Name: 的hiPSC神经细胞系特异性敲开记者代高效使用CRISPR / Cas9和Cas9双切口酶系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 46 s
Description: 学习使用CRISPR/Cas9和Cas9双切口酶系统高效生成hiPSC神经细胞系特异性敲入报告基因。该方法通过同源重组提高基因靶向效率，为神经发育和疾病研究提供可靠工具。

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本工作由神经外科、纪念赫尔曼基金会斯塔曼·奥格尔维基金、德克萨斯大学休斯顿健康科学中心本特森卒中中心以及使命连接蒂尔基金会资助。

1. 靶向载体的设计与载体构建
<ol>
	<li>确定谱系特异性标记物后，查找该基因的基因组序列，并据此设计同源臂。5’同源臂长度约为1 kb，3’同源臂长度约为1.5 kb（图1）。</li>
	<li>通过亚克隆将报告基因表达盒依次插入到基因组序列的下游、终止密码子之前，以确保内源性表达不受改变或破坏。使用自剪切的2A肽序列（F2A、E2A或T2A）20,21或内部核糖体进入位点（IRES）连接报告基因或双报告基因表达盒。 
	注意：报告基因可包括荧光蛋白（如GFP、tdTomato、tagRFP、YFP）、荧光素酶、抗生素抗性表达盒，或荧光蛋白与抗生素抗性表达盒的组合。例如，在图1中展示了针对人ALDH1L1基因的打靶载体构建，该载体在EGFP和新霉素抗性表达盒标记下进行。</li>
	<li>在报告基因下游添加一个阳性筛选表达盒。该阳性筛选元件为两侧带有loxP位点的抗生素抗性表达盒，在筛选并分离出阳性克隆后，可从靶向修饰的iPSC中将其切除。</li>
	<li>在3’同源臂之外包含一个阴性筛选表达盒。常用的阴性筛选表达盒包括胸苷激酶（TK）和白喉毒素A（DTA）22。</li>
	<li>获取含有所述谱系标记物序列的人源BAC克隆，并通过PCR扩增验证克隆的正确性。利用重组工程技术，在含pKD46的DH5α菌株中构建打靶载体，以捕获目标位点23。必要时可采用多片段Gateway或Golden Gate克隆策略23,24。</li>
</ol>
2. CRISPR/Cas9 系统中sgRNA的设计与载体构建。
<ol>
	<li>确定将用于构建报告基因的谱系特异性标志物。从NCBI数据库复制cDNA序列。前往人类BLAT搜索以获取基因组DNA比对结果。</li>
	<li>点击“browser”标签查看基因的组装结果。在“View”标签下，点击“DNA”以获取FASTA格式的完整基因组DNA序列。</li>
	<li>在DNA序列中定位终止密码子，用于插入2A序列和报告基因盒。</li>
	<li>寻找原间隔序列邻近基序（PAM， 即在终止密码子附近（约上下游100 bp范围内）搜索NGG序列。对两条链均进行扫描以定位合适的NGG序列。考虑上游序列的特异性，以避免潜在的脱靶效应。可使用BLAST和CasOT等开源工具（详见步骤5）。</li>
	<li>将NGG上游紧邻的20个碱基序列复制，并粘贴至网络设计工具ZiFit中，用于设计带有与人类gRNA表达载体（含U6启动子）MLM3636兼容的突出末端的寡核苷酸。</li>
	<li>合成正向和反向寡核苷酸 7.</li>
	<li>为了制备双链sgRNA，在70℃下使两条寡核苷酸链变性 &#176;C，15 分钟，然后逐渐冷却至室温。对于 50 &#181;l 反应，加入 22.5 &#181;正向和反向寡核苷酸各 l（储存浓度为 0.1 mM），以及 5 &#181;100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，1.5 M NaCl，pH 8.0的退火缓冲液</li>
	<li>将第2.7步获得的寡核苷酸与经BsmBI酶切的人源gRNA表达载体（含U6启动子）MLM3636混合并进行连接。对于20 &#181;l 反应，加入 1 &#181;来自步骤 2.7 的寡核苷酸，100 ng MLM3636，以及 1 &#181;400 U 的 T4 连接酶，室温孵育过夜。</li>
	<li>转化 DH5&#945; 通过42℃热激将连接产物转化至感受态细胞&#176;C，30 秒。在 LB 琼脂氨苄青霉素（100 &#956;g/ml）板在37℃&#176;C O/N。根据制造商说明书，挑取3~5个菌落进行质粒小提。将质粒DNA送至商业测序公司进行测序验证。根据制造商说明书，对正确的质粒进行质粒大提。</li>
	<li>通过T7核酸内切酶1（T7E1）检测评估sgRNA（详见步骤4）。将hiPSC转染携带sgRNA的质粒，sgRNA将在MLM3636骨架中的内置U6启动子驱动下表达（详见步骤6）。</li>
</ol>
3. Cas9n 双切口酶 sgRNA 的设计与构建
<ol>
	<li>获取双切口酶 Cas9n D10A 载体 pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A)。</li>
