咽弓的体外培养研究心脏和肌肉祖细胞和自己的优势

该程序的总体目标是研究咽中胚层中心脏和肌肉祖细胞的维持、迁移和命运。这是通过首先从新鲜收获的小鼠胚胎中解剖咽弓来完成的。接下来，将拱门放置在媒体薄膜中，以方便其连接。

然后每天监测咽部外膜内或移出咽部的细胞。最终，基于 Cree 的荧光谱系追踪可用于追踪咽弓内心脏和肌肉祖细胞的迁移分化和更新。该技术的主要优点是它是在体外研究心脏或肌肉祖细胞群及其微环境更新种群的唯一离体系统。

这种方法的演示至关重要，因为 9.5 日龄小鼠胚胎中的亲本弓只有 2 到 300 微米的大小，这使得它们在没有事先可视化的情况下很难识别和解剖。在开始该过程之前。Coda 12，含 PBS 的孔板，添加 10% FBS。

1 小时后，用每孔 200 μL 无血清培养基替换包被溶液。旋转板以确保一层介质覆盖孔底的整个表面。接下来，用 70% 乙醇喷洒并清洁安乐死的怀孕小鼠的腹部。

然后使用无菌工具，在海军区域做一个 0.5 厘米的切口。抓住切口上方和下方的皮肤，然后向相反方向轻轻拉动。然后在腹部两侧从肚脐到卵巢的膜上做一个 V 形切口，露出子宫。

用镊子捏住连接子宫和卵巢的输卵管，用剪刀捏住卵巢一侧的输卵管，将子宫从卵巢中释放出来。轻轻地拉起子宫。从膀胱区域切开子宫。

然后通过 uct 进一步向上拉子宫，切开另一侧的 UCT，将子宫从腹腔中释放出来。将子宫转移到含有 20 毫升含钙和镁的冷无菌 PBS 的 50 毫升试管中。轻轻摇动试管 10 秒以洗去血液。

然后用镊子将子宫转移到 10 毫升的培养皿中，并向组织中加入 5 毫升的冷 PBS。接下来，在立体显微镜下，用两对镊子轻轻打开子宫，一次解剖一个装有胚胎的羊膜袋。然后依次对于每个胚胎，用一对镊子捏住并轻轻取出羊膜袋，使用另一对镊子从胚胎中切割和释放羊膜袋。

将胚胎侧放，用镊子在拱和咽袋之间的心脏后方切开第一和第二弓。翻转胚胎并切割另一侧的拱形后，刚刚演示。切开连接弓和胚胎的心脏流出道并去除它们。

从剩余的心脏流出道和四个肠道内胚层中捏住并释放两个咽弓中的每一个。反过来，然后将组织转移到涂层 12 孔板的各个孔的中心，注意拱门不要被培养基覆盖。为了促进附着，请在细胞培养条件下孵育拱门。

两小时后，沿孔侧面加入 200 微升 37 摄氏度的无血清培养基，注意牙弓保持附着状态，并将组织孵育过夜。第二天目测确认牙弓仍然连接。然后向孔中轻轻添加 200 微升 37 摄氏度的无血清培养基。

如果组织脱离并开始漂浮，请用移液管轻轻去除培养基，不要去除拱门，直到只留下一层培养基膜。然后使用移液器吸头将拱形移回孔的中间并再次孵育组织。每隔一天，用 100 至 200 μL 的新鲜培养基替换任何蒸发的培养基。

面部肌肉和心脏祖细胞在从第一和第二咽弓增殖和迁移时可以追踪，分别成为头部和心脏肌肉组织。培养咽弓提供了一种独特的方法，可以在体外详细研究心脏和肌肉发育。使用 CRE 锁定系统，在离体培养后 36 至 72 小时内，荧光报告基因可以在 Cree 表达时通过荧光报告基因追踪小鼠中胚层后代。

心肌细胞的形成可以通过自发收缩第二弓内迁移细胞簇以及通过分析特定的心肌细胞标志物来目视确认。培养 3 至 7 天后，肌管和面部肌肉的形成可以可视化为第一弓内细长和自发抽搐的细胞，并通过分析特定的肌肉标志物发育后。这项技术为心脏和肌肉干细胞生物学领域的研究人员在体外直接监测和研究不断扩大的祖细胞及其生态位铺平了道路。

看完这个视频后，你应该对如何从发育中的小鼠胚胎解剖孔弓到体外培养有一个很好的了解，这允许在体外研究心脏和肌肉的促生殖发育。