运用离体全胎儿各器官的直立滴文化的过程中鼠标研究器官发育过程
October 21st, 2015
离体直立液滴培养是当前体外和体内实验技术的替代方案。该方案易于执行，需要较少量的试剂，同时允许纵和研究胎儿血管形成、形态发生和器官发生的能力。
该程序的总体目标是使用离体液滴培养技术检查小分子抑制剂对胎儿器官发育的影响。这是通过首先打开怀孕小鼠的腹膜并取出包含子宫的胚胎来实现的。接下来，将胚胎从子宫中取出，并从卵黄和羊膜囊中取出。
然后解剖 goad me neph 复合体并从胚胎中分离出来。最后，在有或没有小分子抑制剂的液滴中培养 goad Meris 复合物。最终，免疫荧光显微镜用于使用细胞类型特异性抗体显示器官结构的变化。
因此，与细胞培养系相比，我们的全器官离体直立液滴培养的优势在于，它具有三维结构的优势，由于局部性而引起细胞相互作用，以及细胞外基质信号传导，这可能对器官形成和模式很重要。此外，我们的直立液滴技术允许使用更少的试剂，从而降低成本和副作用引起的潜在毒性。与其他全器官技术相比，这是一个优势，并且它仍然允许药物扩散到目标器官。
虽然这项技术可以深入了解胎儿睾丸的血管发育，但它也可以应用于其他胎儿器官，如肺，我们也可以用它来研究不同的生物过程。胎儿发育过程中还有其他细胞信号通路 在 E 11.5。根据文本，对怀孕的小鼠实施安乐死后，用 70% 乙醇用细剪刀喷洒腹部。
做一个 V 形切口，打开腹部皮肤和腹膜，并向后拉组织瓣，露出前部器官。找到子宫角两端的卵巢，然后用剪刀剪断卵巢和结缔组织，将含有胚胎的子宫与母亲的身体分开。接下来，轻轻切开胎盘对面的一侧，露出蛋黄袋，打开子宫壁。
小心不要刺破蛋黄袋，以免损坏或丢失胚胎。然后在胎盘附近切开，取出含有卵黄袋的胚胎，并将它们放入含有钙和镁的 PBS 的培养皿中，这将有助于支持细胞粘附分子以维持组织结构并防止组织粘附在工具上 用镊子，小心地刺穿卵黄囊，从胚胎中取出卵黄囊和羊膜，形成一个胚胎可以滑出的孔。一旦胚胎在卵黄囊外，剪断脐带。
从这一点开始，使用位于无菌组织培养罩中的显微镜。用镊子捏住脖子的两侧，取出胚胎的头部，丢弃头部，取出尾巴，并将其放入新的微量离心管中进行 XY-P-C-R 分析，以确定胚胎的性别。现在，使用一对镊子用另一对镊子固定胚胎的腋窝，将胚胎固定在仰卧位，靠在培养皿的底部。
去除覆盖腹部的皮肤，轻轻去除肝脏、肠道和其他器官，露出泌尿生殖嵴所在的后体壁。小心地打开镊子并提起，使用镊子舀起泌尿生殖嵴下方。去除泌尿生殖嵴。
注意不要对性腺造成伤害。将泌尿生殖嵴转移到 C-D-M-E-M 培养皿中，以使组织适应培养基，使用 27 号针头将性腺 Sphs 复合体与泌尿生殖桥的其余部分分开。用一根针向下压切，用另一根针正确引导组织，以实现最佳分离培养。
带有小分子抑制剂的性腺使用干净消毒的剃须刀片将两个 20 μL 移液器设置为每个 15 μL 移液器。从其中一个屏障移液器吸头上切下约 1 到 2 毫米，用于转移性腺并添加对照 C-D-M-E-M。将性腺的长轴与移液器吸头平行对齐，以便可以使用截止吸头轻松移液 将 35 毫米培养皿盖的一侧标记为对照液滴，另一侧标记为含有药物的液滴。
确保盖子上的标签与包含微量离心管的尾部组织上的标签相匹配。将 15 微升含有单个性腺的 C-D-M-E-M 移液到盖子上的液滴中。注意性腺不要粘在移液器吸头的内部，并在另一侧重复第二个液滴。
在显微镜下检查性腺是否已转移到指定为对照的液滴中。使用对照移液器额外添加 15 微升含有 DMSO 的 C-D-M-E-M，以得到另一个液滴的 30 微升液滴。使用药物指定的移液管，使用移液管在 C-D-M-E-M 中加入 15 微升 TKI 二。
将液滴展开，形成一个膨胀的圆形图案，直到它们的直径约为 15 到 18 毫米，性腺大致位于中间。调整性腺的方向，使其侧躺，这样 goad 和 messines 就很容易区分。调整肺的方向，使两个肺叶平放并通过表面张力固定到位，同时不相互接触。
小心地将培养皿盖和液滴直立并平放在大加湿器培养皿中的水面上，确保下面没有气泡，也没有水进入盖子。要创建一个小型加湿室，请立即用盖子盖住大培养皿，确保小培养皿的盖子能够在较大的培养皿中自由移动，并且可以进行空气交换。将两个小盖子放入腔室后，立即将腔室放入 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中 48 小时。
根据文本方案进行 PCR 和免疫荧光。当使用 Exvivo 液滴培养系统培养时，胎儿 gana sphs 复合物具有很高的存活率，如图所示。初始孵育时 E 11.5 性腺与培养物中 24 或 48 小时的比较显示，对照 XY 性腺中性腺形状发生巨大变化，并出现条纹状绳索结构，如图所示。
液滴培养系统可以在体外重现睾丸分化事件，因为可以在 XY 性腺中可视化 SOX 9 个阳性支持细胞，形成管状脊髓，并在整个器官中形成脉管系统。在肺中，48 小时培养导致 SOX 9 eco herrin 双阳性上皮分支的分支增加。虽然肺中的凋亡细胞有所增加，但在相同的培养条件下，在对照培养和子宫中观察到相似水平的细胞凋亡。
性腺表明性腺特别适合培养条件。为了检查血管形成和血管重塑对睾丸形态发生的影响，使用了阻断 VEGF 受体活性的小分子抑制剂 TKI 二。结果表明，胎儿睾丸血管重塑的破坏在液滴培养系统中是有效的，并且按照该程序可以观察到睾丸索形态发生的后续缺陷。
可以执行其他方法，如实时定量 PCR、下一代 RNA 测序或流式细胞术，以回答其他问题，例如不同的药理学试剂如何影响蛋白质或目标基因的表达。此外，如果使用转基因荧光胚胎，我们可以使用延时实时成像来实时可视化细胞动力学。此外，有多种试剂可用于靶向可能参与胎儿器官发生的候选信号通路。
这些技术将帮助我们了解驱动胎儿发育的潜在机制。观看此视频后，您应该能够进行全器官离体直立液滴培养，以阐明胎儿器官发生过程中的信号通路。该技术涉及解剖妊娠中期胚胎、分离靶器官以及制备直立液滴培养物，以便用药物试剂孵育这些器官。
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概述
体外直立液滴培养是一种用于研究胎儿器官发育的创新技术。该方法允许在使用较少试剂的情况下对胎儿血管形成和器官发生进行操作。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 细胞生物学
背景
- 当前的体外和体内技术存在局限性。
- 体外液滴培养提供了一种更简单的替代方法。
- 该方法有助于研究复杂的生物过程。
- 可以测试小分子抑制剂对器官发育的影响。
研究目的
- 检查小分子抑制剂对胎儿器官发育的影响。
- 利用体外液滴培养技术进行此项检查。
- 通过免疫荧光显微镜评估器官结构的变化。
使用的方法
- 打开孕鼠的腹膜。
- 取出胚胎并分离腺-肾复合体。
- 在液滴中培养腺-肾复合体。
- 使用具有细胞类型特异性抗体的免疫荧光显微镜。
主要结果
- 观察到器官结构的变化。
- 记录了小分子抑制剂的影响。
- 液滴培养技术对这项研究证明是有效的。
- 免疫荧光显微镜提供了宝贵的洞察。
结论
- 体外液滴培养是研究胎儿器官发育的可行替代方法。
- 该方法允许对器官发生进行详细检查。
- 小分子抑制剂可能显著影响胎儿器官发育。
常见问题
Executive Industry Relevance
The ex vivo upright droplet culture method enables mechanistic interrogation of fetal organ development with reduced reagent consumption and preserved three-dimensional architecture. This approach supports target validation and pathway de-risking in early discovery by allowing pharmacological modulation of specific signaling pathways without systemic toxicity. The system provides a scalable, reproducible platform for assessing compound effects on organ morphogenesis, informing go/no-go decisions in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of therapeutic targets by examining organ-specific responses to small molecule inhibitors in intact fetal organs.