	<li>为每个靶向位点设计一对正向和反向寡核苷酸。复制紧邻NGG上游的20个碱基序列（如步骤2所述），并将其粘贴至网络设计工具ZiFit中。</li>
	<li>为了获得与载体pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A)兼容的黏性末端，需去除ZiFit设计工具中显示的正向和反向寡核苷酸的首尾各一个碱基。</li>
	<li>合成正向和反向寡核苷酸7。将这些寡核苷酸命名为f(n)-F、f(n)-R（用于靶位点一侧的PAM序列）和r(n)-F、r(n)-R（用于靶位点另一侧的PAM序列）。其中，n为区分不同PAM序列的编号，小写字母f和r分别代表PAM位于正义链（f）或反义链（r），F和R分别代表正向和反向寡核苷酸。
	<ol>
		<li>使用T7E1检测法（详见步骤4）测试多对组合（例如，r5和f2），以确定适用于Cas9n的最优sgRNA配对。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为形成双链sgRNA，将两条寡核苷酸在70 °C下变性15分钟，然后逐渐冷却至室温。在50 µl反应体系中，分别加入22.5 µl正向和反向寡核苷酸（储存浓度为0.1 mM），以及5 µl退火缓冲液（100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，1.5 M NaCl，pH 8.0）。</li>
	<li>将步骤3.5中获得的寡核苷酸与经BbsI酶切的pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A)载体混合并进行连接反应。在20 µl反应体系中，加入1 µl步骤3.5所得sgRNA，100 ng Cas9n (D10A) 载体DNA，以及1 µl（400 U）T4 DNA连接酶。于室温孵育过夜。</li>
	<li>将连接产物通过热激法转化至DH5α感受态细胞（42 °C，30秒）。将细菌接种于含氨苄青霉素（100 μg/ml）的LB琼脂平板，在37 °C培养过夜。根据制造商说明书挑选3~5个单菌落进行质粒小量提取。送商业测序公司对质粒DNA进行测序验证。根据制造商说明书对正确质粒进行大量提取。</li>
	<li>通过T7E1检测法评估sgRNA活性（详见步骤4）。将质粒转染至hiPSC细胞，sgRNA将在Cas9n (D10A) 载体骨架内置的U6启动子驱动下表达（详见步骤6）。</li>
</ol>
4. 通过T7核酸内切酶1（T7E1）检测评估sgRNA活性
<ol>
	<li>对于一个24孔板，在转染前一天（第-1天）每孔接种2 × 105个293FT细胞。</li>
	<li>在转染当天（第0天），将sgRNA质粒和Cas9表达载体共同转染至293FT细胞中。每孔加入0.5 µg sgRNA载体、0.5 µg Cas9表达载体JDS246（Cas9-003）以及1.5 µl Lipofectamine 2000。
	<ol>
		<li>作为阴性对照，用0.5 µg GFP表达载体（例如，基于pcDNA3骨架、由CMV启动子驱动的GFP）替代sgRNA载体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>72小时后（第3天），加入100 µl DNA快速提取缓冲液，剧烈吹打以收集细胞。</li>
	<li>将混合物在68 °C孵育15分钟，然后在95 °C孵育8分钟。所得产物作为后续PCR实验的模板。</li>
	<li>设计上下游PCR引物以扩增PAM序列侧翼区域。通常目标PCR产物长度约为400–500 bp。合成寡核苷酸引物7。</li>
	<li>对于50 µl的PCR反应体系，加入第4.5步获得的模板1 µl、Herculase II 0.5 µl、DMSO 0.5 µl、5×缓冲液10 µl、dNTP混合液0.5 µl，以及上下游引物混合液各1 µl。</li>
	<li>采用以下PCR程序：98 °C预变性2分钟；进行35个循环（98 °C变性20秒，59 °C退火20秒，72 °C延伸1分钟），最后在72 °C延伸5分钟。 
	注意：此处描述的PCR条件适用于多个已测试基因，可获得特异性扩增产物。然而，这些条件依赖于用户所选择的目标基因。以基因组DNA为模板的PCR通常需要优化，以确保无非特异性条带出现。这些额外条带可能在T7E1酶切分析后与切割产物混淆。</li>
	<li>使用分光光度计在A260处测定PCR产物的DNA浓度。</li>
	<li>取400 ng PCR产物加入2 µl Digestion buffer 2中，用ddH2O补足至终体积19 µl。将反应管置于沸水中孵育5分钟，随后置于实验台上自然冷却至室温（45–60分钟）。</li>
	<li>加入1 µl T7E1（10单位/µl），37 °C孵育15分钟。加入2 µl 0.25 M EDTA与6× DNA上样染料的混合液以终止反应。</li>
