Name: 非洲爪蟾作为一种模型来确定翻译减值 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 了解利用非洲爪蟾卵母细胞评估翻译起始因子突变对mos转录本翻译影响的方法。该方案通过显微注射和孕酮刺激，帮助研究人员研究蛋白质合成缺陷相关疾病的机制。

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本研究得到了法国国家健康与医学研究院（INSERM）、里尔大学1、里尔大学2以及里尔地区医院中心（CHR de Lille）资助。MCCH感谢法国基金会的支持，并感谢IRCL及Sonenberg教授惠赠V5质粒，Dissous博士（里尔巴斯德研究所）惠赠抗GFP抗体，里尔大学UMS 3387平台（里尔大学）提供非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞，以及Taymans博士（JPArc，里尔）对稿件文本的审阅。

所有 Xenopus 实验均在里尔第一大学动物实验中心按照欧洲共同体理事会关于实验动物使用指南（86/609/EEC）的规定进行。动物实验方案已获当地机构审查委员会（北部-加来海峡实验动物伦理委员会，CEEA 07/2010）批准。
1. 卵母细胞操作
<ol>
	<li>配制麻醉液：将1 g三卡因甲磺酸盐粉末溶解于1 L无菌水中。</li>
	<li>将雌性Xenopus laevis浸入该溶液中，盖上烧杯以防止其逃逸，静置约45分钟，直至动物完全镇静（对腿部夹捏无任何反应）。</li>
	<li>用肥皂清洗青蛙，再用自来水冲洗，然后将其仰卧置于洁净的铝箔上。</li>
	<li>用镊子夹住腹部侧面及卵巢位置的皮肤，使用经70%乙醇消毒的剪刀做约1 cm的切口。确保切口足够深，到达腹壁下方，以便切除含有处于不同发育阶段多个卵母细胞的卵巢组织。</li>
	<li>分离卵巢叶，在培养皿（50 mm）中用ND96培养基（96 mM NaCl，2 mM KCl，1 mM MgCl2，1.8 mM CaCl2，5 mM HEPES，用NaOH调节至pH 7.4，并添加50 µg/ml链霉素/青霉素、225 µg/ml丙酮酸钠、30 µg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、1 µl/ml四环素）清洗4次，以彻底去除血液和碎片。 
	注意：四环素有助于在显微注射处理后实现最佳保存和良好恢复。</li>
	<li>将卵巢叶置于加盖的培养皿中，完全浸没于培养基内，于14 °C保存，可维持一周。</li>
	<li>使用兽用可吸收缝合线和缝合针（需缝3至4针）缝合腹壁和皮肤。</li>
	<li>将动物放入无水的烧杯中，并用自来水润湿皮肤，直至青蛙恢复活动。盖上烧杯以防止逃逸。</li>
	<li>在体视显微镜（10倍放大）下，使用两对镊子在培养基中小心地将卵巢叶分离为每组5至10个卵母细胞。选择处于VI期的卵母细胞。可通过以下特征识别：i）其形态和颜色，动物极为深褐色色素沉着，植物极为黄色，两者之间有清晰的环带分界；ii）其直径大于1.2 mm10。</li>
	<li>将选出的卵母细胞置于胶原酶溶液中（1 mg/ml来自Clostridium histolyticum的胶原酶A，溶于不含四环素的ND96培养基），在培养皿中轻轻振荡孵育45分钟，以促进卵母细胞去滤泡（胶原酶可降解卵母细胞与滤泡细胞之间的连接）。用保持在14 °C的ND96培养基冲洗卵母细胞3至4次。 
	注意：孵育时间不得少于或多于45分钟，以免破坏卵母细胞表面蛋白并导致存活率降低。胶原酶处理可能诱发自发性生发泡破裂（GVBD）。</li>
	<li>将卵母细胞在培养基中孵育3至4小时。在双目放大镜下用精细镊子去除滤泡细胞，并将其在19 °C的ND96培养基中保存。</li>
</ol>
2. mRNA 合成的制备
<ol>
	<li>使用酶切消化法线性化以下质粒各5 µg PmeI 酶 
	注意：含有1599个氨基酸的eIF4G1野生型cDNA（eIF4G1-WT；NM_198241）的pcDNA6.2/V5-DEST，以及含有eIF4G1显性负性cDNA（eIF4G1-DN）突变体的pcDNA6.2/V5-DEST c.2105T&#62;G c.2106A&#62;C，c.2120-&#62;G，c.2122T&#62;A，2125T&#62;- 和 c.2126T&#62;G 在对应蛋白的第612至618位区域，干扰eIF4G1与eIF4E之间的相互作用8，含氯霉素乙酰转移酶（GFP）的 pcDNA6.2/C-EmGFP。为每种质粒分别制备 2 个混合物：第一个包含 Pme第一组加入I型酶，第二组不加酶作为对照。</li>