- Operational Value: Reduces reagent usage and cost compared to traditional ex vivo or in vitro systems while maintaining tissue integrity.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing downstream effects of pathway inhibition on organ architecture and cellular differentiation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a quantitative readout of organogenesis through immunofluorescence-based assessment of structural changes and marker expression.
- Operational Value: Facilitates assay standardization via upright droplet culture format that ensures consistent organ positioning and reagent diffusion.
- Scalability: Enables parallel testing of control and compound-treated conditions within the same experimental setup.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical evaluation by modeling human-relevant organogenesis processes in a physiologically contextual system.
- Biomarker Alignment: Supports evaluation of pathway-specific biomarkers (e.g., SOX9) in response to pharmacological perturbation.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables early detection of developmental toxicity or mechanistic liabilities that may not appear in cell-based assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization by providing a physiologically relevant system for assessing compound effects on fetal organ development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of pharmacological impacts on morphogenesis and cell-cell interactions.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible droplet culture technique that allows standardized compound exposure and readout via immunofluorescence.
- Analytics: Generates quantitative, imaging-based readouts that enable comparison of organ architecture, branching patterns, and cellular differentiation across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling organ-specific responses relevant to developmental toxicity assessment.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform applicable across multiple fetal organ systems (e.g., testis, lung) with organ-specific adaptation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by preserving native tissue architecture and enabling study of multicellular interactions lost in monolayer cultures.
- Operational Value: Improves reproducibility and reduces variability through standardized dissection, culture, and imaging protocols.
- Strategic Value: Informs better go/no-go decisions by identifying mechanistic liabilities early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing data on target engagement and pathway modulation in intact organ systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection and organ isolation under sterile conditions.
- Dependent on access to microscopy and immunofluorescence infrastructure for endpoint analysis.
- Necessitates standardization of droplet preparation and incubation conditions across users and labs.
- Involves adaptation considerations for different fetal organs due to variations in size, fragility, and culture tolerance.
- Limited by the embryonic lethality of certain genetic or pharmacological perturbations in vivo, which this method helps circumvent.