	<li>将2.5 g琼脂糖粉末溶于100 ml 1×TAE缓冲液中，微波加热溶解后倒入电泳槽制胶。待凝胶凝固后，将全部20 µl反应产物上样至2.5%琼脂糖凝胶中，在100–150 V电压下电泳30分钟。</li>
	<li>在紫外光下观察凝胶结果（图3）。T7E1会在错配位点进行切割。对于已引发非同源末端连接（NHEJ）的sgRNA，其PCR产物相较于阴性对照（见步骤4.3）会出现额外的快速迁移条带（分子量更小）。</li>
	<li>通过ImageJ软件比较条带密度，估算并排序sgRNA的切割效率及插入缺失百分比（indel%）。
	<ol>
		<li>对凝胶上每个样品的条带分别标记为未切割条带、切割条带1和切割条带2。</li>
		<li>根据ImageJ软件手册，测量各条带的密度值。</li>
		<li>使用以下公式计算fcut：fcut = (切割条带1 + 切割条带2) / (未切割条带 + 切割条带1 + 切割条带2)</li>
		<li>使用以下公式计算Indel%：Indel% = 1 - √(1 - fcut)。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 计算机模拟 潜在脱靶位点的预测
注意：可使用一种名为 CasOT17 的在线开源工具预测潜在的脱靶位点，该工具是一个基于 Perl 的程序。
<ol>
	<li>对于 Windows 系统，将 CasOT 程序和人类基因组数据库文件下载至本地硬盘。</li>
	<li>准备设计好的sgRNA的靶序列文件，格式为FASTA。</li>
	<li>打开名为“casot”的文件。一个命令窗口将出现。暂时保持其状态不变。</li>
	<li>打开名为“opt-generator”的文件以生成选项字符串。将目标文件的路径和名称粘贴到“-t”或“-target”选项的对话框中。</li>
	<li>将基因组序列文件的路径粘贴到“-g”或“-genome”选项的对话框中。</li>
	<li>输入 –s 或 –seed 的值（默认值为 2）以及 –n 或 –nonseed 的值（默认值为 255）。选项字符串将生成并显示在页面顶部的文本框中。</li>
	<li>复制选项字符串，并将其粘贴到第5.3步所述的CasOT命令窗口中。 
	注意：运行 CasOT 程序可能需要 30–90 分钟，具体时间取决于所选选项和使用的计算机。完成后，将生成一个名为 &#8216;&#60;input_target_file&#62;-&#60;基因组文件&#62;-&#60;脱靶相关选项&#62;&#8217; 将生成两个文件，文件夹中包含一个描述统计信息的“.stat”文件和一个包含详细搜索结果的.csv（逗号分隔值）文件。&#60;/脱靶相关选项&#62;&#60;基因组文件&#62;&#60;请提供需要翻译的具体源文本内容，以便我按照您的要求进行专业翻译。&#62;</li>
	<li>使用电子表格程序打开 .csv 文件。文件中为每个脱靶位点提供以下信息：染色体和基因组位置、位点序列、错配（Mm）类型、错配碱基总数以及与脱靶位点相关的外显子信息。</li>
	<li>为具有以下位点设计PCR引物 &#60;2 mM，无论是在种子序列还是非种子序列中。</li>
	<li>对选定的阳性hiPSC克隆进行PCR，反应条件如下：98 &#176;C 2分钟，35个循环：98 &#176;C，20 秒，59 &#176;C，20 秒，72 &#176;C 下 1 分钟，最后在 72℃ 延伸 &#176;5 分钟，C 
	注意：本文所述的PCR参数在本实验室测试的多个基因中均能扩增出特异性产物。然而，这些条件取决于用户所选择的目的基因。以基因组DNA为模板的PCR反应通常需要优化，以确保不出现非特异性条带。</li>
	<li>对PCR产物进行测序，将测序结果与预期序列比对，并搜索突变。如果存在突变，则确认存在脱靶效应。</li>
</ol>
6. 制备神经谱系报告基因的hiPSC电穿孔
<ol>
	<li>在Geltrex包被的培养皿中，使用TeSR-E8培养基培养hiPSCs。电穿孔前两天将培养基更换为MEF-CM（小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基）。加入2 ml Accutase孵育5分钟，收集细胞。</li>
	<li>使用以下条件，将线性化的靶向载体、Cas9-003表达载体和sgRNA载体共同电穿孔转染hiPSCs：每转染1×107个hiPSCs，共转染2.5 µg sgRNA、2.5 µg Cas9和50 µg靶向载体。若采用双切口酶策略，则加入50 µg靶向载体和每种sgRNA各2.5 µg（sgRNA载体同时共表达Cas9n）。</li>
	<li>按照文献24,25所述方法进行阳性与阴性筛选以获得单克隆。</li>
	<li>通过Southern印迹分析或长片段基因组PCR鉴定阳性克隆24,25。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