	<li>使用经典的乙醇方法沉淀质粒DNA，并将其重悬于20 µl无核酸酶的H₂O中2O.</li>
	<li>确定其&#160;使用分光光度计测定浓度。cRNA 反录所需的浓度应高于 150 ng/µl。</li>
	<li>使用0.8%琼脂糖凝胶，将1 µl样品及其对照与5 µl上样缓冲液一同电泳，以验证质粒的线性化。</li>
	<li>使用试剂盒进行 体外 根据制造商说明进行转录和cRNA纯化。将转录得到的cRNA重悬于20 µl无核酸酶的H中2O. 如有需要，样品可在 -80 °C 保存。</li>
	<li>配制含有0.2 M MOPS（pH 7.0）、20 mM醋酸钠和10 mM EDTA（pH 8.0）的MOPS 10×迁移缓冲液。用0.45 µm滤器过滤除菌。将溶液避光保存于室温，以防止溶液氧化。</li>
	<li>依次使用 NaOH 和 HCl 清洗电泳槽，然后用双滤水彻底冲洗，并过夜浸泡，以去除 RNase，防止 RNA 降解。</li>
	<li>制备含有MOPS和甲醛的1.5%琼脂糖凝胶。加热至琼脂糖完全溶解，冷却至55 °C。在通风橱内，加入0.1体积的10× MOPS缓冲液、6.6%甲醛和4 µg溴化乙锭（10 mg/ml）。在通风橱中倒入凝胶&#160;等待约1小时，直至凝胶完全凝固。 
	注意：甲醛和溴化乙锭具有毒性。</li>
	<li>在0.2 ml离心管中准备用于迁移的样品&#160;加入1 µl cRNA、8.8% 甲醛、60% 甲酰胺和0.1体积的MOPS 10X。于70 °C孵育3分钟，然后将离心管置于冰上10分钟。在5,000 x g离心数秒。加入2 µl上样缓冲液。 
	注意：甲酰胺具有毒性。</li>
	<li>运行样品，90 V 条件下电泳 20 分钟。将凝胶浸泡于无核酸酶水中的 H2过夜脱色以去除凝胶背景，然后分析以检测cRNA质量。</li>
	<li>使用分光光度计测定cRNA浓度，并于-80 °C保存。</li>
</ol>
3. 合成RNA的显微注射与卵母细胞成熟刺激
<ol>
	<li>准备卵母细胞显微注射所需的设备。使用微量移液器拉制仪拉制细玻璃毛细管。在体视显微镜下，用镊子折断毛细管末端，形成钝端。使用带有0.45 µm微孔滤膜的1 ml注射器，从另一端向毛细管移液器中注入矿物油。将移液器安装到显微注射装置上。选择由制造商校准过的合适微量移液器，确保其与适当的玻璃毛细管配合使用时具有良好的精确度。</li>
	<li>去滤泡后1-2小时进行显微注射，此为在14 °C条件下保存的卵母细胞恢复所必需的延迟时间。使用镊子刮擦培养皿底部以形成粘附表面，并加入ND96培养基。</li>
	<li>将卵母细胞沿培养皿中的刮痕排列，以便以45 °C的角度依次使用毛细管移液器进行注射。</li>
	<li>在卵母细胞赤道区域、色素化动物极下方进行注射，以实现样品在细胞质中的最佳扩散。仅将毛细管尖端最细部分插入约150-200 µm深度。</li>
	<li>在第一个卵母细胞中注射60 nl体积内含30 ng的cRNA，这些cRNA分别来自不同的质粒。注射后，在拔出毛细管尖端前等待5-10秒，以避免样品外泄（图2A）。 
	注意：注射体积不得超过120 nl。注射速度应尽可能缓慢。建议设置蒸馏水对照组。</li>
	<li>手动移动培养皿以注射下一个卵母细胞。 
	注意：每进行2至3次显微注射后，应在浴液外产生轻微脉冲，确保针尖未被堵塞。</li>
	<li>将注射后的卵母细胞转移至24孔培养板中（每孔10个卵母细胞），每孔加入3 ml新鲜ND96培养基，并置于19 °C环境中培养。</li>
	<li>在ND96培养基中加入孕酮（PG）（2 µg/ml），于19 °C孵育15小时或在分别注射来自pcDNA6.2/V5-DESTeIF4G1和作为对照的pcDNA6.2/C-EmGFP的多聚腺苷酸化cRNA后4小时诱导减数分裂成熟（GVBD）（图2A）。 
	注意：将荧光标记物与cRNA共注射是一种有效方法，可用于确认cRNA已成功注入并保留在卵母细胞内。建议使用带有GFP标签的目标cRNA进行此类预实验。</li>
	<li>参照步骤#3.5，以不同比例（1:3；2:2；3:1）共注射多聚腺苷酸化的eIF4G1-WT和eIF4G1-DN cRNA，以检测eIF4G1-WT cRNA对突变表型的翻译效应（图2D）。</li>
</ol>
4. 生发泡破裂的判定
<ol>
