总木质素，木质素单体，和酶促糖推出:顽拗变奏曲在木质纤维素生物质的高通量筛选

该程序的总体目标是测量相关生物质变体之间的热化学预处理和酶水解顽固物。这是通过首先准备生物质样品以通过淀粉和可溶性糖的大小、还原和提取进行测试来实现的。第二步是将生物质高精度分配到热化学兼容的高通量反应器板中。

样品在蒸汽反应器中进行预处理。接下来，用标准市售纤维素酶消化样品 3 天，以水解纤维素和半纤维素。最后一步是使用 GO pod 和 XDH 测定法测定酶水解过程中释放的葡萄糖和木糖。

最终，使用高通量葡萄糖和木糖定量来确定样品之间的相对糖释放量（以克糖/克起始生物量为基础）。与其他实验室规模方法（如实验室规模、预处理和酶解）相比，该技术的主要优点是该技术可以同时对数百甚至数千个样品进行。这种方法可以帮助回答生物质转化领域的关键问题，例如哪些品种的变体更适合转化为糖和后续产品。

因此，这项技术的影响可以扩展到了解细胞壁结构和功能，因为我们在细胞壁生物合成途径中产生的突变可以筛选结构化学变化。嗯，这种方法可以提供对植物细胞壁顽固分子的见解。它也可以应用于生物质转化的其他组成部分，例如酶活性和协同研究。

一般来说，刚接触这种方法的人会遇到困难，因为它涉及大量生物量变体的样本集，这些样本集必须在毫克级上以相同和同时的方式处理。所以它需要专门的机器人和设备 要从条形码防静电袋到编号茶包中大约 250 毫克先前研磨的生物质开始该程序，请小心地卷起茶包，确保将末端折叠在生物质上，以防止在淀粉和提取过程中损失。接下来，用镀锡铜线包装每个茶包，记录每个条形码样品的茶包编号。

将 500 毫升先前制备的脱淀粉酶溶液加入塑料容器中。然后将 120 个茶包添加到缓冲酶溶液中，用于批量批处理方案。在摇床中孵育后，将生物质冲洗并在几升去离子水中浸泡 30 分钟，然后彻底冲洗上浆的生物质。

要去除缓冲盐，请将茶包放入袜子灯柱中进行提取。使用 95% 乙醇设置袜子液回流，并提取样品 24 小时。提取完成后，展开茶包，将干燥的生物质放回原条形码。

防静电袋 将至少 50 毫克干燥的生物质转移到带条形码的料斗中。扫描防静电袋和接收料斗的条形码，以确保准确的样品跟踪。将料斗装载到固体称量机器人上后，自动称量 5 毫克干燥样品放入耐酸不锈钢中。

96 孔板称取分布在板周围的每个样品的三个重复，以最大限度地减少任何局部变化。接下来，向每个孔中加入 250 微升去离子水，并用硅胶背胶聚四氟乙烯或 PTFE 胶带密封板。使用 1 8 英寸的烙铁头，在每个蒸汽端口刺穿 PTFE 胶带。

对于每个板，在板之间以及堆栈顶部和底部的空板之间用 0.031 英寸厚的玻璃增强 PTFE 垫圈紧紧夹住板。使用设置为 180 摄氏度的蒸汽反应器预处理样品 17.5 分钟。完成后，用去离子水浸入，将反应器板冷却至 50 摄氏度。

当板冷却后，将它们放入摆动桶中离心。以 1700 GS 的离心力转子 20 分钟。然后取下天花板膜。

重新密封后，向每个孔中加入 40 微升先前制备的 8% 酶储备溶液 用新的 PTFE 胶带，将密封板放入磁板夹中。通过倒置轻轻混合样品至少 15 次，并在 50 摄氏度下孵育 70 小时。孵育后，将反应器板混合并离心。

然后，使用液体处理机器人通过酶联比色测定、木糖脱氢酶或木糖和葡萄糖氧化酶的 XDH、过氧化物酶或葡萄糖的 go pod 进行葡萄糖和木糖的定量。台面上装有 GO POD 和 XDH 试剂储液槽，以及用于稀释的水，每种试剂都有 96 通道 200 μL 吸头架。这些吸头可重复用于多个反应器板。

