人外周血代文化血液的产物内皮细胞

该方案的总体目标是可靠地从人外周血中产生血液生长的内皮细胞。这种方法可以帮助回答血管生物学领域的关键问题，例如内皮细胞功能障碍如何导致心血管疾病，包括肺动脉高压或血管性血友病。这项技术的主要优点是它始终如一地从少量成人外周血中产生稳定的血液生长内皮细胞群 演示程序将是我实验室的研究生和实验室教授 Nicholas Morrell 的 Christopher Wang。

开始此过程。对于每个供体，向两个 50 ml 锥形离心管中分别添加 3 毫升柠檬酸钠。然后将收集的血液加入每根试管中 30 毫升。

轻轻地将试管倒置 2 到 3 次以进行混合。接下来，用 DPBS 以 1 比 1 的比例稀释 60 毫升血液，倾斜包含密度梯度的试管。使用移液器辅助装置和 25 毫升血清移液管将培养基与工作表面成 20 度角离心。

将 21 毫升稀释的血液慢慢地铺在培养基上。然后，在室温下用加速器将样品以 400 x G 离心 35 分钟，然后断开 在离心过程中，通过稀释原液以 50 μg/mL 修复胶原蛋白溶液。10 毫升 0.02 摩尔乙酸中的一型胶原蛋白无菌。

使用前过滤胶原蛋白悬浮液。接下来，向 T 75 细胞培养瓶中加入 7.5 毫升胶原蛋白溶液。让培养瓶在室温下包被 1 小时。

包被 1 小时后，吸出胶原蛋白溶液并在培养瓶中吸取 10 毫升 DPBS 以洗去残留的乙酸。吸出 DPBS 并再次重复洗涤。然后向培养瓶中加入 5 mL BOEC 生成培养基，以防止胶原涂层变干，直到细胞悬液准备好铺板。

密度梯度离心后，使用无菌塑料移液管小心收集血沉棕黄层，避免转移密度梯度介质。血沉棕黄层的收集应从每管中产生大约 20 毫升的 cel 悬液和血浆。然后，在 DPBS 中以 1 比 1 的比例稀释单核细胞悬液并倒置混合，然后在室温下以 300 倍 G 离心 20 分钟，离心后将制动器和加速器设置为最大，吸出上清液并重悬细胞，向每个沉淀中加入 1 毫升 BOEC 生成培养基并反复上下吹打，将所有细胞悬液拉到一起并加满总体积为 10 毫升，剩余培养基。

为了估计总细胞数，用 10 微升 Turk 溶液稀释 490 微升细胞悬液以溶解红细胞。然后使用血细胞计数器对 10 μL 稀释的细胞悬液样品进行计数。随后将细胞悬液接种到单个胶原包被的 T 75 培养瓶中。

将培养基体积加满，每个培养瓶最多 15 毫升并培养。细胞在 37 摄氏度的含 5% CO2 潮湿环境中。现在每两天更换一次培养基，加入 15 毫升新鲜的 BOEC 生成，培养基到周末培养中，培养基更换可以延迟到每三天一次。

在第 7 天至第 14 天监测 BOEC 培养瓶中生长菌落的出现。将集落识别为表现出经典内皮鹅卵石形态的圆形细胞群。在培养瓶中鉴定出一个或多个菌落后，继续更换培养基，让菌落生长到每个菌落约 1000 至 2000 个细胞。

在包装之前，通过粗略的目测估计确定每个菌落的细胞数。然后用 10 ml DPBS 冲洗培养瓶两次，使细胞传代。加入 5 毫升 1 x tripsin EDTA，在 37 摄氏度的培养箱中孵育 5 分钟。

5 分钟后，用 10 mL 含 FBS 的培养基中和胰蛋白酶，并通过重复移液使细胞悬浮。接下来，将悬浮液以 300 倍 G 离心 5 分钟。将细胞重悬于 15 mL 新鲜的 BOEC 生成培养基中，并将整个细胞悬液接种到没有胶原涂层的新 T 75 培养瓶中。继续。

更换培养基，直到细胞汇合并传代。如前所述，用于继续包装板的细胞。每个 T 75 培养瓶不少于 750， 000 个细胞，因为低细胞密度会导致 BO eecs 停止增殖。

在此过程中，胰蛋白酶观察细胞并以 300 倍 G 离心 5 分钟。之后，吸出 snat 并将细胞重悬于 10 毫升培养基中。收集 10 μL 细胞悬液样品并进行手动细胞计数。

接下来，再次离心样品，并以 2 倍 10 倍的浓度重悬于冰冷的冷冻保存培养基中，至每毫升 6 个细胞。向每个小瓶中加入 0.5 mL 细胞悬液，并将小瓶放入冰冷的异丙醇冷冻保存容器中。然后将容器置于负 80 摄氏度的冰箱中至少两小时，然后再转移到液氮中。

要解冻细胞，将 10 mL 预热培养基添加到 15 mL 锥形离心管中。从液氮中取出细胞，在 37 摄氏度的水浴中轻轻搅拌解冻，直到小瓶中只剩下一个小冰晶。然后将样品瓶中的内容物滴加到锥形离心管中，并以 300 倍 G 的速度离心 5 分钟。

随后，吸出上清液并复苏悬浮细胞沉淀。将细胞悬液添加到 T 75 培养瓶中，并将培养基加满至 15 mL。在这张图片中，生长菌落显示为内皮样细胞的集合，排列在鹅卵石单层中，并从生长菌落周围的中心点径向增殖，是贴壁单核细胞，构成了早期培养物中的绝大多数细胞包装后，高度增殖的 bo Oecs 接管培养物，因为非增殖性单核细胞要么死亡，要么无法重新连接。

这是用抗内皮细胞表面标志物 CD 1 44 的抗体染色的 Bo Oecs 免疫的代表性免疫荧光图像。在这张图片中，B oecs 是针对血糖蛋白 von Willebrand 因子的抗体的免疫染色。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在不到两个小时的时间内完成。

在尝试此程序时，请务必记住尽快处理血液样本，最好在采集后两小时内处理。在此程序之后，细胞可用于研究健康和疾病中的内皮细胞功能，或重新编程为诱导的 flury potent 干细胞，用于分化研究、疾病建模或细胞治疗。这项技术为我们研究 2 型骨形态发生蛋白受体突变对患者血液生长内皮细胞和 IPSC 衍生情绪肌肉细胞肺动脉高压发病机制的影响铺平了道路。

观看此视频后，您应该对如何从少量外周血中生成和表征稳定的血液生长内皮细胞有很好的了解。不要忘记，处理未经筛查的人类血液可能非常危险，执行此程序时应始终佩戴个人防护设备，包括手套和实验室外套。