	<li>通过体视显微镜观察黑色动物极是否存在白色斑点，计数促性腺激素（PG）刺激后成熟卵母细胞的数量。每小时重复计数一次，直至第24小时（图2B，2C）。</li>
</ol>
5. 蛋白质印迹（WB）分析
<ol>
	<li>在4 °C条件下，将10个卵母细胞置于200 µl缓冲液（50 mM Hepes，pH 7.4，500 mM NaCl，0.05% SDS，5 mM MgCl2，1 mg/ml 牛血清白蛋白，10 mg/ml 亮抑蛋白酶肽，10 mg/ml 抑肽酶，10 mg/ml 大豆胰蛋白酶抑制剂，10 mg/ml 苯甲基磺酰氟，1 mM PMSF，1 mM 钒酸钠）中，使用移液器吸头反复吹打，使其充分匀浆。</li>
	<li>将样品在10,000 × g离心15分钟，去除脂质层（上层）和膜组分（下层）。收集胞质组分，取部分样品用于测定蛋白浓度，其余部分按1:1比例加入Laemmli缓冲液或Bis-Tris上样缓冲液。 
	注意：Bis-Tris凝胶及上样缓冲液具有更接近中性的pH值，有助于保护蛋白质免受水解</li>
	<li>取20 µg样品于95 °C加热10分钟，随后将各样品加入丙烯酰胺凝胶的加样孔中。将凝胶放入含有适当电泳缓冲液的电泳槽中。</li>
	<li>在200 V电压下进行电泳，持续1小时。</li>
	<li>在TBS缓冲液（pH 8.0，含15 mM Tris HCl，150 mM NaCl，0.1% Tween，10% 牛血清白蛋白）中进行Western blot检测，一抗使用山羊抗Aurora A/Eg2抗体（1:3,000，2小时），或兔抗Aurora A/Eg2-P抗体（1:1,000，4 °C过夜），鼠抗ERK2抗体（1:3,000，2小时），山羊抗ERK2-P（Tyr204）抗体（1:3,000，2小时），兔抗mos抗体（1:5,000，4小时），兔抗GFP抗体（1:3,000，2小时）；同时使用鼠抗V5抗体（1:10,000，2小时）和兔抗Rsk抗体（1:1,000，2小时）作为上样对照。</li>
	<li>用TBS-Tween缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟，随后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（抗小鼠、抗兔或抗山羊IgM），分别按1:5,000、1:7,500和1:5,000稀释，室温孵育1小时。</li>
	<li>再次用TBS-Tween缓冲液洗涤3次，每次10分钟，使用Advanced ECL检测试剂系统显影抗原-抗体复合物。</li>
</ol>
6. 多聚腺苷酸化实验
<ol>
	<li>每种条件下取 5 个卵母细胞，置于 1.5 ml 离心管中。&#160;用 1 ml 无核酸酶的 PBS 1× (pH 7.4) 洗涤。以下步骤均在通风橱内进行。</li>
	<li>使用经典的有机方法提取RNA（参见试剂盒说明书）。</li>
	<li>在4 °C条件下，以10,000 × g离心5分钟回收RNA。弃上清液，将RNA室温晾干10分钟。</li>
	<li>将RNA沉淀重悬于30 µl无核酸酶的H₂O中2O.</li>
	<li>取15 µl样品至新离心管中，加入85 µl无核酸酶水2O. 根据制造商说明书，使用硅胶柱纯化这些样品以提高其质量。用 30 µl 无核酸酶水洗脱 RNA2O</li>
	<li>使用0.8%琼脂糖凝胶电泳，取1 µl样品与5 µl上样缓冲液混合，检测RNA完整性。</li>
	<li>使用分光光度计测定RNA浓度。</li>
	<li>每种条件下制备 2 个连接反应体系即， eIF4G1-WT、eIF4G1-DN 和 H2O对照）加入以下试剂：10 U RNA连接酶、0.1体积的10×缓冲液、1 mM ATP、50% PEG8000（终浓度10%）、0.1 µg引物P1（5’-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3’）11 用无核酸酶水补至终体积为 10 µl2O. 将未经PG刺激的卵母细胞提取的RNA加入第一份混合物中，将经PG刺激的卵母细胞提取的RNA加入第二份混合物中。</li>
	<li>37 °C孵育1小时，然后65 °C孵育20分钟以灭活酶。</li>
	<li>使用cDNA反转录（RT）试剂盒。按每管配制RT反应混合液：10×RT缓冲液0.1体积，引物P2（5’-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT）0.1 µg10，4 mM dNTP 混合物，50 U 逆转录酶，并用无核酸酶水补足2加水至终体积为10 µl。加入此前获得的10 µl连接反应产物。按照制造商说明的条件进行逆转录反应。</li>