基因靶向是研究基因功能的重要工具。然而，由于其效率相对较低，需要耗费大量人力和时间。近年来，基因组编辑工具的发展，特别是CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas（CRISPR相关蛋白）系统的出现，显著提高了靶向效率。本文描述了一种利用CRISPR/Cas系统介导的同源重组技术，构建谱系特异性人类诱导多能干细胞（hiPSC）报告细胞系的实验方案。文中详细介绍了使用CRISPR/Cas系统进行基因组编辑以获得神经谱系报告细胞系所需各组分的操作步骤，重点阐述了靶向载体以及用于Cas9和Cas9n双切口酶系统的单导向RNA的构建方法。
CRISPR/Cas9 系统可用于满足人诱导多能干细胞（hiPSCs）中多种基因工程需求。该系统可用于构建基因敲除和基因敲入（例如，报告基因）细胞系、诱导型平台细胞系以及进行突变校正。根据基因修饰的目的，可设计并构建相应的靶向载体，使得在 Cas9 诱导产生双链断裂（DSB）后，发生同源定向重组（HDR），而非易错的非同源末端连接（NHEJ）。若目的是在特定基因座引入错义突变，则转染 sgRNA 和 Cas9 即可，无需使用靶向载体。
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CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas（CRISPR相关蛋白）系统，连同其他基因组编辑工具，在近年来彻底改变了人类基因组的操作方式1-7。CRISPR/Cas9系统的主要组分是单链向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白。Cas9是一种RNA引导的II型DNA内切酶，具有两个核酸酶结构域——HNH和RuvC，可在原间隔序列邻近基序（PAM）附近的特定基因组区域产生DNA双链断裂（DSBs）7-10。sgRNA兼具crRNA和tracrRNA的功能，这两种RNA分子是细菌（如Streptococcus pyogenes）和古菌中发现的适应性免疫RNA分子，用于抵御外源DNA的入侵9-11。当被合理设计并共导入哺乳动物细胞后，sgRNA可识别PAM序列，与靶DNA的互补链进行碱基配对，并引导及转激活Cas9蛋白，在PAM序列上游立即切割双链DNA7。随后，细胞将通过同源定向重组（HDR，存在靶向载体时）或非同源末端连接（NHEJ）机制修复这些双链断裂。外源基因如cDNA、报告基因盒或抗生素抗性片段可被整合，从而构建转基因或基因敲入细胞系。
尽管CRISPR/Cas9系统具有高效性和相对特异性，但已有报道称其存在非预期的脱靶效应12-15。为了最大限度减少脱靶事件，研究人员已开发出Cas9切口酶（Cas9n）9,10,14,16,17。Cas9n（Cas9 D10A 或 Cas9 H840A）是在两个核酸酶结构域之一上携带突变的Cas9酶，仅能在DNA的一条链上产生单链切口。为了实现双链切割，需设计两个sgRNA来引导一对切口酶，分别在两条不同DNA链上的邻近位点进行切割。这种“双切口”策略相较于传统的Cas9平台需要更严格的设计，但可在基因编辑实验中同时实现高效率和高特异性。
本文描述了一种利用CRISPR/Cas系统介导的同源重组技术，生成谱系特异性人类诱导多能干细胞（hiPSC）报告细胞系的实验方案。文中详细介绍了使用CRISPR/Cas系统进行基因组编辑以构建神经谱系报告细胞系所需各组分的操作步骤，重点阐述了靶向载体和单导RNA（sgRNA）的构建方法。该方案已在多种hiPSC细胞系中成功重复，包括来自健康个体及中枢神经系统（CNS）疾病患者的细胞系。本实验室已靶向的基因包括OLIG2、HB9（MNX1）、NEUROG2、SOX1、ALDH1L1和SOD1。在hiPSC中，通过CRISPR/Cas系统介导的同源重组所实现的靶向效率为20–40%，与既往报道结果一致1,18,19。相较于传统基因靶向实验中典型的1–2%效率，本方法的靶向效率显著提高。

