染色质免疫沉淀拟南芥蛋白-DNA相互作用的鉴定在体内

该程序的总体目标是揭示拟南芥细胞染色质中蛋白质和 DNA 之间的相互作用。这种方法可以帮助回答植物生物学领域的关键问题，例如哪些基因受给定转录因子的调节，或者哪些系统修饰与基因的转录状态相关。该技术的主要优点是，通过交联步骤，可以固定和捕获植物发育过程中发生的染色质组织变化。

虽然这种方法可以深入了解拟南芥中的蛋白质相互作用，但它也可以应用于不同的植物目并适应其他植物物种。演示此程序的是我们实验室的两名博士生 Dorota Komar 和 Alfonso Mouriz。根据文本方案种植拟南芥后，在 50 毫升试管中收集 1.5 克植物材料，并在交联过程中将它们保存在冰上。

然后，使用实验室燃烧器加热的针头在管盖上打小孔。向试管中加入 40 毫升 1x pbs 和 1.08 毫升甲醛。拧上试管的盖子，然后将试管放入干燥器中。

真空浸润 10 分钟，然后小心地释放真空以防止溶液搅动。混合样品后，重复真空和混合步骤。渗透后，观察植物材料并确认它变得略微半透明并沉到管底部。

加入 2.5 毫升 2 摩尔甘氨酸，使终浓度为 0.125 摩尔，然后真空 5 分钟。释放真空后，倒置试管并让其从盖子上的孔中滴落，丢弃溶液。用 pbs 冲洗小植株两次，然后用水冲洗一次。

然后在纸巾上擦干小植株，然后用液氮冷冻。每次免疫沉淀，在 1.5 mL 微量离心管中制备 15 μL 磁珠。向磁珠中加入 1 mL 染色质免疫沉淀或 ChIP 稀释缓冲液，旋转混合，然后将 1.5 mL 微量离心管放入磁力架中。

让磁珠附着在磁力架上约一分钟后，使用移液器去除上清液，然后重复洗涤。将磁珠重悬于 200 μL 芯片稀释缓冲液中。对于免疫沉淀，将所需量的特异性抗体添加到为每个植物盲法制备的两个试管中的一个中。

ChIP 实验成功的一个关键因素是选择用于目标蛋白质免疫沉淀的抗体。针对植物转录因子产生的抗体可用于 ChIP 实验，但必须对血清进行彻底测试。例如，仅在 Western blot 分析中检查的抗体不一定对 ChIP 有效。

作为阴性对照，向第二管中加入等量的非特异性 IGG。将试管在 4 摄氏度下在旋转轮上孵育过夜，以使抗体附着在珠子上。使用研钵和研杵，在液氮中彻底研磨冷冻的植物材料，直到粉末变得均匀并呈浅绿色。

将粉末转移到新的 50 毫升试管中。在通风橱下，加入 30 毫升提取缓冲液 1，并充分混合以浸泡组织粉末。从此步骤开始，将样品始终保持在 4 摄氏度，并确保组织完全解冻后再继续前进。

浆液通过孔径为 22 至 25 微米的过滤组织放入新的 50 毫升试管中，以清除浆料。然后以 1， 000 倍 g 和 4 摄氏度离心 20 分钟。轻轻地从沉淀中倒出上清液，其体积应约为 2 mL。

用 5 毫升提取缓冲液 2 重新悬浮沉淀。然后以 1， 000 倍 g 和 4 摄氏度离心 10 分钟。倾析上清液后，将沉淀重悬于 300 μL 提取缓冲液 3 中。

在单独的试管中，加入 600 微升提取缓冲液 3，然后小心地将重悬沉淀物分层在干净的缓冲液上。在 4 摄氏度下以 16， 000 倍 g 离心管 1 小时，然后用移液管吸出上清液。接下来，使用 300 μL 超声处理缓冲液缓慢重悬细胞核沉淀，避免形成气泡，这可能会影响超声处理效率。