	<li>配制聚合酶链式反应（PCR）混合液，每管：0.1 体积的 10X 缓冲液，1.5 mM MgCl₂2，133 µM dNTP 混合物，0.2 µM 特异性引物，0.2 µM 引物 P2，0.025 U Taq 聚合酶，1 µl cDNA，并用无核酸酶水补足至2加水至终体积为 50 µl。PCR 反应条件如下：50 °C 2 min，95 °C 10 min，[95 °C 1 min，56 °C 30 sec，72 °C 30 sec] 共 40 个循环，72 °C 10 min9特异性引物序列如下：mos，GTTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA；组蛋白样蛋白B4（Histone-like B4），AGTGACAAACTAGGCTGATATACT；Cyclin A1，CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG；Cyclin B1，GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT9.</li>
	<li>制备3%琼脂糖凝胶。在每份PCR产物中加入10 µl上样缓冲液。将10 µl样品以110 V电压进行电泳，以获得最佳迁移效果。在电泳10分钟和20分钟后分别观察凝胶，检测条带大小的变化，该变化反映了poly(A)尾的长度，从而指示RNA的成熟程度，而RNA成熟是其翻译的前提条件。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

翻译是多种人类疾病（包括若干神经退行性疾病）病理生理学过程中的一个关键机制。例如，在帕金森病中，已有若干研究报告指出，遗传性突变与翻译功能障碍相关8,12,13。
目前已有多种细胞模型可用于翻译过程的研究。本文中，为了研究一种在eIF4G1中发生的突变所导致的翻译效应，该突变作为一种显性负性突变，可减弱eIF4G1与其互作蛋白eIF4E之间的相互作用8，采用了Xenopus laevis卵母细胞作为研究模型。该模型具有操作简便的优点，因其仅由一个巨大的单细胞构成，便于进行合成mRNA的显微注射，从而为生化实验提供充足的材料，同时也便于对卵母细胞成熟过程中各个阶段进行宏观观察。与稳定细胞系的构建相比，该方法在时间上也更为高效。此外，已有多种卵母细胞制备及RNA显微注射的实验方案被详细描述，尤其适用于细胞周期或核质运输的研究14,15。然而，在利用此类方案研究翻译过程时，需特别注意mRNA的浓度问题：其浓度不宜过高（最大120 nl中不超过30 ng），以避免翻译过程的饱和。考虑到这一因素，Xe...

蛋白质是细胞生命的基本组成成分，对生物体整体也具有重要意义。它们承担着大多数细胞功能，包括结构支持、物质运输、反应催化、调控、基因表达等。&#160;蛋白质的表达是翻译这一复杂机制的结果，该过程可将mRNA转化为蛋白质。翻译过程受到多种调控机制的控制，以根据细胞在发育与分化、衰老、生理应激或病理状态下的需求，适应并调节基因表达。
翻译分为三个阶段（起始、延伸和终止），并提供了三种起始翻译系统以满足这些需求：帽依赖性、非帽依赖性 通过 内部核糖体进入位点（IRES）结构与帽非依赖性翻译增强元件（CITE）。
大多数真核生物mRNA以帽依赖性方式翻译 通过 7-甲基鸟苷5'-三磷酸帽结构，在蛋白质合成过程中作为识别标志。该帽结构与eIF4E结合，eIF4E是eIF4F复合物的组成部分，该复合物还包括eIF4G1和eIF4A。eIF4E还与其他因子如多聚腺苷酸结合蛋白（PABP）以及eIF2-GTP-Met-tRNA等相互作用。甲硫氨酸这些翻译起始因子能够使mRNA环化，并提高其对形成43S复合物的可及性，直至识别AUG起始密码子1这一事件对应于翻译起始的结束 即， 翻译的第一步。
在诱导细胞增殖和凋亡等应激条件下，编码必需蛋白质的mRNA会利用不依赖于帽子结构的翻译机制。该机制涉及mRNA 5'非翻译区（UTR）中的二级结构，即内部核糖体进入位点（IRES），以及与eIF4A和43S复合物相关的eIF4G1的羧基末端。43S前起始复合物与IRES的结合可启动不依赖eIF4E因子的翻译过程2,3。
最后，另一种在应激条件下支持这种帽非依赖性翻译活动的机制仍尚未被充分理解 通过 位于mRNA非翻译区内的CITE结构 4.
