Name: 文化和共同培养小鼠的卵巢和卵巢卵泡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学习小鼠卵巢和卵巢卵泡的原代培养与共培养技术，用于研究生殖生物学中的卵泡发育调控机制。该方法支持卵巢组织的三维结构保持，有助于探索卵泡相互作用及评估化合物对卵巢健康的影响。

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本工作由 MRC 资助项目 G1002118 资助。

所有动物实验均依照英国英国内政部许可证（项目许可证编号 PPL 60/1726 和 60/4026）规定的机构指南进行。
注意：根据英国法律法规要求，将实验动物饲养在14小时光照和10小时黑暗的光周期环境中。实验使用野生型C57Bl6J小鼠、泛表达绿色荧光蛋白（GFP）的Tau-GFP小鼠8，以及在部分神经元细胞中偶发表达黄色荧光蛋白（YFP）的Thy1-YFP小鼠9；两种转基因品系均以C57Bl6J为遗传背景进行繁育。
1. 工作条件与仪器准备
<ol>
	<li>所有培养基制备、组织解剖和培养操作均须在层流罩中进行，以确保无菌环境：这样可避免在培养基中添加抗生素。</li>
	<li>使用前，务必让培养基/培养板/胚胎培养皿在37 °C烘箱（解剖用培养基/胚胎培养皿）或37 °C、5% CO2 培养箱（培养用培养基和培养板）中平衡至少1小时。</li>
	<li>将玻璃移液管浸泡于0.1%牛血清白蛋白（BSA）溶液中约1小时，随后晾干。在本生灯火焰上拉制移液管，同时将玻璃弯曲，制成细长的弯头玻璃移液管。拉制完成后，使用玻璃切割器进行整齐切割。于160 °C烘箱中灭菌约45分钟。 
	注意：需预先准备一批此类玻璃移液管，用于卵巢和卵泡的转移。</li>
</ol>
2. 解剖与培养基质的制备
<ol>
	<li>准备解剖培养基。
	<ol>
		<li>将 3 mg/ml BSA 溶解于 Leibowitz L15 培养基中，并通过 0.2 µm 孔径、25 mm 直径的滤器过滤除菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>新生小鼠卵巢培养。
	<ol>
		<li>为准备新生小鼠卵巢培养用培养基，每培养一个卵巢配制 1 ml 培养基。将 3 mg/ml BSA 溶解于 α-最低必需培养基（αMEM）中，并通过 0.2 µm 孔径、13 mm 直径的滤器过滤除菌，收集至无菌离心管中。</li>
		<li>为准备培养板，在 24 孔板的每孔中加入 1 ml 新生小鼠卵巢培养基（每孔放置一个卵巢）。使用无菌钟表镊将一片聚碳酸酯膜置于每孔培养基上方，光面朝上。使用前需对膜进行紫外线灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>卵泡培养。
	<ol>
		<li>为准备卵泡培养用培养基，在 α-最低必需培养基中添加 1 IU/ml 重组人卵泡刺激素、5 μg/ml 抗坏血酸以及 5% v/v 成年雌性小鼠血清。通过 0.2 µm 孔径、13 mm 直径的滤器过滤除菌，收集至无菌离心管中。</li>
		<li>通过 0.45 µm 孔径、25 mm 直径的滤器将硅油过滤除菌，收集至无菌离心管中。</li>
		<li>为准备培养板，在非组织培养处理的 96 孔圆底微量培养板的每孔中加入 30 μl 卵泡培养基液滴，仅使用每块板的最上一行（以便在培养期间每天将卵泡转移至新的一行）。小心地在培养基上方覆盖 70 μl 灭菌硅油，以防止培养基蒸发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>卵泡-卵巢共培养。
	<ol>
		<li>参照上述第 2.3.1 步骤配制卵泡-卵巢共培养用培养基，每建立一个共培养体系配制 1 ml 培养基。</li>
		<li>为准备培养板，在 24 孔板的每孔中加入 1 ml 培养基。使用无菌钟表镊将一片 Nucleopore 膜置于每孔培养基上方，光面朝上。使用前需对膜进行紫外线灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 新生小鼠卵巢解剖与培养