<table><tbody><tr><td>pStart-K</td><td>Addgene</td><td>20346</td><td></td></tr><tr><td>pWS-TK6&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>20350</td><td></td></tr><tr><td>pKD3&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>45604</td><td></td></tr><tr><td>pKD46</td><td>大肠杆菌遗传保种中心，CGSC</td><td>7634</td><td></td></tr><tr><td>PGK-neo-bpA 序列&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>13442</td><td></td></tr><tr><td>人类目标基因的BAC克隆&amp;nbsp;</td><td>https://bacpac.chori.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JDS246（Cas9-003），哺乳动物密码子优化的化脓性链球菌 Cas9-3X Flag</td><td>Addgene</td><td>43861</td><td></td></tr><tr><td>MLM3636，带有U6启动子的人源gRNA表达载体&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>43860</td><td></td></tr><tr><td>pX335-U6-嵌合体_BB-CBh-hSpCas9n(D10A)</td><td>Addgene</td><td>42335</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA 设计，ZiFit</td><td>http://zifit.partners.org/ZiFiT/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脱靶预测工具 CasOT</td><td>http://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perl</td><td>http://www.perl.org/get.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BLAT</td><td>https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sgRNA 引物合成</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Top10 电转感受态大肠杆菌，一管装</td><td>Life Technologies</td><td>C4040-50</td><td></td></tr><tr><td>AccuPrime Pfx SuperMix</td><td>Life Technologies</td><td>12344-040</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶</td><td>NEB 和 Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean 凝胶 DNA 回收试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D4007</td><td></td></tr><tr><td>DNA快速提取缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Epicentre</td><td>QE0905T</td><td></td></tr><tr><td>Herculase II 融合 DNA 聚合酶</td><td>安捷伦科技</td><td>600675</td><td></td></tr><tr><td>消化缓冲液2</td><td>新英格兰生物实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6X DNA上样缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E8 人胚胎干细胞/人诱导多能干细胞维持试剂盒</td><td>干细胞技术</td><td>05940</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>50xTAE</td><td>Life Technologies</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 培养基&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;不含钙和镁的磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A12856-01</td><td></td></tr><tr><td>含谷氨酰胺-最大量的D-MEM/F12培养基&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>含谷氨酰胺的D-MEM培养基&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10566040</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清-胚胎干细胞级别&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10439</td><td></td></tr><tr><td>无血清替代物&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇 1000X&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Stempro Accutase&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Dispase&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>12760-013</td><td></td></tr><tr><td>ROCK抑制剂Y-27632</td><td>Millipore</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; SCM075</td><td></td></tr><tr><td>SMC4 试剂&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>354357</td><td></td></tr><tr><td>新霉素抗性小鼠胚胎成纤维细胞&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>PMEF-NL</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素抗性MEF&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>PMEF-HL</td><td></td></tr><tr><td>G418（遗传霉素）</td><td>LifeTechnologies</td><td>11811</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素B&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>FIAU（Fialuridine，1-2-脱氧-2-氟-&amp;szlig;D-阿拉伯呋喃糖基-5-碘尿嘧啶</td><td>&amp;nbsp;莫拉维克生化与放射化学公司</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; M251</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪：Gene Pulser Xcell&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.4 cm 电穿孔比色皿&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>DIG-高效DNA标记与检测起始试剂盒II&amp;nbsp;</td><td>罗氏</td><td>11585614910</td><td></td></tr><tr><td>杂交变性溶液&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>82021-478</td><td></td></tr><tr><td>PCR DIG探针合成试剂盒&amp;nbsp;</td><td>罗氏</td><td>11636090910</td><td></td></tr><tr><td>DIG洗涤液套装&amp;nbsp;</td><td>罗氏</td><td>11585762001</td><td></td></tr><tr><td>抗地高辛（DIG-AP）</td><td>罗氏</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>CSPD 化学发光系统&amp;nbsp;</td><td>罗氏</td><td>11755633001</td><td></td></tr><tr><td>DIG洗涤与封闭缓冲液套装&amp;nbsp;</td><td>罗氏</td><td>11585762001</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>24710030</td><td></td></tr><tr><td>印迹缓冲液（25 mM Tris，pH 7.4，&amp;nbsp; 0.15 M NaCl,&amp;nbsp; 0.1% Tween20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoefer 紫外交联仪&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-500-308</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>AC13274-0010</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl 2M (pH 7.5)</td><td>VWR</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; 200064-506</td><td></td></tr><tr><td>Denville Scientific 蓝色生物膜 8x10&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>nc9550782</td><td></td></tr><tr><td>DNA分子量标记物II（DIG标记）</td><td>罗氏</td><td>11218590910</td><td></td></tr><tr><td>Amersham 印迹膜 Hybond-N+&amp;nbsp;</td><td>罗氏</td><td>95038-400</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 玻璃干燥盘&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>15-242A</td><td></td></tr><tr><td>金佰利C型折叠纸巾&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>06-666-32B</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3MM 滤纸 (26×41)</td><td>Fisher</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; 05-713-336</td><td></td></tr><tr><td>杂交袋&amp;nbsp;</td><td>罗氏</td><td>11666649001</td><td></td></tr><tr><td>杂交管&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-247-300</td><td></td></tr><tr><td>杂交炉旋转架 Shake 'n' Stack&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>HBMSOV14110</td><td></td></tr></tbody></table>

