糖皮质激素粪分析:在马属动物无创监测肾上腺

可以通过分析粪便中的皮质酮代谢物来评估马种的肾上腺活性。该方法提供了一种非侵入性选择来评估家养和自由放养马的长期模式。该协议描述了所涉及的酶联免疫测定和相关的生化验证。

该程序的总体目标是展示如何通过提取和分析粪便糖皮质激素代谢物来无创评估马的肾上腺活动。这种方法可以帮助我们回答福利评估领域的关键问题，方法是查看饲养协议对家马的生理影响，一直到非洲斑马的野生种群。该技术的主要优点是它为测量家养和自由放养马的长期肾上腺活动提供了一种非侵入性选择。

在实验当天，在室温下解冻后，通过在每个单独的样品袋中混合来手动匀浆粪便样品。然后，对于每个样品，在干净的称量舟中的微量天平上量出适量的粪便，并将样品转移到单独的 8 mL 玻璃样品瓶中。接下来，将 5 mL 90% 甲醇的水溶液与每个样品混合，并在室温下在轨道摇床上摇动样品过夜。

第二天早上，涡旋样品并将它们旋转下来。离心结束时，将甲醇馏分倒入 16 x 125 mm 的玻璃管中。然后将试管短暂放入 37 摄氏度的水浴中，然后在通风柜中的空气中蒸发甲醇。

当所有甲醇分散后，将粪便提取物重悬于一毫升 100% 甲醇中。然后将提取物转移到单独的 12 x 75 毫米聚丙烯管中，盖上管子，并将样品储存在零下 20 摄氏度下，直到进行分析。在开始分析之前，使用带有 50 微升移液器吸头的重复移液器，将 50 微升多克隆皮质酮 CJM006 抗血清（在包被缓冲液中稀释）装入 96 孔微量滴定板中。

然后用板密封剂盖住板，并在 4 摄氏度下孵育抗血清过夜。第二天，在开始分析之前，使用自动微量滴定洗板机用洗涤液清洗板五次。然后，每孔用 50 μL 酶联免疫测定或 EIA 缓冲液加载非特异性结合孔和零孔，用适当浓度的皮质酮加载标准孔，用在 EIA 缓冲液中稀释的粪便提取物样品加载实验孔。

上样最后一个样品后，立即向每个孔中加入 50 μL 用 EIA 缓冲液稀释的辣根 perodixase 偶联物，并将微量滴定板在室温下避光孵育 2 小时。孵育结束时，用洗涤液洗涤板五次。然后将样品与每孔 100 微升新鲜制备的室温底物在室温下避光孵育，并在分光光度计上定期读取 405 纳米的板。

当零孔的光密度达到 0.8 至 1.0 时，认为孵育完成。为了进行平行性的生化验证，对混合的粪便提取物进行连续稀释，最好从几个个体的可疑高激素和低激素浓度样品中提取。然后，在 EIA 上运行示例，如刚才所示。

当粪便提取物的连续稀释产生平行于标准曲线的位移曲线，并且线性回归结果显示 R 平方大于 0.9，斜率大于 0.5 和 P 小于 05 时，认为实现了平行性。为了进行干扰的生化验证，将 200 μL 连续稀释标准品与 200 μL 适当的混合粪便提取物加标，以 50% 结合力稀释，通过平行测定确定。然后，按照演示在 EIA 上运行样本。

在 EIA 分析之后，绘制观察到的浓度减去零样品的背景浓度与预期浓度的对比。如果向标准品中添加稀释的混合粪便提取物不会显着改变预期量，并且线性回归结果得出 R 平方大于 0.9，斜率接近 1，并且 P 小于 05，则认为没有干扰。要进行生物验证，请在 EIA 上发生具有挑战性的事件之前和之后运行提取的样品，如刚才所示。

生物学验证是验证 EIA 的关键步骤，当在具有挑战性的事件后观察到糖皮质激素代谢物显着增加时，即认为已实现。图 A 和 B 中的数据通过证明与皮质酮标准曲线的平行性，展示了成年雄性和雌性家马的生化验证。没有使用皮质醇 EIA 进行生化验证，因为混合粪便提取物和皮质醇标准曲线之间没有平行性。

这些来自受攻击的雄性和雌性家马的数据证明了生物学验证，因为粪便皮质酮的浓度随着这些动物隔离水平的增加而增加。事实上，与所有其他猪舍设计相比，隔离猪舍中的马表现出更高水平的粪便皮质酮。因此，评估唾液或血浆中的激素浓度通常涉及我们查看天然激素，但当我们评估粪便中的激素浓度时，我们要查看该产品的分解，并查看该激素的代谢终产物。

事实上，粪便采样提供了随时间变化的糖皮质类浓度，而不是唾液或血浆反映的单个点。这使得它更适合测量长期、慢性或季节性肾上腺活动。因此，由于粪便样本采集对动物是非侵入性的，因此它已被广泛用于在许多自然和实验环境中监测马的肾上腺活动。

运行 EIA 时，重要的是将微量滴定板的加载时间缩短到 10 分钟以下，因为时间过长会导致漂移。确保重复样品的变异系数小于 10% 且对照的批内和批间系数变异分别为 10% 和 15% 也很重要。因此，在观看此视频后，您应该对如何提取粪便糖皮质激素代谢物、在酶免疫测定中分析这些提取物以及执行所需的验证步骤有很好的了解。