在体内和体外途径研究银河系结构现货卵巢癌转移定植腹膜脂肪

该程序的总体目标是展示使用标准技术来定量腹膜脂肪库的卵巢癌定植。这是通过在特定时间点处死小鼠后将卵巢癌细胞腹膜内注射到小鼠体内来实现的。从小鼠中鉴定和分离腹膜脂肪库。

最后，使用流式细胞术定量存在于特定脂肪库中的卵巢癌细胞的数量。除了基于机制的研究外，还可以在离体共培养中研究卵巢癌细胞定植，然后进行适当的定量和/或分子分析。最终，这些体内和离体方法能够通过定性或定量方法询问涉及腹膜脂肪卵巢癌细胞定植的过程。

这种方法的主要优点是我们能够实施标准技术来评估腹膜脂肪 ovt 癌转移定植的具体步骤。该技术的意义扩展了转移预防。具体来说，它能够识别癌细胞微环境相互作用，这些相互作用调节卵巢癌细胞在含有称为乳斑的结构内的生长。

一般来说，刚接触这种方法的人会发现有处理老鼠的经验很有帮助。尽管腹腔注射看似简单，但缺乏好的技术会导致数据不准确。此外，组织解离到单细胞悬液中需要在实验开始前进行练习和精心规划。

这种特殊的技术不需要动物处于麻醉状态。根据批准的方案，在活体动物上执行此技术。将 500 μL 荧光标记的单细胞悬液装入注射器中。

然后将注射器放入无菌加盖的 25 号针头中，以减少注射前的细胞剪切。用另一只手束缚鼠标，抓住鼠标的脖子，用手掌和食指握住鼠标的尾巴。然后将左后腿固定在无名指和小指之间，以避免创伤腹部器官。

很好地约束鼠标，使其在注射过程中无法移动。想象一条横跨腹部的线，并在动物右侧找到一个靠近中线的点。入口点是第二个颅骨和最后一个的略微内侧。

准备将针头插入鼠标右侧，以避免盲肠并降低刺穿肠道的风险。将针头插入小鼠腹部的下侧区域，深度约为 0.5 厘米。向后拉柱塞，确认针头没有穿透血管或其他腹膜器官。

如果没有吸出液体，则使用缓慢、稳定的压力注入样品。然后拔出针头，将鼠标放回笼子里。在丢弃到锐器容器中之前，不要重新盖上注射器的盖子。

在注射后的特定时间点处死小鼠以去除重要器官。如文本协议中所述，收获腹膜脂肪库构成内脏器官切除。通过腹膜壁在靠近腹股沟纸的地方做一个中线切口，露出内部器官以切除网膜脂肪。

通过用镊子从腹膜腔延长脾脏来暴露网膜胰腺复合体，用于性腺脂肪。使用镊子提起卵巢周围的性腺脂肪，并通过切断组织连接将其切除。马上。将纸巾放入冰冷的 PBS 中。

接下来，使用镊子去除子宫脂肪，以抬起子宫角周围的子宫脂肪，并通过切断组织连接进行切除，然后立即将组织放入冰冷的 PBS 中。获得肠系膜脂肪时，切开小肠和幽门之间的交界处。用镊子牢牢抓住小肠的游离端，慢慢将其从肠系膜脂肪上剥离。

使用解剖剪刀从肠系膜根部释放肠系膜脂肪。然后立即将组织放入冰冷的 PBS 中。最后，要去除胸膜门静脉脂肪，使用镊子提起脾脏的远端，露出组织的薄脂肪带，将脾门与胰腺连接起来。

切除胸膜门静脉脂肪，首先从胰腺中释放，然后小心地从脾脏中解剖。然后立即将组织放入 PBS 中以开始称重。将所有脂肪组织与网膜相匹配。

将组织转移至分离的 5 毫升试管中，其中含有 1.5 毫升无血清 ECCO、改良 eagles 培养基或 DMEM 和 0.1% 牛血清白蛋白。汇集从三只独立小鼠收获的组织，以确保有足够的细胞产量用于流式细胞术。接下来，用手术剪刀将组织切碎，并加入 1.5 毫升含有 0.4% 胶原酶 one 的无血清 DMEM。

将组织悬液在 37 °C 下孵育 30 分钟，可选步骤为旋转混合。通过咀嚼进一步解离组织。在这种情况下，将组织胶原酶悬液转移到微型胃或袋子中，以低速咀嚼 10 分钟，5 分钟后旋转袋子的方向。

接下来，通过尼龙网状过滤器过滤样品以去除大碎片。通过在 4 摄氏度下以 250 倍 G 离心 5 分钟来收集细胞，并弃去上清液组分。将细胞沉淀重悬于 100 μL PBS 和 900 μL 氯化铵、钾裂解液、缓冲液中，并在室温下孵育 1 分钟。

然后像以前一样再次离心细胞，复苏后弃去上清液，将细胞沉淀悬浮在 250 微升冰冷的 PBS 中，通过 60 微米倾倒尼龙网过滤样品，以确保单细胞悬浮。然后用 250 微升冰冷的 PBS 生长冲洗过滤器，并制备荧光标记的细胞和复苏剂。以每毫升 200 万个细胞的浓度悬浮。

将大约 6 微升的组织粘合剂涂抹在培养物的膜上。插入并风干。然后用无菌水清洗膜两次以去除任何多余的粘合剂 在层流罩下风干膜之前，小心地切除 OA 并使用无菌镊子将其连接到涂有粘合剂的膜上。

让组织粘附在膜上 1 分钟后，在每个培养小室的每个网膜顶部添加 500 微升细胞悬液。然后用 2.5 毫升 DMEF 12 培养基填充 transwell 室周围的区域。将 OA 与细胞悬液在 37 摄氏度、5% CO2 环境中孵育 6 小时。

小心取出并用约 10 毫升 PBS 洗涤 OA。最后，使用适当的荧光成像系统可视化荧光癌细胞病灶。腹膜脂肪库的相对位置可以通过大体解剖看到。

这里显示的是 Pleo 门静脉和网膜脂肪的仔细观察。此处显示了切除的脂肪库的相对大小。使用标准组织学在网膜和多骨门静脉脂肪中观察到乳白色斑点。

显示了各种腹膜脂肪库的流动分析的定量结果。分析的门控标准如下所示。Ideate 亲本细胞用作阴性对照。

网膜组织制剂含有相对于子宫前膜和性腺脂肪的大量 TD 番茄阳性细胞。在定量流式细胞术中，数据表示为 TD 番茄阳性事件相对于 PBS 注射小鼠的平均倍数变化增加，以及 SKV 3 的 OA 离体定植，IP 1 GFP 卵巢癌细胞在此处显示。整个 OA 的荧光成像在体内和离体测定中显示出相似的癌细胞定位定植模式。

这些组织的组织学检查证实存在定位于乳白色斑点的癌细胞。最后，对 SKO V three IP one GFP 细胞表达的细胞角蛋白的免疫组织化学检测证实了这些组织学发现。在尝试此过程时，重要的是要记住识别并仔细切除腹膜脂肪组织，并防止被其他组织类型污染，这将扭曲从流式细胞术获得的定量数据。

第二件事，重要的是要记住为相关研究选择合适的菌株。该技术可用于识别网膜微环境中对转移形成很重要的成熟卵巢癌细胞系的相互作用。它还可用于评估模拟输卵管中早期病变的细胞系的恶性潜力。