利用crispr/cas9与cas9双切口酶系统高效构建hipsc神经谱系特异性敲入报告细胞系

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

基因靶向是现代生物医学研究中用于鉴定基因功能的关键方法。然而，人类细胞中基因靶向的效率较低，限制了人类细胞系以理想速度的建立。过去两年中，基因组编辑工具（如CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas（CRISPR相关蛋白）系统）在提高基因操作效率方面取得了快速进展。本文描述了一种利用CRISPR/Cas系统介导的同源重组技术，构建谱系特异性人类诱导多能干细胞（hiPSC）报告细胞系的实验方案。文中详细介绍了使用CRISPR/Cas系统构建神经谱系报告细胞系所需关键组分的操作步骤，重点包括靶向载体和单导向RNA的设计与构建。该方案还可拓展应用于hiPSC中的平台建立及突变修复。

包含同源臂、报告基因盒、阳性与阴性筛选盒等所有必要元件的靶向载体被构建 （图1）。根据内源基因组位点，设计并构建多个（2至3个）sgRNA（若使用Cas9系统）或sgRNA配对（若使用Cas9n双切口酶策略），并将其克隆至人源sgRNA表达载体MLM3636或pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) 骨架中 （图2）。在转染人诱导多能干细胞（hiPSCs）之前，通过T7E1检测在293FT细胞中评估sgRNA的切割效率 （图3）。同时预测脱靶位点。选择切割效率适中（插入缺失率在10%-30%之间）且通过in silico分析（步骤5）预测潜在脱靶位点较少的sgRNA，通过电穿孔法用于转染hiPSCs。在成功转染并完成筛选后，鉴定阳性克隆。如有需要，使用从阳性克隆中提取的基因组DNA，对潜在脱靶位点进行PCR扩增。随后通过测序或T7E1检测，确定是否存在脱靶效应。
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基因组编辑工具（如CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas（CRISPR相关蛋白）系统）显著提高了在人诱导性多能干细胞（hiPSCs）中进行基因靶向的效率。本文描述了一种利用CRISPR/Cas系统介导的同源重组技术，构建谱系特异性hiPSC报告细胞系的实验方案。