<ol>
	<li>将1 ml解剖培养基加入每个无菌玻璃胚胎培养皿中。</li>
	<li>根据英国英国内政部规定，通过断头法处死出生后0至5天龄的新生小鼠。</li>
	<li>使用精细解剖镊夹住覆盖腹壁的皮肤，切开皮肤和体壁，形成较大的切口。将切口拉开，使整个腹部暴露。此时膀胱通常充盈，可将其刺破以方便后续解剖操作。</li>
	<li>使用钟表匠镊将肠道移开。沿两侧膀胱向上追踪子宫角至肾脏位置。卵巢位于肾脏下方、子宫顶部，于解剖显微镜下呈云雾状结构。</li>
	<li>用钟表匠镊轻轻夹住卵巢，使用剪刀切断其与子宫的连接。将一对卵巢转移至含有预温解剖培养基的胚胎培养皿中。</li>
	<li>在加热载物台（37 °C）的解剖显微镜下进行卵巢精细解剖。使用胰岛素注射针去除卵巢周围的包膜囊及包括输卵管在内的多余组织，直至仅保留卵巢组织。</li>
	<li>使用精细拉制的弯头玻璃移液管，将每个卵巢转移至上述第2.2.2步准备好的培养板孔中，每个膜上放置一个卵巢（见图1A）。在37 °C、5% CO2培养箱中进行培养。</li>
	<li>每隔两天更换一次培养基。使用移液管将每孔中50%的培养基更换为预通气的新鲜培养基：将移液管尖置于孔中培养基边缘，以避免扰动膜结构。</li>
	<li>培养时间最长可达6天。</li>
	<li>培养结束后，根据需要将培养基冷冻保存，并用PBS短暂洗涤卵巢后进行固定或冷冻处理。
	<ol>
		<li>如需进行组织学分析，将卵巢置于Bouin固定液中固定90分钟；如需进行免疫组织化学分析，则置于10%中性缓冲福尔马林中固定90分钟。如需快速冷冻，将卵巢组织放入聚丙烯管中，置于干冰上5–10分钟，随后在-70 °C条件下冷冻保存，用于后续蛋白质或mRNA提取。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 卵泡分离与培养
<ol>
	<li>处死19至23日龄的雌性小鼠，并分离卵巢。在进行任何切口前，先用70%乙醇润湿毛发。使用钝头镊子夹起皮肤，用解剖剪在腹部做一个较大的切口，穿透皮肤和体壁。</li>
	<li>使用更精细的解剖器械将肠道移开，找到子宫。沿子宫向上追踪至卵巢，卵巢位于两侧肾脏下方。</li>
	<li>用钟表匠镊子轻轻夹住卵巢，用精细解剖剪切断卵巢与子宫的连接。避免采集过多的卵巢脂肪垫。收集卵巢并转移至含有预热解剖液的培养皿中。</li>
	<li>使用胰岛素针头修剪去除卵巢包膜囊及多余组织（包括输卵管），直至仅剩卵巢组织。用胰岛素针头将每个卵巢大致切成两半。</li>
	<li>小心地将每一半卵巢转移至一个含有1 ml解剖液的凹面载玻片中。用盖玻片覆盖每个凹面载玻片，以防止液体蒸发并确保无菌。</li>
	<li>将含有卵巢半片的凹面载玻片置于37 °C培养箱中备用，但应尽快进行下一步解剖操作。存放超过一小时的组织应予以丢弃。</li>
	<li>将含有卵巢半片的凹面载玻片转移至超净台内37 °C加热的显微镜载物台上。使用两根胰岛素针头将卵巢粗略切成大块，以便识别晚期前窦状卵泡：这些卵泡应含有2–3层颗粒细胞，直径约为180–200 µm。</li>
	<li>使用一根胰岛素针头和一根固定在针座上的30 × 0.25 mm针灸针，手动分离出已识别的卵泡。注意尽量去除周围的间质组织，但避免损伤卵泡的基底膜（见图1B）。</li>
	<li>使用精细拉制的弯头玻璃移液管，小心地将分离出的卵泡转移至含有预热解剖液的收集用凹面载玻片中。注意将卵泡保持在移液管细径部分，以防丢失。</li>
	<li>使用装配在解剖显微镜中的校准目镜测微尺准确测量卵泡大小。</li>
	<li>仅选择直径为190 ± 10 µm的卵泡用于培养。进一步筛选健康、呈球形的卵泡：这些卵泡应呈半透明状，无深色退化区域，具有完整的基底膜，并附有部分膜细胞组织；不符合上述特征的卵泡应予以丢弃。每枚卵巢可获得10–15个卵泡为理想产量。</li>
	<li>使用精细拉制的弯头玻璃移液管，将单个卵泡转移至按上述步骤2.3.3制备的培养板孔中。小心地将卵泡置于孔底（而非上层油相中）。在37 °C、5% CO2培养箱中进行培养。</li>