通过在起始步骤上存在差异的多种翻译模式，翻译在细胞稳态中发挥着关键作用，因此这些过程中的任何改变都会对生物体产生从小到大的广泛影响。事实上，翻译起始是决定mRNA正确翻译为蛋白质的限速步骤，因而成为众多调控机制和调控位点的作用靶点5。无论是这些调控机制本身，还是参与这些过程的组分，一旦出现功能缺陷，就会扰乱细胞内已建立的平衡状态，从而可能导致病理状况。在此背景下，翻译因子的突变已被证实与多种疾病相关，包括神经退行性疾病，如“白质消融性脑白质病”（eIF2B1-5亚基）6、Wolcott-Rallison综合征（编码PERK的EIF2AK3基因）7，以及可能与帕金森病相关（eIF4G1 p.R1205H）8。因此，对这些突变蛋白开展细胞和分子水平的研究至关重要，有助于加深我们对疾病发生机制以及翻译起始总体过程的理解。
为了开展这些研究，必须选择最合适的模型来观察这些突变所导致的后果。 非洲爪蟾 卵母细胞由于其生理和生化特性而具有良好的适应性：生理同步性（阻滞在细胞周期的G2期）、蛋白质合成能力强（200–400 ng/天/卵母细胞）、单只动物可获取的卵母细胞数量多（800–1,000个卵母细胞/雌性个体）以及细胞体积大（直径1.2–1.4 mm），便于操作。显微注射 非洲爪蟾 注射合成mRNA的卵母细胞可轻松用于解析翻译步骤。从这一角度来看，该方法还具有其他优势。鉴于减数分裂进程以及mRNA显微注射后的翻译速度（约24小时）， 非洲爪蟾 卵母细胞相较于重建的细胞系统（来源于 E.coli，小麦胚芽或兔网织红细胞……）中，mRNA 的翻译速度较慢、翻译速率降低。因此，在多个卵母细胞中，引入 mRNA 的突变效应可迅速显现并易于研究。另一种优势是 非洲爪蟾 卵母细胞的一个特点是母源性mRNA处于休眠状态，在孕酮刺激前蛋白质翻译受到抑制。因此，添加孕酮是控制翻译激活的有效手段。细胞质多聚腺苷酸化在卵子发生过程中不发生，而是在孕酮刺激的卵母细胞成熟过程中按一定的时间顺序启动，并持续至早期发育阶段，可用于研究翻译过程的不同步骤。
mos mRNA 的多聚腺苷酸化是最早发生的事件之一，它与 Aurora A/Eg2、组蛋白样 B4 mRNA 同属于查尔斯沃思（Charlesworth）定义的“早期成熟”基因类别。 等 (2004)9翻译诱导“晚期”mRNA（如Cyclin A1和Cyclin B1）大约发生在生发泡破裂（GVBD）时期。mos mRNA编码一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其翻译至关重要，因为它可诱导MAP激酶级联反应，从而间接激活卵母细胞成熟。事实上，在孕酮刺激下，mos mRNA的多聚腺苷酸化作用增强。 通过 一个涉及Aurora A/Eg2调控蛋白及其他RNA结合蛋白与mos mRNA的3’非翻译区（3’UTR）相互作用的过程。该过程增强了mos mRNA的多聚腺苷酸化，导致mos蛋白水平上升，进而激活MEK1。此机制介导了细胞外信号调节激酶2（ERK2）的活化。图1该信号级联反应可进而激活促进成熟M期的因子，即由细胞周期蛋白B（Cyclin B）和Cdc2激酶组成的复合物，最终导致减数分裂的恢复。
因此，在Xenopus laevis卵母细胞中，可通过多个检测终点来研究母源mRNA（如mos）的可翻译性，这些终点包括其有效的多聚腺苷酸化以及多种mos信号通路组分的翻译，还可包括生发泡破裂（GVBD）率的测定。该系统可用于评估翻译起始因子突变所导致的早期效应，且不受新转录mRNA或转染效率的干扰，而这些问题在真核细胞研究中常常出现。
本文建立了一种实验方案，将突变型 eIF4G1 mRNA 显微注射到 Xenopus laevis 卵母细胞中，检测母源 mRNA 的翻译情况。当观察到生发泡破裂（GVBD）进程存在缺陷时，进一步验证对卵母细胞减数分裂周期进程以及早期和晚期类别 mRNA 翻译至关重要的 mos mRNA 多聚腺苷酸化过程。同时检测 Aurora A/Eg2 和 ERK 的磷酸化水平，以确认 mos 表达失调所导致的后果。因此，Xenopus 卵母细胞为分析 mRNA 翻译的不同步骤提供了一种简便的方法。

<table><tbody><tr><td>三卡因甲烷磺酸盐</td><td>Sandoz</td><td>MS-222</td><td>卵母细胞操作</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Moria</td><td>Dumont MC40</td><td></td></tr><tr><td>链霉素/青霉素</td><td>Sigma</td><td>781</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>大豆胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>T9128</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>兽用可吸收Vicryl缝线</td><td>Johnson&amp;Johson Intl</td><td>JV1205</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶A</td><td>Roche diagnostics</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0560S</td><td>合成mRNA制备</td></tr><tr><td>无DNA酶/RNA酶的H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Life Technologies</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Merck</td><td>6268</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Sigma</td><td>02854</td><td></td></tr><tr><td>Nano