利用CRISPR/Cas9与Cas9双切口酶系统高效构建hiPSC神经谱系特异性敲入报告细胞系

基因靶向是现代生物医学研究中用于鉴定基因功能的关键方法。然而，人类细胞中基因靶向的效率较低……

本实验的总体目标是利用 CRISPR Cas9 介导的同源重组技术，生成谱系特异性的人诱导性多能干细胞（H-iPSC）基因敲入报告系统。该目标的实现分为两个步骤：第一步是设计并构建靶向载体；第二步是为 CRISPR Cas9 系统或 CAS9n 双切口酶系统设计并构建单导向 RNA。将293FT细胞与单导向RNA、Cas9表达载体共转染，随后提取DNA并进行扩增，通过T7内切酶I分析进行检测。最后一步是利用计算机模拟预测潜在的脱靶位点。最终，将用人源诱导多能干细胞（hiPSCs）转染靶向载体和CRISPR-Cas9系统组分，以构建神经谱系敲入报告细胞系。与传统的同源重组等现有方法相比，该技术的主要优势在于CRISPR介导的基因靶向具有更高的靶向效率。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为设计单链向导RNA需要一定的实践经验。该方法的可视化演示至关重要，因为单导向RNA设计及脱靶位点的体外预测步骤较难掌握，CRISPR-Cas9基因编辑技术是近期才被引入的，且需使用新的在线资源工具。在确定谱系特异性标记后，查找该基因的基因组序列，并据此设计同源臂。本示例中使用的是A LDH 1L 1基因组位点。通过将GFP亚克隆至基因组序列下游、终止密码子上游，并利用自剪切的双A肽序列连接，构建靶向载体；在报告基因下游添加一个阳性筛选盒，例如Flox的新霉素筛选盒；在3'同源臂之外加入一个阴性筛选盒，例如胸苷激酶。首先确定将要靶向的谱系特异性标记物以构建报告系统，本示例中使用LDH1L1。从NCBI数据库复制cDNA序列。前往人类基因组浏览器搜索以获取基因组DNA比对结果。点击浏览器标签，在“视图”标签下查看该基因的组装情况。点击“DNA”以FASTA格式获取完整的基因组DNA序列。在DNA序列中定位终止密码子的位置，该位置将用于插入双向序列和报告基因盒。在终止密码子附近查找原间隔序列邻近基序（PAM），例如NGG，并扫描两条链以确定合适的NGG序列。复制NGG上游紧邻的20个碱基序列，并将其粘贴至Z fit设计工具中，设计出具有与MLM 3 6 3 6兼容的突出末端的寡核苷酸。带有U6启动子的人源GRNA表达载体。在合成正向和反向寡核苷酸后，进行50微升反应体系的双链单导向RNA制备。分别加入22.5微升正向和反向寡核苷酸，以及5微升退火缓冲液，在70摄氏度下变性15分钟，然后逐渐冷却至室温。接下来，将寡核苷酸与经BSMBI酶切的MLM 3 6 3 6进行混合并连接。对于20微升的反应体系，加入1微升寡核苷酸、100纳克MLM 3 6 3 6以及1微升T4 DNA连接酶，于室温孵育过夜。次日，通过在42摄氏度热激30秒，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中。随后将细菌接种于含氨苄青霉素的LB琼脂平板，在37摄氏度下过夜培养。第二天，挑选3至5个菌落进行质粒制备。随后，通过商业测序确认质粒DNA，并使用标准的大量提取（maxi prep）方案制备正确的质粒。要开始此实验流程，请获取一个双切口酶Cas9 ND10a载体，针对每个靶向位点，按照CRISPR-Cas9系统中展示的相同方法设计一对正向和反向寡核苷酸。本示例中仍以LDH1 L1为例。复制NGG上游紧邻的20个碱基序列，并将其粘贴到网页中。使用Z fit设计工具获得与载体相容的带有突出末端的寡核苷酸。将Z fit设计工具显示的正向和反向寡核苷酸的第一个和最后一个碱基去除。合成正向与反向寡核苷酸，并按以下方式命名：对于靶位点一侧的PAM序列，命名为小写fn大写F和小写fn大写R；对于靶位点另一侧的PAM序列，命名为小写R大写F和小写R大写R。其中，n为用于区分不同PAM序列的数字编号，小写f和r表示PAM位于正义链或反义链，大写F和R分别代表正向和反向寡核苷酸。在通过T7E1检测确定用于Cas9n的最优单导向RNA配对后，开始制备双链单导向RNA：在50 µL反应体系中，分别加入22.5 µL的正向与反向寡核苷酸，以及5 µL退火缓冲液。将两条寡核苷酸在70摄氏度下变性15分钟，然后逐渐冷却至室温。将寡核苷酸与bbbs混合并进行连接，使用经双酶切的CAS九ND 10a载体。对于20微升的反应体系，加入1微升的单导向RNA、100纳克的bbbs、1份经消化的载体以及1微升T4连接酶，于室温孵育过夜。将连接产物通过42摄氏度、30秒的热激转化至DH5α感受态细胞中。在37摄氏度下，于含氨苄青霉素的LB琼脂培养基中培养细菌过夜。次日，挑选3至5个菌落进行质粒制备。随后，通过商业测序服务确认质粒DNA，使用标准的大提纯方案制备正确的质粒，以开始本实验。将293 ft细胞共转染单导向RNA质粒和Cas9表达载体，每份转染加入0.5微克单导向RNA载体、0.5微克Cas9表达载体以及1.5微升Lipofectamine 2000。将细胞在37摄氏度下孵育72小时。72 小时后，从每个孔中移除培养基以收获细胞。加入 100 微升 DNA 快速提取缓冲液，剧烈振荡后将细胞转移至离心管中。先在 68°C 下孵育混合物 15 分钟，随后在 95°C 下孵育 8 分钟。这是后续PCR实验的模板。设置PCR反应以扩增原间隔序列邻近基序侧翼的序列。对于50微升反应体系，加入1微升模板、0.5微升Hercules、2个0.5微升DMSO、10微升5×缓冲液、0.5微升dNTP混合物，以及1微升正向引物和反向引物的混合物。按照方案中描述的参数进行PCR反应。当PCR完成后，将PCR产物的DNA浓度调整为每2微升消化缓冲液二中加入400纳克PCR产物，再加入去离子水，使最终反应体系体积为19微升。在沸水中孵育5分钟。将反应液置于实验台上静置45至60分钟，使其自然冷却至室温。接下来，加入一微升 T7E1 酶，在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。加入两微升 0.25 摩尔的 EDTA 与 6×DNA 上样染料的混合液以终止反应。将全部 20 微升反应产物上样至 2.5% AROS 琼脂糖凝胶中。 以 100 至 150 伏电压电泳 30 分钟。在紫外光下观察凝胶，以评估单导向 RNA 介导的切割效果。随后通过电穿孔将线性化的靶向载体 CAS 9 0 0 3 表达载体和适当的单导向 RNA 载体或多个载体导入人诱导性多能干细胞（HI PSCs），从而构建神经谱系报告系统。潜在的脱靶位点可使用一种名为 CS ot 的基于 Perl 的开源在线工具进行预测。对于窗口系统，请将 CS OT 程序和人类基因组数据库文件下载到本地硬盘。准备设计好的单导向 RNA 的目标文件，格式为 FASTA。打开名为 cas ot 的文件。将出现一个命令窗口。暂时保持其状态不变。接下来，打开名为 opt generator 的文件。要生成选项字符串，请将目标文件的路径和名称粘贴到减T或减目标选项的对话框中。将基因组序列文件的路径粘贴到减G或减基因组选项的对话框中。复制该选项字符串，并将其粘贴到CAS OT命令窗口中。如前所示，在 cas OT 程序运行完成时，将生成一个文件夹。使用电子表格程序打开该文件夹中的 CSV 文件。该文件包含每个脱靶位点的以下信息：染色体位置和基因组位置。在切割前，关于脱靶位点的错配类型序列、错配碱基总数以及外显子信息。HI PSCs。单导向RNA在293FT细胞中通过T7E1实验进行评估。在此代表性结果中，设计了靶向人类 oli 的单导向 RNA。第一至第三基因泳道转染了 CAS9 表达载体，第四至第十一泳道转染了 CAS9 N 末端酶表达载体。GFP 用作对照。第二泳道含有针对oli的单导向RNA。第五泳道仅含有使用Cas9的靶向结合正义链。第六泳道仅含有单导向RNA结合的反义链，第九和第十泳道则含有针对双链DNA的一对单导向RNA。未消化的PCR产物大小约为614个碱基对，位于第2泳道。在第9和第10泳道中，部分PCR产物被消化为两条带，大小分别约为470个碱基对和140个碱基对，插入缺失比例为33%。而在插入缺失比例为3%至8%的情况下，两条消化条带大小分别约为410个碱基对和200个碱基对。一旦掌握该技术，载体构建、单导向序列设计及评估可在约一周内完成。在正确完成其构建后，该技术为干细胞生物学领域的研究人员铺平了道路，使其能够广泛研究人类系统发育和疾病中的基因功能。观看本视频后，您应能够充分理解如何设计和构建用于CRISPR Cas9及Cas9n双N系统的单导向阵列。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