	<li>培养卵泡最多6天，每天将卵泡转移至含有新鲜培养基的新孔中。
	<ol>
		<li>按照上述步骤2.3.3中的板制备方法，准备96孔板的下一行。将板放回培养箱至少一小时，以达到平衡。使用精细拉制的玻璃移液管将卵泡转移至含新鲜培养基的新孔中。</li>
		<li>若在培养过程中需要将卵泡在同一批培养基中保留两天再更换，应将每个卵泡置于至少60 μl（而非30 μl）的卵泡培养基液滴中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为获取卵泡生长数据，每天使用装配目镜测微尺的解剖显微镜测量卵泡大小。油层会扭曲卵泡直径的测量结果，因此需计算该装置的校准系数。</li>
	<li>培养结束后，按照上述步骤3.10的方法，冷冻培养基并对组织进行固定或冷冻，以备后续分析。</li>
	<li>卵泡-卵泡共培养。
	<ol>
		<li>将两个卵泡共同培养，以研究卵泡间的相互作用。培养条件同上，但在孔中将两个卵泡并排紧贴放置。</li>
		<li>在未经组织培养处理的96孔平底微孔板的每孔中加入100 μl卵泡培养基液滴，并覆盖100 μl灭菌硅油。无需像上述步骤4.13那样将卵泡转移至新孔，而是每隔一天使用细小凝胶吸头更换50%的培养基。</li>
		<li>为在共培养体系中识别组织来源，应使用来自不同遗传背景的卵泡进行共培养，例如一个来自野生型小鼠的卵巢，另一个来自全身表达GFP的小鼠的卵巢。若使用GFP或YFP标记的组织，在培养及后续固定/处理过程中应尽可能减少组织暴露于光照下。 
		注：两个卵泡在共培养中通常会融合为一个“双卵泡”结构（见图1C）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 卵泡-卵巢共培养
<ol>
	<li>按照上述第3和第4节的方法分离卵巢和卵泡。</li>
	<li>将一个新生小鼠卵巢置于膜上，放入按上述步骤2.4.2准备的培养板中。使用精细拉制的弯头玻璃移液管，小心地将单个卵泡与新生卵巢的一极接触。在37 °C、5% CO2培养箱中培养最多5天。</li>
	<li>为了区分共培养体系中不同组织的来源，应使用来自两种不同来源的卵巢和卵泡，例如，一个来自野生型小鼠，另一个来自全身表达GFP的小鼠。</li>
	<li>每日更换500 μL培养基，操作如上述步骤3.8所述，但使用卵泡培养基。在共培养过程中，卵泡常被卵巢组织包裹（图1D）。</li>
	<li>培养结束后，按照上述步骤3.10的方法，将培养基冷冻保存，并对组织进行固定或冷冻，以备后续分析。</li>
</ol>
6. 培养组织的固定、免疫细胞化学染色与成像
<ol>
	<li>培养结束时，用 PBS 清洗组织，并转移至 100 μl（卵泡）或 1 ml（卵巢）的 10% 中性缓冲福尔马林中，冰上固定 1 小时。随后在 4 °C 下用 1×PBS 洗涤 3 次。</li>
	<li>对卵泡进行免疫细胞化学染色时，使用精细拉制的弯头玻璃移液管将卵泡转移至 96 孔微量培养板的不同孔中，每个孔内含有不同的洗涤液或处理液。</li>
	<li>对卵巢（或卵巢-卵泡共培养物）进行免疫细胞化学染色时，将其包埋于 4% 琼脂糖凝胶中，用振动切片机切为 50 µm 厚的切片。将切片漂浮于 24 孔板的各孔中进行洗涤或处理，并用移液器取出。</li>
	<li>成像时：将琼脂糖切片转移至载玻片上，用封片剂封片；或将卵泡（或卵泡-卵泡复合体）转移至凹面载玻片中，用非硬化封片剂封片。使用共聚焦显微镜观察样本。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突可披露。

我们在此描述了可用于支持小鼠卵巢卵泡发育的多种培养体系 体外，使用包含仅处于最早期卵泡阶段的整个新生卵巢、单个前窦状卵巢卵泡，以及这两种组织的共培养体系。
