对小鼠乳腺冰冻切片间接免疫荧光

该程序的总体目标是在哺乳期间将感兴趣的蛋白质定位在小鼠的乳腺组织中。该方法可以帮助回答细胞生物学领域的关键问题，例如参与中期产物分泌的捕捉蛋白在哺乳期小鼠乳腺上皮细胞中的位置。该技术的主要优点是您可以快速轻松地观察蛋白质在给定组织环境中的位置。

安乐死后，将鼠标仰卧，用乙醇润湿腹侧区域，然后用纸巾擦干。接下来，用镊子拉起两条后腿之间的腹部皮肤，用一把锋利的剪刀在皮肤上做一个一厘米长的切口。从第一个切口开始，将皮肤切开到颈部，然后将皮肤从腹膜中拉出。

固定一侧皮肤，拉紧每一侧。接下来，使用无菌棉签将腹部和腹股沟乳腺从皮肤上推开，并将它们从腹膜中解剖出来。将解剖的乳腺组织放在冰冷却的解剖板上。

最后，使用手术刀切除位于腹部和腹股沟腺交界处的淋巴结。将记忆组织切成约 3 立方毫米大小的碎片，并立即在 PBS 中冲洗这些碎片。为了去除尽可能多的牛奶，请在纸巾上快速擦干碎片，然后将它们放入含有 4% 对位甲醛的冰冷 PBS 溶液中，在冰上放置 10 至 15 分钟。

要在固定后轻轻固定组织，请在冰冷的 PBS 中快速冲洗乳腺碎片，然后将碎片浸入含有 40% 蔗糖的冰冷 PBS 中，在 4 摄氏度下浸泡 16 至 48 小时。在适当轻轻摇晃的同时，在塑料低温模具上贴上标签，然后在室温下用最佳切割温度化合物将它们填充三分之一。将一个含有 2 到 3 立方毫米乳腺组织的碎片放入每个模具中，并用额外的化合物覆盖它们。

接下来，将模具放在液氮浴表面，直到整个模具变得不透明，以冷冻最佳切割温度化合物和样品。将块存放在零下 80 摄氏度的冰箱中，直到样品被切片。将低温恒温器的温度调整到零下 26 摄氏度，然后等待温度稳定下来。

同时，将要切片的块放入低温恒温器中，以便它们可以平衡到零下 26 摄氏度。也。在整个切片过程中保持冷冻组织块的冷冻。

此外，冷却剃须刀片、切割。将防侧倾装置和刷子放入低温恒温器中至少 26 分钟，将它们支撑到零下 10 摄氏度。此外，在低温恒温器内放置一个载玻片盒，以便能够在制作切片时存放载玻片。

当这些物品冷却时，正确标记带正电荷的载玻片，这些载玻片将用于收集组织切片并将其保持在室温下。接下来，从模具中取出样品。用室温最佳切割温度化合物覆盖金属组织盘的表面，然后将冷冻样品推到上面。

将湿支架放入低温恒温器中，让它冷却至少 15 分钟。冷却后，将湿式支架放入低温恒温器的圆盘支架中，并将切割厚度调整到 5 到 6 微米之间。接下来，通过切割封固剂来调整防卷装置的位置，直到切片均匀正确地形成。

设置正确后，通过以连续均匀运动转动轮子来进行组织切片。使用刷子在舞台上抓取和纵该部分。将玻璃灯放在切片上方并慢慢向下倾斜直到组织切片接触载玻片，逐个取回组织切片。

使用疏水屏障笔，在载玻片安装组织周围画一个圆圈。让圆圈在室温下干燥约 1 分钟。然后使用永久性记号笔在载玻片背面的组织切片周围画一条线。

接下来，我们在室温下用一滴 PBS 覆盖组织切片几分钟，以水合组织切片。然后用新鲜制备的 3% 多聚甲醛溶液（溶于 PBS）中固定组织切片 10 至 15 分钟。然后将它们渗透到含 0.05% 皂苷的 PBS 中 10 至 15 分钟。

接下来，抗原修复后，将它们在 PBS 和 3% 牛血清白蛋白的 PBS 中在室温下孵育至少 30 分钟需要时，用 PBS 冲洗组织切片，然后在 PBS 中与 3% 血清白蛋白在室温下孵育至少 30 分钟。接下来，去除封闭溶液和 30 至 50 微升用含 2% BSA 的 PBS 稀释的一抗，使每个组织切片完全覆盖。将相同体积的稀释剂单独放在组织切片上以进行阴性对照。

然后第二天将载玻片放入加湿箱中，在 4 摄氏度下过夜。用室温 PBS 彻底清洗组织切片 10 分钟，然后重复至少四次。根据制造商的说明，在含有 2% BSA 的 PBS 中稀释适当的二抗，然后将 30 至 50 μL 该溶液滴在所有组织切片上。

在室温下孵育切片一个半小时。然后用室温 PBS 再次彻底清洗组织切片 10 分钟，并重复至少四次。接下来，在室温下将组织在 30 至 50 微升含有每毫升 boda P 4 93、5 0 3 的 A PBS 溶液中孵育 10 分钟，从而为切片中的中性脂质着色。

孵育后，用 PBS 复染剂快速冲洗组织切片两次，用 30 至 50 微升含有 3 微摩尔 DPI 的 PBS 溶液在室温下冲洗细胞核 DNA 10 分钟。在安装载玻片之前，用 PBS 洗涤组织切片两次。为了观察，去除 PBS 并在每个组织切片上滴一滴封固剂。

然后将盖玻片的一侧与载玻片成一定角度，使其与液滴的外边缘接触，然后慢慢降低盖子，避免气泡。让液体在载玻片和盖玻片之间扩散几分钟，然后用纸巾去除多余的封固剂。用指甲油将盖玻片密封在载玻片上，并将组织切片储存在 4 摄氏度。

最后，按照随附的文本协议中的说明对各部分进行成像。这些图像显示了哺乳期小鼠乳腺中 caines 的定位。在哺乳期第 10 天，在哺乳期间有或没有幼崽的情况下，果糖似乎大部分积聚在顶端区域。

此外，共聚焦显微镜显示，当乳汁分泌减慢时，在幼崽存在的情况下，火山因也存在于上皮分泌细胞的基底侧，但在较小程度上，火山因也出现在顶端质膜下，并在记忆的基底侧清晰可见。红色所示的上皮分泌细胞嗜乳脂蛋白是与牛奶、脂肪、小球和牛奶相关的主要蛋白质之一。这种跨膜蛋白主要位于乳腺上皮分泌细胞的顶端质膜，因此在出芽 Unmastered 释放后，位于乳脂球表面。

如果执行得当，可以在 8 到 10 小时内完成访问。在尝试此程序时，请务必记住在免疫检测过程中避光 遵循此程序。可以执行其他方法，例如使用透射电子显微镜进行 ImmunoGold 检测，以回答其他问题，例如目标蛋白质发育后的亚细胞定位。

这项技术为细胞生物学领域的研究人员探索蛋白质在各种物种的正常和病理组织中的定位铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何帮助处理目标蛋白质的组织分布有很好的了解。不要忘记，与动物、区域和某些仪器一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套和在抽油烟机下工作。