Drop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBE 10X</td><td>Eppendorf</td><td>0032006.507</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭 10 mg/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE试剂盒</td><td>Ambion by Life Technologies</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fluka</td><td>03609</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>甲醛 37%</td><td>Merck</td><td>1.04003.1000</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Fluka</td><td>47671</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带100根8&quot;玻璃毛细管的卵母细胞移液管</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-510-X</td><td>显微注射</td></tr><tr><td>替换用玻璃8&quot;</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-210-G8</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m滤膜</td><td>Millipore</td><td>SLHA025NB</td><td></td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma</td><td>P0130</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Biorad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A4612</td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>Sigma</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>苯甲脒</td><td>Sigma</td><td>B6506</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>钒酸钠</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli缓冲液</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris蛋白凝胶，1.0 mm，15孔</td><td>Life Technologies</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE电泳，mini-Protean TGX</td><td>Biorad</td><td>456-1036和-1096</td><td></td></tr><tr><td>水平半干转膜系统</td><td>W.E.P. Compagny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Biorad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Biorad</td><td>161-0719</td><td></td></tr><tr><td>Hybond ECL膜</td><td>Amersham Life Science</td><td>10401180</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>VWR</td><td>20846-292</td><td></td></tr><tr><td>丽春红（0.5%）</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>抗GFP抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>抗V5抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-58052</td><td></td></tr><tr><td>抗Eg2抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-27884</td><td></td></tr><tr><td>抗Eg2-P抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>C39D8</td><td></td></tr><tr><td>抗ERK2抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1647</td><td></td></tr><tr><td>抗ERK2-P（Tyr204）抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7976</td><td></td></tr><tr><td>抗Rsk抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