新生小鼠卵巢的培养支持早期卵巢发育，特别是卵泡生长至次级卵泡阶段的启动。根据研究所需的发育阶段，可选用不同日龄的新生小鼠进行此类培养。若取出生后小鼠的卵巢，卵泡形成过程正在进行但尚未完成：培养至少可在部分程度上支持卵泡形成的继续，随后进入卵泡生长阶段。或者，使用出生后约四至五日龄小鼠的卵巢（此时卵泡形成已基本完成），可获得含有更多原始卵泡和生长中卵泡的培养体系12。本文所述技术的优点包括使用漂浮式聚碳酸酯膜，有助于组织获得更充分的氧气供应；以及采用极为基础的培养基（仅含αMEM和BSA），避免使用血清等成分未明的添加剂。整体卵巢培养似乎无法支持卵泡发育超越次级卵泡阶段，后续发育需要改变技术方法，例如从培养后的新生卵巢中分离卵泡-颗粒细胞复合体1。
通过分离完整的晚期前窦状卵泡，可在体外培养中将其发育至卵泡后期阶段，同时保持其三维结构，直至达到排卵前阶段。in vitro 培养中使用完整卵泡可维持不同卵泡组分之间的相互关系，类似于 in vivo 的生理状态。该培养系统可用于获取能够支持受精及后续胚胎发育的卵母细胞。
可受精的卵母细胞也可通过本文所述的初始培养方案从小鼠新生卵巢中获得，随后进入第二阶段，即卵母细胞-颗粒细胞复合体的生长阶段 体外1其他目前使用较为频繁的系统包括将卵泡或卵巢组织包封在海藻酸盐水凝胶等材料中进行培养，以提供结构支持（例如，参见 Tagler 等13目前方法开发的大部分重点是改进较大哺乳动物卵巢和卵泡的培养技术，长远目标是从包括人类在内的多种物种的原始卵泡中获得可受精的卵母细胞。
在任一时刻，哺乳动物的卵巢中均含有处于不同发育阶段的卵泡，这些卵泡之间的相互作用影响其调控。这一卵巢功能特征目前尚不明确，且难以在体内进行研究。本文所述的最后一种方法采用共培养系统以支持不同发育阶段卵泡的发育。 体外如有需要，可对一种或两种组织进行预处理 体内 或 体外 共培养前。此类共培养系统为研究卵泡与卵泡之间的相互作用提供了理想方法，例如生长中的腔前/腔状卵泡如何影响原始卵泡池，这些卵巢生物学方面的内容迄今一直难以深入探究。
整体卵巢培养技术相对简单，但需要仔细解剖以避免意外的组织损伤。单个卵泡的分离是一项专门的技术，需经过反复练习，才能完整且无损伤地从卵巢中分离出处于合适发育阶段的卵泡。必须小心谨慎地分离单个卵泡，因为在解剖过程中造成的损伤可能导致卵泡在后续培养期间死亡。当将卵泡直接放入微量培养板的孔中时，重要的是仅使用非组织培养处理的塑料器皿，以尽量减少膜细胞在塑料表面的贴壁生长：如果使用组织培养处理过的器皿，卵泡会附着在孔底，并在生长过程中破裂。在进行所有共培养实验时，必须将组织直接相互接触放置。
上述用于卵泡培养技术的培养基中包含小鼠血清。可用胎牛血清替代小鼠血清，但仅有少数批次的胎牛血清能够充分支持卵泡发育至排卵前阶段，因此需通过批次测试来筛选合适的血清来源。此外，建议对促卵泡激素（FSH）进行批次测试，因为用于评估FSH活性的国际单位与卵泡生长之间的相关性较差。 体外如果在培养期间卵泡破裂成为常规现象，建议将库存的抗坏血酸更换为新批次。
除解剖显微镜和组织培养箱外，这些技术并不需要特别专业的设备，但使用层流罩并配合良好的无菌操作技术，可使卵巢卵泡在无需添加抗生素的条件下进行培养，如本文所述方法。这样做有助于避免抗生素对卵母细胞可能产生的不利影响，尤其是在培养后需要进行受精的情况下。若无法在无菌环境中操作，则建议在解剖和培养介质中添加抗生素。

哺乳动物的卵巢包含女性一生中全部的卵母细胞，每颗卵母细胞均被包裹在卵巢卵泡内。卵泡在出生前即以静止的原始卵泡阶段形成：一旦卵泡库建立，卵泡便会持续且逐步地从原始卵泡池进入生长卵泡池。随着卵泡开始生长，它们依次经历初级、次级、前窦状和窦状阶段，直至达到排卵前（即格拉夫氏）阶段。只有来自排卵前卵泡的卵母细胞才具备完全的发育潜能，若受精，能够支持胚胎发育至足月。
长期以来，人们已知卵巢可以在体外以高度生理的方式发育。in vitro。这很可能是因为每个卵巢卵泡内部都含有支持卵母细胞从不成熟阶段（在此阶段其无法完成减数分裂）发育至具有发育能力阶段（在此阶段其能够完全支持减数分裂的完成、受精以及由此产生的胚胎发育至足月）所必需的细胞。
卵巢发育的生理特性 体外 已导致卵巢培养技术的广泛应用。因此， 体外 已采用多种方法来研究卵巢发育的调控、卵巢病理（例如多囊卵巢综合征，PCOS）、卵巢/卵母细胞在化学物质暴露下的影响，以及旨在从原始卵巢卵泡中获取可受精卵母细胞的实践目标。迄今为止，后一目标仅在小鼠卵巢组织中得以实现。1，尽管近年来利用包括人类在内的大型哺乳动物卵泡的培养技术已取得显著改进2,3.