该样品牌还包含一次性 200 微升吸头，用于除水和糖标准版，以及预制的糖标准品。在来自储存转盘的 HPLC 样品瓶中，机器人引入三个透明的微量滴定板，一个用于稀释水解混合物，一个用于 XDH 和 GoPod 分析。夹持器将所有四个板移动到甲板上的位置。

使用 96 通道 100 μL 吸头从转盘带到台面上，用于从反应器转移到稀释板，以及从稀释转移到 XDH 和 go 豆荚板。使用可变量程八通道移液器，将预处理前添加的水从反应器板每个角落的三个孔中去除，以防止水进入稀释板。由于这 12 个孔用于使用 96 通道移液头的糖标准品。

去除每个角落的三个尖端后，向稀释板的孔中加入 180 微升水。更换吸头后，XD、H 和 go pod 试剂从各自的储液槽转移到各自的检测板中。使用 96 通道移液头。

在此过程中，将糖标准品添加到稀释板每个角落的三个孔中。使用八通道移液头更换较小的吸头后，使用 96 通道移液头将 20 微升水解上清液转移到稀释板中，板由 tri 混合。应在液体顶部附近吸取样品，以限制生物质颗粒对吸头的污染。

混合后，依次转移 20 μL。使用 96 通道移液头对 XDH 和 go pod 板。通过试板机混合后，样品吸头反应器和稀释板被放回转盘中的废液架上，XDH 和 go pod 板被移到单独的转盘架上，静置一小时后，使用紫外可见光 96 孔板读数仪在分光光度计中读数。

将测得的波长设置为 510 纳米，并记录试剂空白的吸光度。在此之后，将读板器上测得的波长设置为 340 纳米，并使用小刮刀记录吸光度。将大约 4 毫克制备的生物质分配到一个 80 微升不锈钢杯中，该杯子专为质谱仪的自动进样器设计。

使用标准打孔器，从无粘合剂的玻璃纤维板手动生产玻璃滤盘，将样品装入自动进样器架中，使用镊子随机将样品装入杯中，以避免由于光谱仪随时间漂移而引起的偏差。在质谱仪中执行校准并输入适当的参数后，开始数据采集并等待至少 60 秒以获得足够的数据以进行背景光谱采集。最后，使用 0.9 升/分钟的氦载气流速启动自动自动进样器方法。

趋势的一个例子是对太平洋西北部采样的 755 种杨树自然变体的顽固者进行的调查。结果表明，随着注射器与内疚比率的升高，顽固性降低，直到比率约为 2 或顽固性改善趋于平稳。在这里可以看到 PT four CL one 基因下调的异常值。

在杨树中，筛选的 100 个品种中，有几个品种的顽固性葡萄明显增加，糖分释放减少证明了这一点。根据上述变量的组合，在几个地点种植不同的小麦秸秆品种，并在生长条件的几次变化后收获，产生了 20 个不同的种群。这些样本集很容易区分，并指示正变量和负变量。

对于顽固的热解，分子束质谱法可用于评估细胞壁组成的变化。质谱片段被分配到不同的木质素单体。当比较高木质素含量和高碳水化合物含量的样品时，光谱数据的差异是显而易见的。

此处说明了质谱数据的使用以及主成分分析。主成分载荷图可以帮助识别分数分类图中解释了哪些化学特性，以及阐明样品簇之间的哪些特性正在发生变化一旦掌握，如果执行得当，该技术可用于每周筛选数千个样品。在尝试此过程时，请务必尽可能保持一致，并且仅比较相关集合中的样本。

因此，在它开发之后，这项技术为其他研究人员使用离子液体和碱性预处理等方法研究高通量筛选方法和植物细胞壁顽固性的其他领域铺平了道路。看完这个视频后，你应该对如何使用粉碎和提取、热化学预处理和酶水解在微观尺度上正确准备、处理和分析大量生物质样品集的差异有一个很好的了解，请记住，使用高压、蒸汽和自动化设备是极其危险的，应采取所有安全预防措施， 例如佩戴个人防护设备，以及在执行这些程序时在所有设备上安装安全联锁装置。