文化和共同培养小鼠的卵巢和卵巢卵泡

该程序的总体目标是在体外培养新生儿卵巢和/或单个卵巢卵泡。这是通过首先解剖适当年龄的寒冷女性的卵巢来完成的。第二步是准备组织，包括用针灸针对单个卵巢卵泡进行精细解剖。

然后通过定期喂养培养新生儿卵巢或单个窦前卵泡，最后一步是固定或冷冻组织以进行组织学或分子分析。最终，培养系统以高度生理的方式支持发育，可用于检查卵巢卵泡发育的调节，并研究原始卵巢卵泡和生长中的卵巢卵泡之间的相互作用。这种技术的主要优点是完整的卵巢卵泡通过卵泡发育得到支持，无需支撑基质即可保持其三维结构。

这种方法可以帮助回答卵巢生物学领域的关键问题，也有助于研究化疗、药物等有毒化合物对卵巢的影响，从而影响女性的生育能力。在讨论如何研究生长的卵泡对静止原始卵泡池的影响时，我们首先想到了共培养不同年龄和卵巢卵泡阶段的想法，与 Steph Morgan 和 Lisa Campbell 一起演示该技术的是实验室的技术员 Vivian Allison 和在实验室担任博士后科学家多年的 Allison Murray。他们俩都帮助开发了该技术的关键方面 拉动该协议的移液器。

玻璃移液管在火焰上加热并弯曲，并使用玻璃切割机进行干净的切割。然后将曲面玻璃在 160 摄氏度下消毒约 45 分钟。需要练习才能在移液器中获得适合您的技术的正确曲线。

始终使用玻璃切割器切割移液器，以免出现锯齿状玻璃。您还需要确保最终具有适合您的组织直径 旨在通过 0.2 微米过滤器对由 lebowitz L 15 培养基和 BSA 制成的解剖培养基进行消毒。这是直径为 25 毫米的，用于对新生儿卵巢培养物进行消毒。

培养基通过另一个直径仅为 25 毫米的 0.2 微米过滤器，并将其收集在无菌管中。然后将 1 毫升新生儿培养基添加到 24 的每个孔中。在每个孔中，孔板并将膜转移到培养基表面。

卵泡培养基也像卵巢培养基一样进行过滤灭菌。然后硅油也必须进行过滤灭菌。接下来，沿顶行用 30 微升滤泡培养基液滴修复 96 孔培养板。

小心地用 70 微升硅油覆盖这些孔。或者，卵泡卵泡共培养需要 100 微升培养基和 100 微升硅油覆盖。然后准备卵泡卵巢共培养板，每孔 1 毫升培养基和非常小心放置的 UV 消毒核 po 膜。

首先将 1 毫升解剖培养基转移到每个无菌玻璃胚胎培养皿中。给 0 到 5 只出生后一日龄幼崽上色后，用细镊子抓住覆盖腹壁的皮肤，然后插入皮肤和体壁。拉开这个大切口，露出腹部。

膀胱在这个阶段通常充血，可以穿刺以使解剖更容易。使用 watchmaker 镊子，将内脏移到一边。然后在两侧，沿着子宫角从膀胱向上到达肾脏。

卵巢是一个云状结构，位于子宫顶部的肾脏正下方。用剪刀轻轻抓住卵巢。将其从子宫中切出。

解剖出两个卵巢后，将它们转移到装满温热解剖的培养皿中。中等。使用带有 37 摄氏度加热台的解剖显微镜，使用胰岛素针解剖卵巢。修剪掉基底袋和任何多余的物质，包括输卵管，直到只剩下卵巢。

然后使用弯曲的移液管将每个卵巢转移到准备好的板的孔中。在每个膜培养物上放置一个卵巢，组织每隔一天更换一半的培养基，最多六天更换培养基时，更换培养基时，将移液器吸头放在培养基孔的边缘，以避免干扰膜。培养后，卵巢可以冷冻或固定储存，或者组织学或免疫化学。

在装有温热解剖培养基的培养皿中收集老年小鼠的卵巢后，取出卵巢 Basa。使用胰岛素针修剪掉基底袋和任何多余的物质，包括输卵管，直到只剩下卵巢。然后用针头将卵巢切成两半，小心地将每半转移到含有 1 毫升解剖培养基的单独手表玻璃杯中。

用载玻片盖住眼镜，并尽快将它们存放在烤箱中长达一个小时。在显微镜下工作，在层流罩中加热阶段，使用胰岛素针将卵巢解剖成大块，以识别晚期肛门前卵泡。前窦卵泡包含两到三层颗粒细胞，直径约为 180 至 200 微米。

使用在线针和由持针器固定的针灸针解剖其中任何一个，避免损坏基底层，但一定要去除周围的 S 基质。这需要练习。卵泡需要一些粪便组织，但不需要太多。

此外，如果解剖过程太粗糙，毛囊会受损，要么破裂，要么死亡。在培养过程中，User 准备了 perpe，以小心地将毛囊转移到装满新培养基的手表玻璃上。使用安装在解剖显微镜上的校准目镜将毛囊保持在 perpet 的薄口径部分上。

测量毛囊。如果它们在 190 微米直径的 10 微米范围内。它们可能用于培养，丢弃所选卵泡中的其他卵泡。

只选择最健康的进行培养。它们应该是半透明的，没有较暗的网状区域，具有完整的基底层和一些附着的鞘组织。每个卵巢 10 到 15 个卵泡的产量很好。

现在使用准备好的弯曲 perpe，将这些卵泡转移到准备好的 96 孔培养板中。在油层和培养物下方的每个孔中放置一个卵泡。卵泡每天长达 6 天。

准备包含 media 的新行。一小时或更长时间后，将卵泡转移到下一排新鲜的平衡培养基或卵泡卵泡共培养两个卵泡并排培养。好吧，不要转移，而是使用细凝胶尖端每隔一天更换一半的培养基。

对于卵泡卵巢，共培养将卵泡转移到放置在培养板中膜上的新生儿卵巢，小心地将卵泡放在新生儿卵巢的一极旁边，以便它们可以相互接触。保持这种培养物长达 5 天。每隔一天更换 500 μL 培养基。

肛门前卵泡经常被新生儿卵巢包膜。在这种培养过程中，新生儿卵巢培养 6 天并暴露于生殖毒物。在培养的第二天，对组织进行处理以确定不同阶段卵泡的数量和健康状况。

一种研究的毒物是顺铂。研究的另一种毒物是阿霉素。另一项实验调查了促性腺激素促卵泡激素和黄体生成素对单个卵泡生长的影响。

但是这种分析卵泡大小是定期测量的，以绘制它们的生长情况。使用表达 A GFP 的卵泡研究卵泡卵泡共培养，野生型卵泡过程从一个延伸到另一个。这种共培养物的免疫组织化学处理表明，GFP 过程位于野生型中。

鞘层、野生型新生卵巢也与表达 GFP 的卵泡共培养。在这种情况下，GFP 过程通过卵巢间质迁移。新生儿卵巢培养是一种非常简单的方法，但预计需要花一些时间掌握解剖未受损的完整窦前卵泡的技术。

这对于他们的正常发展至关重要。卵泡培养后，卵母细胞可以通过体外受精受精，然后胚胎可以转移到假怀孕雌性并获得活幼体。