本文介绍了几种使用小鼠卵巢组织的培养方法。第一种方法利用新生小鼠的完整卵巢，支持原始卵泡的形成及其早期发育4。第二种体系支持单个完整卵巢卵泡从晚期前窦状阶段发育至排卵前阶段；利用该技术，卵泡可单独培养，也可成对培养5,6。最后，我们描述了一种共培养体系，将前两种技术结合，可用于研究生长中卵泡与原始卵泡之间的相互作用7。
单个完整卵巢卵泡的培养可通过对培养期间每日卵泡测量来确定卵泡的生长情况，同时通过培养基分析可研究卵泡或卵巢的激素分泌。培养结束后，收集卵泡或卵巢组织还可进行进一步的组织学/免疫组织化学分析，或进行后续处理，例如提取mRNA或蛋白质。

<table><tbody><tr><td>Leibowitz L15</td><td>Invitrogen</td><td>11415049</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM</td><td>Invitrogen</td><td>22571020</td><td>以碳酸氢钠缓冲液形式提供（2,200 mg/L）</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>用于解剖培养基</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3311</td><td>用于培养培养基</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>用于包被玻璃移液管</td></tr><tr><td>小鼠血清</td><td>-</td><td>-</td><td>通过心脏穿刺采集</td></tr><tr><td>FSH</td><td>Merck Serono</td><td>Gonal F</td><td>通常需要进行批次测试。用 &amp;alpha;MEM 配制 1 IU/10&amp;micro;l 的储存液，并于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td>用 &amp;alpha;MEM 配制 5 mg/ml 的储存液，并于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>硅油</td><td>VWR</td><td>630064V</td><td>Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS</td></tr><tr><td>注射器滤器（25 mm，0.2 &amp;micro;m）</td><td>Greiner</td><td>16532K</td><td>醋酸纤维素滤膜，用于过滤较大体积（&amp;gt;5 ml）的培养基。</td></tr><tr><td>注射器滤器（13 mm，0.2 &amp;micro;m）</td><td>Iwaki</td><td>3032-013</td><td>醋酸纤维素滤膜，用于过滤较小体积（&amp;lt;5 ml）的培养基</td></tr><tr><td>注射器滤器（25 mm，0.45 &amp;micro;m）</td><td>Iwaki</td><td>2053-025</td><td>醋酸纤维素滤膜，用于过滤油类。</td></tr><tr><td>无菌离心管</td><td>Greiner</td><td>187261</td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>96孔圆底板</td><td>Iwaki</td><td>3875-096</td><td>仅使用未经组织培养处理的板</td></tr><tr><td>96孔平底板</td><td>Iwaki</td><td>3860-096</td><td>仅使用未经组织培养处理的板</td></tr><tr><td>Whatman Nucleopore 膜</td><td>Camlab</td><td>WN/110414</td><td>使用光面朝上，聚碳酸酯材质，直径 13 mm，孔径 8.0 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>胰岛素注射针头</td><td>BD 医疗用品</td><td>037-7606</td><td>0.33 mm（29 G）+ 1 ml</td></tr><tr><td>玻璃胚胎培养皿</td><td>VWR</td><td>720-0579</td><td>灭菌后使用前预热。