的肿瘤特异性内皮细胞的分离与培养扩展

我们报道了一种从基因工程小鼠模型中分离和培养原代肿瘤特异性内皮细胞的可靠方法。

该程序的总体目标是使用磁柱和克隆环分离肿瘤内皮细胞。这是通过首先消化从小鼠身上解剖的肿瘤组织以生成单细胞悬液来实现的。第二步是使用磁珠柱富集内皮细胞群。

接下来，使用克隆环方法生长和选择内皮细胞集落。最后一步是扩增和表征选定的内皮细胞集落。最终，使用特异性内皮细胞标志物的免疫荧光显微镜检查用于显示克隆群体的纯度。

与事实分选等现有方法相比，该技术的主要优点是它对细胞更温和，从而可以更好地回收活的内皮细胞和随后的集落扩增。这种方法可以帮助回答肿瘤血管生成领域的关键问题，例如肿瘤中的血管内皮细胞功能障碍如何促进肿瘤进展。通常，这种方法的新手会很挣扎，因为内皮细胞经常被肿瘤微环境中的其他细胞类型污染，因此必须努力在安乐死后从培养物中快速去除这些污染细胞。

将鼠标带到干净的工作台上，用足量的 75%体积对体积喷洒对腹侧进行消毒。乙醇接下来，使用适当的无菌技术将小鼠的肢体固定在解剖板上。在不打开腹膜的情况下做一个中线腹侧切口，同时保持腹膜完整。

在皮肤和腹膜之间横向解剖，朝向肿瘤所在的 MA 腺体。通过仔细修剪非肿瘤组织（包括皮肤和肌肉），仅从记忆腺中切除肿瘤组织。将解剖的肿瘤放入含有 30 毫升低葡萄糖 D 回声、改良 eagles 培养基或 LG DMEM 的锥形管中，以开始肿瘤解离。

将无菌 L-G-D-M-E-M 中的组织转移到组织培养皿中，并用 L-G-D-M-E-M 洗涤一到两次。洗涤后，加入两毫升 L-G-D-M-E-M，然后用一把无菌剪刀将肿瘤切碎。向切碎的肿瘤中加入 5 毫升胶原酶、1 毫升椎间盘起搏、75 微升脱氧核糖核酸酶和 2 毫升 L-G-D-M-E-M。

将胶原酶组织混合物从培养皿转移到组织解离管中。使用预设的解离程序，执行两轮第 62 轮解离。在 37 摄氏度下轻轻摇动试管 75 分钟。

孵育后，通过位于 50 毫升锥形管上的 100 微米细胞过滤器过滤消化的组织。用 5 毫升传真缓冲液冲洗过滤器以收集任何剩余的细胞，并以 280 倍 G 离心管 5 分钟。小心去除上清液，不要干扰细胞沉淀。

接下来，稀释 1 毫升 10 x 原液。红细胞裂解缓冲液溶于 9 毫升无菌水中，重悬沉淀以裂解任何污染的红细胞，立即以 280 倍 G 离心细胞 5 分钟。去除上清液，将细胞重悬于 10 ml 传真缓冲液中。

首先进行免疫磁性分离时，使用血细胞计数器对活细胞进行计数，并稀释至每 100 μL 7 个细胞 10 个。在传真缓冲液中，每 100 μL 加入 10 μL FCR 封闭液，并在冰上孵育 10 分钟封闭后，向细胞中加入大鼠抗小鼠 PE 偶联的 CD 31 抗体，并在冰上孵育 10 至 15 分钟。偶尔搅动，向试管中加入 10 毫升传真缓冲液，并以 280 倍 G 离心 5 分钟。

小心取出 snat，用 5 ml 传真缓冲液洗涤细胞沉淀，再次以 280 倍 G 离心 5 分钟以沉淀细胞，然后吸出上清液。现在向细胞中加入传真缓冲液和抗 PE 微珠，并在冰上孵育 10 至 15 分钟。偶尔搅拌，加入 10 毫升传真，缓冲，并以 280 倍 G 离心样品 5 分钟。

用 5 毫升传真缓冲液离心机洗涤细胞，将体积调至 300 微升后去除上清液。使用传真缓冲液，将细胞通过 35 微米细胞过滤器加盖管以 280 倍 G 离心 5 分钟。吸出上清液进行磁性分离。

设置磁性 multis 支架和磁柱。在细胞培养通风橱中，将色谱柱连接到磁性分离器上，然后将色谱柱与 2 mL 传真缓冲液相等。接下来，将细胞上颚重新悬浮在半毫升传真缓冲液中，并将细胞悬液通过平衡磁柱。

用 2 mL 传真缓冲液洗涤色谱柱 3 次，同时将流过的液流收集在 15 mL 锥形管中。从磁性分离器中取出色谱柱，并使用柱塞用 2 mL 传真缓冲液洗脱，以确保从色谱柱中取出所有细胞。将洗脱液收集在新的 15 mL 锥形管中。

洗脱液组分以 280 倍 G 离心 5 分钟，然后取出上清液。将细胞均匀悬浮在 10 mL 内皮细胞培养基中。将细胞悬液分成至少四个 10 厘米明胶包被的细胞培养皿中，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育，预计第二天的共流畅度约为 1%。

内皮细胞集落应在 7 到 10 天后开始形成，并在 7 到 10 天后出现集落时长到 3 到 5 毫米的直径，用无菌的 200 微升移液器吸头去除周围的任何非特异性细胞。一旦菌落长到正确的大小，使用相差显微镜以 4 倍或 10 倍的放大倍率观察培养皿，并在培养皿底部勾勒出单个菌落的轮廓。使用细尖标记，用 10 毫升 PBS 清洗板并吸出，留下少量 PBS 以保持细胞湿润。

使用一对解剖钳，拿起克隆环，吸取大约半微升的组织粘合剂到底部。用 10 微升移液器吸头将组织粘合剂均匀地涂抹在克隆环的底部。以标记为指导，将克隆环放在内皮细胞集落上。

轻轻按下克隆环，将环粘在板上。接下来，将 25 μL 酶促细胞分离溶液移液移液到克隆环中，孵育约 1 分钟或直到细胞松散附着。将细胞从每个克隆环中移液到一个 6 孔中。

孔板。用 50 微升内皮细胞培养基清洗环以收集剩余的细胞并将它们转移到六孔板中的同一孔中，在六孔板中培养分离的菌落，直到它们达到 80% 至 100% 的共流畅度，然后再将细胞转移到新培养皿中。单独分离免疫磁性内皮细胞通常会导致非内皮细胞的培养物污染。

在这里，可以看到用染料 I-A-C-L-D-L 特异性染色的内皮细胞与未染色的非内皮细胞混合。在对集落使用克隆环后，即使是已经扩增的细胞群也显示出均匀的 DI IAC LDL 染色，表明它们是比较三个单独分离的集落的纯内皮细胞群。明显均匀的 CD 31 阳性群体。

CD 31 是一种内皮细胞标志物，而 IgG 用作非特异性抗体结合的同种型阴性对照。这些细胞群还表现出内皮细胞标志基因的表达增加，比小鼠胚胎成纤维细胞对照高 200 至 7， 000 倍。最后，分离的正常或肿瘤内皮细胞保留了内皮细胞功能，培养物中自发的血管腿结构形成证明了这一点。

观看此视频后，您应该对如何使用免疫磁富集结合集落选择和体外扩增对肿瘤特异性内皮细胞进行高保真分离有了很好的了解。