-231</td><td></td></tr><tr><td>抗mos抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-86</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的抗小鼠二抗</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2812</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的抗山羊二抗</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2378</td><td></td></tr><tr><td>高级ECL检测系统</td><td>Amershan Life Science</td><td>RPN2135</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td>多聚腺苷酸化检测</td></tr><tr><td>TRIZOL（Qiazol裂解试剂）</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>31998-8</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma</td><td>278475-1L</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy小型试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>RTL缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>无RNA酶的DNA酶试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>引物</td><td>Eurogentec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA连接酶1&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>高容量cDNA反转录试剂盒</td><td>Applied Biosystems, Life Technologies</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA聚合酶</td><td>Life Technologies</td><td>10342020</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus laevis 作为鉴定翻译障碍的模型

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

蛋白质合成是基因表达的基本过程，影响着多种生物学过程，尤其是对环境条件的适应。该过程的起始阶段涉及核糖体亚基在mRNA起始密码子处的组装，需要包括eIF4G1在内的起始因子参与。翻译过程中这一限速步骤的缺陷与多种疾病相关。为研究此类失调可能带来的后果， Xenopus laevis 卵母细胞是一种极具吸引力的模型，其在基本的细胞和分子机制方面与人类具有高度保守性。此外，在减数分裂成熟过程中，卵母细胞的转录活动受到抑制，所有必需的蛋白质均由预先存在的母源性mRNA翻译而来。这一经济高效的模型使得外源mRNA能够实现有效整合并高效翻译。本文描述了一种利用储存的母源性mRNA评估翻译效率的实验方案，这些mRNA在卵母细胞成熟过程中率先发生多聚腺苷酸化并被翻译，可作为生理性的检测指标。首先，通过体外转录合成mRNA 体外 将目的质粒（此处为 eIF4G1）的转录产物注射入卵母细胞，并通过生发泡破裂检测来确定卵母细胞成熟动力学。所研究的母源性 mRNA 靶标为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 mos。检测其多聚腺苷酸化及其后续翻译过程，同时分析参与卵母细胞成熟过程的 mos 信号通路中相关蛋白的表达与磷酸化状态。此外，本文还提出了本实验方案的若干变体，以突出其在揭示翻译缺陷方面的普遍适用性。鉴于越来越多的证据表明异常蛋白质合成可能参与神经系统疾病的发病机制，该模型为便捷评估此类功能障碍并鉴定新的治疗靶点提供了有力工具。

动力学成熟 非洲爪蟾 卵母细胞及PG刺激24小时后卵母细胞GVBD百分率的测定（图2B、图2C):
为了研究 eIF4G1-DN 突变的翻译效应，将显微注射了 eIF4G1-DN cRNA 的 Xenopus laevis 卵母细胞对苯乙双胍（PG）的反应与 eIF4G1-WT 及其他对照条件（H2O、GFP）进行比较。这些对照有助于评估卵母细胞显微注射本身的影响，从而排除所注射 cRNA 的性质或 eIF4G1 过表达所带来的干扰。
10个在显微注射对照条件下表征的卵母细胞的动态成熟过程2O 和 GFP）与野生型（WT）相似，在 PG 刺激后 12 小时和 24 小时，发生 GVBD 的数量彼此非常接近图2B）。24小时后，野生型（WT）卵母细胞成熟率达到95.7%，H型为97.1%2O 和 GFP 的 97.5%图2C）。...

蛋白质合成的调控主要发生在翻译起始阶段，该过程的缺陷与多种疾病相关。为了更好地理解这些疾病的病因，本文描述了一种利用非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞评估在翻译起始因子 eIF4G1 突变体存在条件下 mos 转录本翻译情况的实验方案。

Xenopus laevis 作为鉴定翻译障碍的模型

蛋白质合成是基因表达的基本过程，影响着多种生物过程，尤其是对环境条件的适应。