</td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>10209381</td><td>使用前需用 BSA 包被。</td></tr><tr><td>凝胶吸头</td><td>AlphaLabs</td><td>LW1103</td><td></td></tr><tr><td>针灸针</td><td>Acumedic LTD</td><td>30 mm x 0.25 Type C</td><td></td></tr><tr><td>Bouin&amp;rsquo;s 固定液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林溶液，10%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT5014-120ml</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 聚丙烯管</td><td>Greiner BioOne</td><td>616201</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠卵巢和卵巢卵泡的培养与共培养

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

哺乳动物的卵巢由卵泡组成，每个卵泡包含一个被颗粒细胞包围的卵母细胞，并共同被基底膜包裹。在胚胎发育过程中会形成一定数量的原始卵泡，此时处于减数分裂阻滞状态的卵母细胞与扁平的颗粒细胞紧密接触，形成原始卵泡。在出生时或出生后不久，哺乳动物卵巢即已含有其一生所需的全部原始卵泡，此后原始卵泡会持续进入生长卵泡池并逐步发育。
卵巢特别适合用于发育研究 体外，卵泡在培养中以高度生理化的方式生长。本文描述了包含原始卵泡的新生卵巢整体培养，以及单个卵巢卵泡的培养方法，该方法可支持卵泡从不成熟阶段发育至排卵前阶段，之后其卵母细胞能够进行受精。 体外本文所述工作采用培养系统来确定卵巢在暴露于外源性化合物时所受到的影响。我们还描述了一种共培养系统，可用于研究生长中卵泡与非生长的原始卵泡池之间发生的相互作用。

图1展示了培养过程开始时及进行中卵巢和卵泡的图像。
图2展示了新生卵巢（此处指新生幼崽的卵巢）在体外培养期间暴露于生殖毒性物质后的代表性结果。新生卵巢在体外培养6天，并在培养的第2天暴露于化疗药物顺铂或阿霉素。培养结束后，卵巢被固定并进行组织学处理，随后检测健康与非健康卵巢卵泡的数量4。 Alternatively，通过培养表达卵母细胞特异性荧光标记物小鼠的卵巢碎片，可更快地评估早期生长卵泡10。
在单个卵泡的培养过程中，可通过培养期间每日测量轻松确定卵泡的生长情况。图3展示了在存在或不存在促性腺激素——卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）条件下培养的卵泡生长的代表性结果5。
卵泡-卵泡或卵泡-卵巢共培养可用于研究卵泡之间的相互作用。根据组织类型和处理方式，可使用明场、荧光或共聚焦显微镜获取图像。图4展示了此类共培养的代表性图像结果，用于分析参与卵泡-卵泡通讯的各种细胞类型，包括内皮细胞和神经元细胞7。
<img alt="细胞分裂阶段；显微镜图像；二分裂；细胞膜形成；发育生物学。" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" width="650" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：（A）出生当天从小鼠体内获取的新生卵巢组织，置于聚碳酸酯膜上拍摄的显微照片。（B）新鲜解剖获得的健康卵巢卵泡显微照片，周围大部分间质组织已被去除。（C）两个卵巢卵泡在培养最初三天内的共培养显微照片，显示随着培养进行，两个卵泡之间逐渐形成紧密接触（Ci：培养第一天；Cii：培养第二天；Ciii：培养第三天）。改编自Spears et al.11（D）培养两天后，前窦状卵泡与新生卵巢共培养的显微照片。图像显示卵泡正被卵巢组织包裹。箭头指示前窦状卵泡。图片由Federica Lopes博士提供。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="顺铂和阿霉素毒性柱状图；不健康卵泡百分比、卵泡数量分析。" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：化疗药物顺铂和阿霉素对新生小鼠卵巢培养的影响。顺铂和阿霉素均导致卵泡健康度下降以及卵泡数量减少。（A）顺铂；（B）阿霉素：（i）不健康卵泡的百分比（空白柱）；以及（ii）每个卵巢中的卵泡总数（阴影柱）。柱状图表示均值 ± 标准误（sem）；所有组别 n = 5，星号表示与对照组相比具有显著性差异（*p &lt;0.05，**p &lt;0.01，***p &lt;0.001）。改编自 Morgan et al.4