的hiPSC神经细胞系特异性敲开记者代高效使用CRISPR / Cas9和Cas9双切口酶系统

本文描述了利用iCRISPR平台生成人多能干细胞（hPSC）突变细胞系以及将hPSC分化为葡萄糖响应性β样细胞的实验方案。将基因组编辑技术与hPSC定向分化相结合，为系统分析谱系决定因子在人类发育和疾病进展中的作用提供了强有力的平台。...

利用基因组编辑和hPSC定向分化探究人类胰腺发育中的谱系决定因子

近年来，在体细胞系中进行基因操作的能力取得了显著进展，为基础研究和应用研究带来了巨大潜力。本文介绍了两种在哺乳动物细胞系中利用CRISPR/Cas9技术生成基因敲除并进行筛选的方法，一种使用可选择标记，另一种则不使用可选择标记。...

基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法

关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

本方案详细描述了在无饲养层条件下，从人胰腺细胞生成无足迹诱导多能干细胞（iPSCs）的过程，随后利用CRISPR/Cas9核糖核蛋白进行基因编辑，并对经修饰的单细胞克隆进行表征分析。...

利用CRISPR-Cas9系统高效生成和编辑人胰腺细胞来源的无饲养层iPSCs

本文描述了一种在小鼠和人类原代造血细胞中快速进行CRISPR/Cas9介导基因敲除的实验方案。通过电穿孔将Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物导入细胞，其中sgRNA通过体外转录生成 体外...

利用CRISPR/Cas9高效破坏小鼠和人类造血祖细胞中的基因

本文描述了利用CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）进行高效基因组编辑的实验方案，以快速构建具有造血系统特异性基因修饰的小鼠模型系统。...

慢病毒CRISPR/Cas9介导的基因组编辑用于疾病模型中造血细胞的研究

本方案提供了一种利用CRISPR-CAS9在人类多能干细胞中实现特定杂合或纯合核苷酸改变的方法。...

利用CRISPR-Cas9在人类多能干细胞中产生特定基因组修饰

本文介绍了一种利用基于piggyBac的供体质粒和Cas9切口酶突变体，在人类多能干细胞中实现无缝基因编辑的详细方法。在人类胚胎干细胞（hESCs）中，将两个点突变引入肝细胞核因子4α（HNF4α）基因座的第8号外显子。...

利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

本方案利用荧光报告基因和细胞分选技术，简化巨噬细胞和T细胞系中的基因敲入实验。这些简化的基因敲入实验使用两种质粒：一种是表达CRISPR/Cas9和DsRed2的质粒，另一种是表达EBFP2的同源重组供体质粒，后者可永久整合到免疫细胞的Rosa26位点。...

通过CRISPR/Cas9基因敲入及细胞分选在巨噬细胞和T细胞系中实现基因编辑

本实验方案描述了通过向受精卵显微注射CRISPR-Cas9系统和供体DNA，高效制备基因盒敲入和条件性敲除（floxed）小鼠的方法。...

通过受精卵显微注射在小鼠中构建基因盒敲入和Flox等位基因

随着CRISPR相关技术方案变得越来越实用且易于获取，在特定实验条件下仍可能出现复杂情况和障碍。本方案概述了利用CRISPR/Cas9技术构建受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1/RIP1）基因敲除人源细胞系的步骤，并重点指出了在此过程中可能遇到的潜在挑战。...

使用 CRISPR-Cas9 系统生成 RIP1 敲除 U937 细胞系

THP-1细胞系被广泛用作研究人类单核细胞/巨噬细胞在各个生物学相关研究领域中功能的模型。本文介绍了一种高效的基于CRISPR-Cas9的基因编辑和单细胞克隆分离方案，可实现稳定且可重复的表型数据的获取。...

基于电穿孔的CRISPR-Cas9介导的THP-1细胞基因敲除及单细胞克隆分离

学习使用CRISPR/Cas9和Cas9双切口酶系统高效生成hiPSC神经细胞系特异性敲入报告基因。该方法通过同源重组提高基因靶向效率，为神经发育和疾病研究提供可靠工具。

利用CRISPR/Cas9与Cas9双切口酶系统高效构建hiPSC神经谱系特异性敲入报告细胞系

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