料被拒绝。拒绝摄食对照颗粒的不合作鱼群不得纳入检测。该流程图展示了所有情况下检测程序均以对照颗粒开始，以确认鱼群处于合作状态。随后提供处理过的颗粒。如果鱼类接受了处理过的颗粒，则该样本记为“接受”。如果鱼类拒绝了处理过的颗粒，则必须提供后续的对照颗粒，以确认鱼类是否已停止摄食。如果鱼类接受了后续的对照颗粒，则该样本记为“拒绝”。每个样本必须使用10个独立的鱼群进行实验。以下为该摄食实验的一个示例运行过程：首先，向鱼类提供对照饲料颗粒，鱼类接受了对照饲料颗粒。其次，提供经过处理的颗粒饲料。在此情况下，鱼类会拒绝摄食该处理过的颗粒，因此必须再次提供对照颗粒饲料。鱼类接受后续对照，该样本可被记为拒绝。每个样本必须使用10个独立的鱼群进行测试。对照组与处理组颗粒饲料摄食量差异的显著性应采用Low和Pollock（2014年）提出的Fisher精确检验的改良版本进行评估。该检验经过修改，将对照组和处理组颗粒的边缘总数固定，视两者均为随机样本。当有7个颗粒被食用时，此方法提供的P值等于0.057。因此，若食用的颗粒数为6个或更少，则认为该提取物具有拒食作用，且颗粒可食。如果摄食了七个或更多颗粒。在比较不同提取物组的适口性时，应使用摄食颗粒的平均数量，代表性的结果将展示这一点。本文报道了六种常见加勒比海海绵物种的该生物测定结果。这些数据最初由 Pollock 等人于 1995 年发表，展示了该方法在阐明共存分类群之间化学防御策略差异方面的强大能力。Y 轴上的每个类别代表来自单一海绵物种的提取物。每个物种均采集了多个个体进行提取和测试，物种名称后括号中的数字表示样本数量。结果以每种物种摄食的食物颗粒平均数加标准误表示。在使用来自 alus、pleth、pheon、compressor 和 lycine 的粗有机提取物（称为 foris）的检测中，几乎未观察到颗粒被摄食。相比之下，含有 Vais 的 Cali 海绵提取物制成的颗粒则被摄食。Geo Osa 和 Michel lavis 在实验中被迅速摄食。前三种物质每种被食用的颗粒少于六个，因此可认为具有显著的驱避作用。相比之下，后三种物质与对照组相比无显著差异，可认为是可食的。上述演示的方法为研究抗捕食化学防御提供了强有力的手段，可与操控性野外实验和调查相结合。这些生物测定的结果帮助我的研究团队理解了控制加勒比海珊瑚礁上海洋无脊椎动物分布与丰度的因素。重要的是，该方法满足了化学生态学之外对生态相关性的需求。这些生物测定的结果可为药理学、生物技术以及进化生态学等多个研究领域的探究提供参考。

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Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

了鱼喂食实验室生物测定，从海洋生物的组织评估次生代谢产物的Antipredatory活动

基于亲合力的细胞外相互作用筛选（AVEXIS）用于可扩展检测低亲和力细胞外受体-配体相互作用

本文介绍了一种用于实验室估算多氯联苯（PCB）同系物从猎物向食鱼性鱼类净营养级传递效率的技术。为了最大限度地将实验室结果外推至野外实际情况，应使用该食鱼性鱼类在自然环境中通常摄食的鱼类作为饵料进行喂养。...

实验室估算多氯联苯同系物从猎物向湖鳟（Salvelinus namaycush）的净营养级传递效率

本研究介绍了一种利用海洋细菌Vibrio...

利用海洋细菌 Vibrio anguillarum 评估环境污染物急性毒性的生态毒理学方法

本文介绍了一种利用自动化追踪软件检测幼年斑马鱼和黑头软口鲦鱼运动活动及光运动反应（PMR）的实验方案。将这些行为分析整合到常规毒理学生物测定中，可作为检测化学物质生物活性的诊断工具。本方案以咖啡因为例进行说明，咖啡因是一种模型神经兴奋剂。...

检测幼鱼行为反应谱的实验方案：以神经兴奋剂咖啡因为例

野生鱼类的健康状况可作为水生生态系统健康状况的指标。基于尸体解剖的鱼类健康评估能够记录可见的病变或异常，并提供用于计算体况指数的数据，同时为组织的显微观察、基因表达及其他更深入的分析提供样本采集机会。...

基于尸体解剖的野生鱼类健康评估

本文介绍了一种用于分离和表征海洋七鳃鳗疑似信息素化合物的结构、嗅觉活性及其行为反应的实验方案。...

利用生物测定引导的分级分离法鉴定七鳃鳗信息素

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使用单一水箱中的一系列行为学测试评估成年斑马鱼（Danio rerio）的神经毒性

我们描述了一种基于斑马鱼胚胎振动惊吓反应的化学化合物毒性评估筛选系统的工作流程和数据分析方法。该系统记录斑马鱼胚胎在受到振动刺激时的运动反应，可对总体毒性/致死性以及神经肌肉毒性进行综合评估。...

利用斑马鱼振动惊吓反应筛选系统评估化学品的毒性

该文章提出了一种新颖的方法 体外 基于污染物对生物运动性影响的快速灵敏毒性及生态毒性评估方法 Mytilus galloprovincialis...

一种基于贻贝（Mytilus galloprovincialis）血细胞运动性的毒理学与生态毒理学检测方法

了解利用模式捕食性鱼类评估海洋生物组织中有机提取物抗捕食活性的生物测定方法。该技术为海洋化学生态学中次生代谢产物的生态功能提供实验证据。

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