<img alt="卵泡生长曲线；FSH、LH对直径的影响；折线图；激素对培养的影响。" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig3.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3：在不同促性腺激素环境下培养的卵泡生长速率。 数据为均值 ± 标准误（每组 n ≥16）。箭头表示所有促性腺激素组中卵泡腔开始形成的时间点。引自 Murray et al.5
<img alt="显示荧光标记和细胞结构的胚胎发育显微图像。" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" width="650" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4：卵泡-卵泡及卵巢-卵泡共培养图像，显示卵泡间的相互作用。（A）共培养后绿色荧光蛋白（GFP）卵泡与野生型（WT）卵泡的共聚焦显微图像（此处GFP表达显示为白色），可见GFP卵泡的突起延伸覆盖在WT卵泡表面。（B）共培养后GFP/WT卵泡复合体的横切面，显示来自相邻卵泡的GFP突起（绿色）位于WT卵泡基底膜旁。（C）新生期WT卵巢与前腔期表达GFP的卵泡共培养后，显示GFP细胞及其细胞突起（绿色）已迁移穿过新生卵巢的间质组织。（D）包含内皮细胞的GFP/WT卵泡复合体，通过内皮细胞标志物CD31的表达（红色）显示。（E）包含神经元细胞的GFP/WT卵泡复合体，通过神经元标志物β-tubulin III的表达显示（单独显示为红色，若与GFP共标记则呈黄色）。（F）YFP/WT卵泡复合体，其中YFP指来自Thy1-YFP小鼠的卵泡，该小鼠的部分神经元细胞偶见表达黄色荧光蛋白（YFP：黄色）9，显示神经元从YFP卵泡延伸而出。标尺：50 μm（A、B、D），100 μm（C、E、F），100 μm（A插图），10 μm（C插图），15 μm（D插图）。改编自Campbell et al.7 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了小鼠卵巢组织的原代培养/共培养方法，使用新生小鼠的卵巢以及未成年小鼠的单个卵巢卵泡。该培养技术能够以高度生理化的方式支持卵泡发育，可用于研究外源性因子对卵巢的影响以及卵巢卵泡之间的相互作用。

哺乳动物的卵巢由卵巢卵泡组成，每个卵泡包含一个被体性颗粒细胞包围的卵母细胞，二者共同被包裹……

本实验的总体目标是在体外培养新生卵巢或单个卵巢卵泡。首先，从适当年龄的雌性小鼠体内分离卵巢组织。第二步是处理组织，包括使用针灸针对单个卵巢卵泡进行精细解剖。随后，将新生卵巢或单个前腔状卵泡进行定期换液的培养，最后一步是将组织固定或冷冻，以用于组织学或分子分析。该培养系统最终能够以高度生理化的方式支持卵泡发育，可用于研究卵巢卵泡发育的调控机制，以及探究原始卵泡与生长中卵巢卵泡之间的相互作用。该技术的主要优势在于，能够在整个卵泡发育过程中维持完整卵泡的结构，保持其三维构象，而无需依赖支撑基质。该方法有助于解答卵巢生物学领域的关键问题，并可用于研究化疗药物等有毒化合物对卵巢及女性生育力的影响。我们最初是在探讨如何研究生长中卵泡对静息原始卵泡库的影响时，提出了共培养不同年龄和发育阶段卵巢卵泡的想法。与斯特凡·摩根和丽莎·坎贝尔共同演示该技术的还有来自实验室的技术员薇薇安·Allison，以及曾在实验室工作多年的博士后科学家艾莉森·Murray。她们两人均参与了该技术关键环节的开发。本方案中移液管的拉制。在火焰上加热并弯曲玻璃移液管，使用玻璃切割器进行整齐切割。随后将弯曲的玻璃管在 160 摄氏度下灭菌约 45 分钟。要使移液管的弯曲程度适合您的技术操作，需要经过练习才能掌握。始终使用玻璃切割器切割移液管，以确保切口处无锋利的毛边。同时需确保移液管末端具有适合您组织的合适直径。使用0.2微米滤膜（直径25毫米）过滤含牛血清白蛋白（BSA）的Leibovitz L-15培养基，以制备无菌解剖液。同样使用该规格滤膜（直径25毫米）制备无菌新生小鼠卵巢培养体系。用直径25毫米的0.2微米滤膜再次过滤培养基，并收集到无菌离心管中。