非洲爪蟾作为一种模型来确定翻译减值

该程序的总体目标是评估翻译起始因子突变的初步后果，而不会干扰新转录的 mRNA 或真核细胞研究中经常出现的转染效率问题。这是通过首先合成突变野生型和对照，或从相应质粒合成 GFP mRNA 来实现的。接下来，在第六阶段将合成的 RNA 显微注射到 XUS Lavis 细胞中，并用黄体酮刺激其成熟。

然后通过生发囊泡分解可视化评估细胞成熟，并通过 western blot 分析其激活取决于苔藓蛋白表达的 MA 激酶级联反应的一些成分。最后，研究了 XPO 细胞肌病恢复所必需的苔藓和其他 mRNA 的 mRNA 多聚腺苷酸化。最终动力学细胞成熟。

Western blot 和多聚腺苷酸化分析用于显示翻译起始因子突变时蛋白质表达的潜在影响。与我们现有的方法或从与胚芽或兔网织红细胞等量提取的重组细胞系统相比，该技术的主要优点是 MR 中引入的突变的影响。NA 将很快被观察到，并在几个 xop 征税中很容易研究。细胞 更普遍。

该模型具有单个巨细胞简单的优点，其使用为生化实验提供了大量的材料。与稳定细胞系的制备相比，这个过程也很省时。这个味噌可以帮助回答翻译研究中的关键问题，例如更好地理解特定领域的作用或研究这些因素的剪接。

当我们想研究突变的翻译起始因子对蛋白质合成的影响而不干扰转录时，我们首先添加了这种方法的想法。通过这种方式，我们避免了这两种机制之间潜在的反馈循环。事实上，材料成绩单是存储和放置的。

黄体酮触发翻译排便后，xus lavos 细胞并根据文本方案准备 CRN，使用 10 x 拖把和 6.6% 甲醛浇注 1.5% AROS 凝胶。在 0.2 毫升试管中制备样品，其中含有 8.8% 甲醛、60% 的 AMIDE 0.1 体积的 10 x 拖把和 1 微升 CRNA，在 70 摄氏度下孵育 3 分钟，然后将试管置于冰上 10 分钟。将样品以 5， 000 倍 G 离心几秒钟，然后加入 2 μL 凝胶上样缓冲液。

在 90 伏电压下运行样品 20 分钟，以忽略凝胶。将其浸泡在无核酸酶的水中过夜。然后对其进行分析以检查 CNA 的质量。

使用分光光度计测定 CNA 浓度并将样品储存在零下 80 摄氏度以进行 RNA 的显微注射。在落叶后 1 到 2 小时，使用 ND 96 培养基填充刮过的培养皿。沿着培养皿中刮擦的通道排列细胞。

接下来，使用带有破损尖端的毛细管微量移液器以 45 度角放置。将毛细管尖端插入色素动物区域下方的赤道区约 150 至 200 微米深处。将 30 ng、60 ng、CRNA 注射到第一个卵母细胞中。

然后等待 5 到 10 秒，然后再取下毛细管尖端，以防止样品泄漏。注射下一个细胞 手动移动培养皿。将注射的细胞转移到装有 3 ml ND 96 培养基的 24 孔培养板中，并在 19 摄氏度下引导它们以触发有丝分裂成熟。

将卵母细胞在 ND 96 中与每毫升 2 微克黄体酮或 PG 在 19 摄氏度下孵育 15 小时。根据文本协议测试野生型 EIF 4G one CRNAs 对突变表型的翻译效果。在立体显微镜下确定生发囊泡分解的程度。

通过在黑色动物极存在白点来计算 PG 刺激后成熟细胞的数量。每小时重复计数，直到第 24 小时进行蛋白质印血分析。使用 4 摄氏度的微量移液器吸头在 200 微升缓冲液中来回移动，以匀浆 10 个细胞，如下所示。

样品以 10， 000 倍 G 离心 15 分钟，以提取中间的细胞质部分。上部组分相应的脂质和下部的细胞碎片。收集细胞质部分并储存等分试样以确定蛋白质浓度。

在运行 SDS 页面和蛋白质印迹之前，将剩余的与 lamely 或 Biss 样品缓冲液以一比一的比例混合。根据文本协议。要进行多晶通气测定，请将每个条件的 5 个细胞放入 1.5 mL 微量离心管中，其中 1 mL 不含核酸酶的 1 个 XPBS 洗涤细胞。

然后在通风橱下，根据制造商的说明使用 RNA 提取试剂盒分离 RNA。在检查 RNA 的完整性并确定浓度后，根据 CRNA 条件准备两种连接混合物，并在第一种混合物中使用以下试剂。将未用 pg 刺激的细胞中的 RNA 添加到第二种混合物中。

添加来自 PG 刺激的卵母细胞的 RNA。在 37 摄氏度下孵育 1 小时，然后在 65 摄氏度下孵育 20 分钟。使用 CD NA 逆转录试剂盒灭活酶。

对于每个样品，准备此处列出的 RT 混合物。在进行 PCR 后，加入 10 微升先前制备的连接反应物并根据制造商的说明进行 RT，使用以下反应混合物和条件在每个反应中加入 4 微升上样缓冲液，并在 3% agros 凝胶上以 110 个螺栓运行每个样品 10 微升。最后，在 10 分钟和 20 分钟后分析凝胶，以观察大小的变化，这反映了 polyA 尾的长度，从而反映了 RNA 的成熟，这是它们翻译的先决条件。

如此处所示，在对照条件下微量注射的卵母细胞的动力学成熟与野生型相似，在 PG 刺激后 12 小时和 24 小时、PG 刺激后 24 小时经历 GVBD 的数量相似。野生型以及水和 GFP 注射对照的卵母细胞成熟百分比相似，表明显微注射水或对照或 EIF 4G one CRNA 对卵母细胞肌病显微注射几乎没有影响，显性阴性 EIF 4G 显微注射，然而，即使在 PG 刺激后，也导致 GVBD 显着降低。该图显示，随着野生型与显性阴性 EIF 4G 1 CRNA 的比率增加，野生型 CRNA 可以恢复成熟缺陷。

按预期成熟化的细胞百分比也是如此。在没有 PG 刺激和过表达 EIF 4G 的情况下未检测到内源性苔藓表达，一种显性阴性对内源性苔藓的影响很小，与之前的结果一致。此外，作用于苔藓诱导上游的 Aurora AEEG 2 没有显示蛋白质失调或在 PG 刺激后诱导其磷酸化形式的证据。

相反，由苔藓诱导的 irk 二磷酸化在显性负 EIF 4G 磷酸化存在下被抑制。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在五天内完成。在尝试此程序时，请务必记住不要超过 120 纳升浓度低于特定纳克的 CNA。遵循此程序。

尽管可以执行像多核糖体分析这样的方法来回答其他问题，例如定义哪些 RNA 可能翻译不佳或高度翻译。