小心地将悬浮液转移到干净的 1.5 ml 试管中。对悬浮液进行超声处理以裂解细胞核，并将染色质随机分享成 200 至 600 个碱基对片段。在琼脂糖凝胶上验证 DNA 片段大小，然后在 12， 000 x g 和 4 摄氏度下旋转溶液 10 分钟。

将上清液转移到新的 1.5 ml 试管中，弃去沉淀。将十分之一的上清液分装到新管中，并在零下 20 摄氏度冷冻之前将其标记为 input'。最后，在 ChIP 稀释缓冲液中将染色质稀释 10 倍，以达到 0.1% 的最终 SDS 浓度。

然后可以将样品冷冻并在零下 20 摄氏度下储存数周。将微珠与抗体孵育过夜后，使用 1 毫升 ChIP 稀释缓冲液洗涤微珠 3 次，然后将微珠重新悬浮在 1 毫升稀释的染色质中，并在 4 摄氏度的旋转轮上孵育试管过夜。第二天，将磁珠放在 4 摄氏度的磁力架上，去除溶液后，用 1 毫升低盐洗涤缓冲液洗涤珠子两次，然后使用高盐洗涤缓冲液洗涤珠子一次。

使用 1 毫升氯化锂洗涤缓冲液洗涤磁珠一次后，使用 1 毫升 TE 缓冲液洗涤磁珠两次。吸液以彻底去除 TE 洗涤缓冲液。输入样品解冻后，将每种样品的 5 微升转移到新的 1.5 毫升试管中，然后向前，以与芯片样品类似的方式处理。

加入 200 微升 5% 螯合离子交换树脂，逆转交联，并在 95 摄氏度下孵育 10 分钟，每 2 到 3 分钟振荡一次。以 16， 000 次 g 离心 30 秒，然后小心地将上清液转移到新的微量离心管中。每毫升加入 2 微升 10 毫克质子酶 K，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟以消化蛋白质并释放 DNA。

要终止反应，请在 95 摄氏度下孵育 10 分钟，以 16， 000 倍 g 快速旋转 30 秒，然后将上清液转移到新试管中。根据文本方案清洁 DNA 后，用水稀释 1 至 10 次，每个反应使用 5 微升，通过 qPCR 测量结合位点的丰度。根据文本协议分析数据。

拟芥的叶子覆盖着蜡层，毛状体有利于气泡的形成，这两者都使交联试剂难以穿透植物组织。这里显示的是真空交联以提高固定效率的交联幼苗样品。该图表明，超声处理循环次数的增加会逐渐减小芯片样品中 DNA 的平均大小，在 20 至 30 个循环后达到 200 至 600 个碱基对的最佳富集度，如图所示。

如图所示，已选择对 FT 位点（开花的主基因）的转录调控重要的四个区域进行分析。ChIP 结果表明，EBS 蛋白结合了四个测试区域之一，该调节序列靠近 FT 的转录起始位点。最后，使用针对赖氨酸 9 和 14 中乙酰化的组蛋白 h3 的抗体进行的 ChIP 测定，这与转录活性染色质相关，显示突变体 DBS 中 H3K9/14ac 的丰度高于野生型植物，在所有四个测试的 FT 基因组片段中，与观察到的该开花主基因的上调一致该突变体。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两天内完成。

遵循此程序以及基因表达分析等其他措施有助于回答其他问题，例如：蛋白质与 DNA 结合的生物学作用是什么？是在转录激活还是抑制时？哪些组蛋白修饰相关？

开发后，这项技术为植物表观遗传学领域的研究人员探索我们还原细胞中的染色质状态铺平了道路。这可以扩展到其他植物物种。观看此视频后，您应该对如何在体内分析目标拟知蛋白与 DNA 的结合有一个很好的了解。

不要忘记，使用 2-甲氧基乙醇、甲醛或超声试剂、病原体和茎突变可能非常危险，因此在使用该程序时应始终采取预防措施，例如防护服、手套或听力保护装置。