然后向24孔板的每孔中加入1毫升新生培养基，并将膜转移至每孔培养基表面。卵泡培养基也需像卵巢培养基一样进行滤膜除菌。随后，硅油也必须经过滤膜除菌。接下来，沿96孔培养板的最上一排，每孔加入30微升卵泡培养基，形成液滴。小心地向这些孔中加入 70 微升硅油进行覆盖。或者，卵泡-卵泡共培养需要每孔加入 100 微升培养基，并覆盖 100 微升硅油。然后准备卵泡-卵巢共培养板，每孔加入 1 毫升培养基，并非常小心地放置经紫外灭菌的核孔膜。首先，将一毫升解剖液转移至每个无菌的玻璃胚胎培养皿中。对出生后0至5天的幼鼠进行标记后，用精细镊子夹住覆盖腹壁的皮肤，切开皮肤和体壁。拉开此大切口，暴露腹腔。此时膀胱通常已充盈，可穿刺以方便解剖。使用钟表镊将肠道移开，然后在两侧分别从膀胱向上追踪子宫角至肾脏。卵巢是一种云状结构，位于子宫顶部、紧邻肾脏下方。用剪刀轻轻夹住卵巢，将其从子宫上剪下。切除双侧卵巢后，将其转移至盛有温热解剖液的培养皿中。使用载物台加热至37摄氏度的解剖显微镜，借助胰岛素针头解剖卵巢。剪除基部囊状结构及所有多余组织，包括输卵管，直至仅剩卵巢组织。然后使用弯头移液管将每个卵巢转移至已准备好的培养板的孔中。每个膜培养基上放置一个卵巢，每隔一天更换一次培养基，每次更换培养基时更换一半体积，最多培养六天；更换培养基时，将移液管尖置于孔的边缘，以避免扰动膜。培养结束后，卵巢可冷冻保存，或进行固定用于组织学或免疫组化分析。将老年小鼠的卵巢收集到一皿温热的解剖液中后，去除卵巢基部。使用胰岛素针头切除基部囊袋及任何多余组织，包括输卵管，直至仅剩卵巢组织。随后用针头将卵巢切成两半，并小心地将每一半转移至含有1 mL解剖液的独立表玻璃皿中。尽快用玻璃盖片盖住表面皿，并将其放入烘箱中保存，最长不超过一小时。在层流通风罩内，于带有加热载物台的显微镜下操作，使用胰岛素针头将卵巢解剖成较大的组织块，以识别晚期前窦状卵泡。前窦状卵泡包含两到三层颗粒细胞，直径约为180至200微米。使用持针器固定平针和针灸针，通过平针剥离上述任意结构，注意避免损伤基底膜，但必须彻底清除周围的S间质组织。该操作需要练习。卵泡需要保留一些粪样组织，但不宜过多。此外，如果解剖过程过于粗暴，卵泡会受到损伤，进而发生破裂或死亡。在培养过程中，操作者需准备好移液管，小心地将卵泡转移至盛有新鲜培养基的表面皿中。使用装有校准目镜的解剖显微镜，将卵泡保持在移液管的细径部分。测量卵泡。如果卵泡直径在190微米的10微米范围内，则可用于培养；将其他未符合标准的卵泡从所选卵泡中弃去。仅选择最健康的卵泡用于培养。理想的卵泡应呈半透明状，无较深的网状区域，基底膜完整，并带有部分附着的膜组织。每个卵巢可获得10至15个卵泡即为良好产量。现在使用预先准备好的弯曲移液管，将这些卵泡转移至已准备好的96孔培养板中。将每个卵泡置于油层下方的单独孔中，并进行培养。卵泡培养最长可达六天，每天观察一次。用培养基准备新的一行。一小时或更长时间后，将卵泡转移至下一行新鲜的平衡培养基中，或将两个卵泡并排共培养于一个孔中。无需进行转移操作时，可使用细尖凝胶吸头每隔一天更换一半培养基。对于卵泡-卵巢共培养，将卵泡转移至置于培养板膜上的新生卵巢组织，小心地将卵泡放置在新生卵巢的一极旁，以便之后可将其相互接触。维持此共培养体系最长五天，每隔一天更换 500 µL 培养基。原始卵泡常被包裹在新生卵巢中。在本培养过程中，取新生个体的卵巢进行为期六天的体外培养，并暴露于生殖毒物中。在培养的第二天，对组织进行处理，以确定不同发育阶段卵泡的数量和健康状况。一种被研究的毒性物质是顺铂。另一种被研究的毒性物质是多柔比星。另一项不同的实验研究了促性腺激素卵泡刺激素和黄体生成素对单个卵泡生长的影响。但通过定期测量卵泡大小来绘制其生长曲线。利用表达GFP的卵泡与野生型卵泡进行卵泡共培养，观察到细胞突起从一个卵泡延伸至另一个卵泡。对该共培养样本进行免疫组织化学处理后发现，GFP标记的突起位于野生型卵泡内部。卵泡膜层中，野生型新生卵巢也与表达GFP的卵泡进行共培养。在此情况下，GFP的突起可迁移穿过卵巢间质。新生卵巢培养是一种相当直接的方法，但需要花费一定时间掌握分离完整且无损伤的前腔隙卵泡的技术。这对于它们的正常发育至关重要。在卵泡培养之后，卵母细胞可通过体外受精进行受精，随后可将胚胎移植到假孕雌性动物体内，获得活产幼崽。

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科研

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小鼠卵巢和卵巢卵泡的培养与共培养

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