本实验的总体目标是在无新转录mRNA干扰或真核细胞研究中常出现的转染效率问题的情况下，评估翻译起始因子突变的最初效应。该目标通过以下步骤实现：首先从相应的质粒中合成突变型、野生型或对照GFP mRNA；随后将合成的RNA在第六阶段显微注射到XUS Lavis细胞中，并用孕酮刺激其成熟。然后通过生发泡破裂的观察来评估卵母细胞成熟，并通过蛋白质印迹法分析依赖于moss蛋白表达的成熟促进因子（MA激酶）级联反应的某些组分。最后，研究moss及其他对XPO卵母细胞减数分裂恢复必需的mRNA的多聚腺苷酸化。最终分析卵母细胞成熟的动力学过程。通过蛋白质印迹和多聚腺苷酸化分析，可以揭示翻译起始因子发生突变时对蛋白质表达的潜在影响。与现有的方法或从同等数量的生殖细胞或兔网织红细胞中提取的重建细胞体系相比，该技术的主要优势在于，引入 mRNA 中的突变效应可在多种细胞系中迅速显现并易于研究。更一般而言。该模型具有操作简便的优点，因其仅含单个巨大细胞，且能提供大量材料用于生化实验。与稳定细胞系的构建相比，该方法也更为省时。该体系可用于解答翻译研究中的关键问题，例如深入理解起始因子特定结构域的功能，或研究这些因子的剪接过程。当我们希望研究一种突变的翻译起始因子对蛋白质合成的影响，同时避免转录过程的干扰时，首次提出了该方法的设想。通过这种方法，我们可以避免这两个组学机制之间可能存在的反馈回路。实际上，转录产物被储存并加以利用。排便后，根据文本方案处理xus lavos细胞并制备CRN，使用10倍浓度的MOPS和6.6%甲醛制备1.5% AROS凝胶。在0.2毫升离心管中准备样品，加入8.8%甲醛、60%的AMIDE、0.1体积的10倍浓度MOPS以及1微升CRNA，在70摄氏度孵育3分钟，然后将离心管置于冰上10分钟。在加入2微升上样缓冲液前，以5,000 × g离心数秒。以 90 伏电压电泳 20 分钟以跑胶。将凝胶浸泡于无核酸酶水中过夜。随后进行分析，以检测 CNA 的质量。使用分光光度计测定CNA浓度，并将样品储存在负80摄氏度，以进行RNA显微注射。去叶后一至两小时，用ND 96培养基填充已刮擦的培养皿。将细胞沿培养皿中的刮擦线排列。接下来，使用尖端断裂的毛细玻璃微量移液管，以45度角插入色素化动物区域下方的赤道带，深度约为150至200微米。将60纳升中含有30纳克CRNA的溶液注入第一个卵母细胞中。然后等待5到10秒，再移除毛细管尖端，以防止样品泄漏。要注射下一个细胞，需手动移动培养皿。将已注射的细胞转移至含有3毫升ND 96培养基的24孔培养板中，并在19摄氏度下培养，以诱导有丝分裂成熟。将卵母细胞在含有每毫升2微克孕酮（progesterone）或PG的ND 96溶液中，于19摄氏度孵育15小时。根据文本方案检测野生型EIF 4G 1 CRNA对突变表型的翻译效应。在体视显微镜下观察生发泡破裂的程度。在PG刺激后，通过观察黑色动物极处是否出现白色斑点来计数成熟卵细胞的数量。每小时重复计数一次，直至第24小时，以进行后续血液分析。使用微量移液器枪头在4°C条件下来回移动，将10个卵细胞在200 µL所示缓冲液中充分匀浆。以10,000 × g离心样品15分钟，以提取中间的胞质组分。上层为脂质相，下层为细胞碎片。收集胞质组分，并保存一份等分试样用于测定蛋白质浓度。将剩余样品按1:1比例与上样缓冲液或Biss样品缓冲液混合，随后进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。根据文本方案，为开展多聚泛素化检测实验，每种条件下取五个细胞，置于含1毫升无核酸酶的1×PBS的1.5毫升微量离心管中洗涤细胞。然后在通风橱中，按照试剂盒制造商的说明使用RNA提取试剂盒分离RNA。在检测RNA完整性和测定浓度后，为每种CRNA条件准备两份连接反应混合物，并向第一份混合物中加入以下试剂。向第一份混合物中加入未用pg刺激的细胞的RNA，向第二份混合物中加入相应RNA。加入经PG刺激的卵母细胞的RNA。先在37摄氏度孵育1小时，然后在65摄氏度孵育20分钟。使用CD NA逆转录试剂盒以灭活酶。每个样本均需制备此处列出的反转录（RT）反应体系。加入10微升先前制备的连接反应产物，按照生产商说明书进行反转录反应。随后进行PCR扩增，每个反应中加入4微升上样缓冲液，取各样本10微升在3%琼脂糖凝胶中以110伏电泳分离。最后分别在电泳10分钟和20分钟后分析凝胶结果，观察条带大小变化，该变化反映了polyA尾的长度，从而指示RNA的成熟程度，而RNA成熟是其后续翻译的前提条件。如图所示，在对照条件下显微注射的卵母细胞其减数成熟动力学与野生型相似，在前列腺素（PG）刺激后12小时和24小时，发生生发泡破裂（GVBD）的卵母细胞数量相近。在PG刺激24小时后，野生型以及注射水或GFP对照组的卵母细胞达到成熟的比例相似，表明注射水、对照或EIF4G1 cRNA对卵母细胞减数分裂的影响较小。然而，注射显性负性EIF4G1 cRNA则导致GVBD显著减少，即使在PG刺激后亦如此。该图显示，随着野生型与显性负性EIF4G1 cRNA比例的增加，成熟缺陷可被逐步恢复至野生型水平。因此，预期发生成熟的细胞百分比也是如此。在没有PG刺激的情况下，未检测到内源性moss的表达，而EIF 4G 1显性负性突变体的过表达对内源性moss几乎没有影响，这与先前的研究结果一致。此外，位于moss诱导上游的Aurora AEEG 2在PG刺激后，其蛋白表达水平或其磷酸化形式均未显示出异常调控的迹象。相反，由苔藓诱导的irk两个磷酸化作用，在存在显性失活的EIF 4G1的情况下会受到抑制。一旦掌握该技术，若操作得当，可在五天内完成。在进行此操作时，需注意在后续操作中，所使用的CNA体积不得超过120纳升，且其浓度应低于特定纳克值。尽管可以通过多聚核糖体分析等方法来回答更多问题，例如确定哪些RNA的翻译效率较低或较高。

xenopus-laevis-as-a-model-to-identify-translation-impairment

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