蛋白质生物缀合物的合成通过半胱氨酸马来酰亚胺化学
July 20th, 2016
该协议细节对于含有蛋白质马来酰亚胺，包括试剂纯化，反应条件，生物共轭纯化和生物共轭表征半胱氨酸的生物结合所需的重要步骤。
通过半胱氨酸-马来酰亚胺化学合成蛋白质生物偶联物的总体目标是确保蛋白质修饰位点的特异性。这反过来又会影响所得生物偶联物的活性，例如抗体药物偶联物。如果您对蛋白质结构或功能感兴趣，并且您从事纳米医学、荧光显微镜或系统化学方面的研究，那么这项技术将帮助您回答您的问题。
该技术的主要优点是它在更多条件下具有高度特异性和高产量。要开始此程序，请将 12 毫克冻干细胞色素 C 溶解在 6 毫升 20 毫摩尔磷酸盐缓冲液中。将 16 微升新鲜制备的一摩尔 DTT 溶液移液到蛋白质溶液中以减少细胞色素 C.混合溶液后，通过 0.22 微米低蛋白结合 PBDF 注射器过滤器过滤，然后再注射到任何色谱介质上。
接下来，通过快速蛋白质液体色谱或 FPLC 纯化还原的粗细胞色素 C 溶液。平衡强阳离子 Strange 色谱柱后，将 1 mL 溶液上样到仪器的进样定量环中。接下来，对于 450 毫摩尔氯化钠，从 328 开始梯度方法，超过 5 个色谱柱体积。
监测 UV Viz 检测器的 280 和 410 纳米通道，并收集最大峰。现在将盐浓度增加到 1 摩尔，两个柱体积以掠夺 ISO2 细胞色素 C.冲洗柱后，用两个柱体积的 20 毫摩尔磷酸盐缓冲液重新平衡，然后再注入下一个粗等分试样。此时，将 0.9 毫克适当的马来酰亚胺钌络合物溶解在 600 μL 乙腈中。
通过将 2.87 毫克 TCEP 溶解在 1 毫升超纯水中来制备 10 毫摩尔的 TCEP 溶液。将 11.4 毫升超纯水与 3 毫升 100 毫摩尔磷酸盐-EDTA 储备液混合在 50 毫升塑料管中。然后将 0.15 μmol 纯化的细胞色素 C 添加到磷酸盐-EDTA 溶液中。
向蛋白质溶液中加入 7.5 μL TCEP 储备液。搅拌 5 分钟，以减少可能由于半胱氨酸氧化而二聚化的任何蛋白质。接下来，将 600 微升马来酰亚胺钌复合物溶液加入还原缓冲细胞色素 C 溶液中，并将反应混合物在室温下避光搅拌 24 小时。
添加的顺序至关重要。首先添加蛋白质，其次添加还原剂，最后添加 maliemide 至关重要。第二天，使用 3.5 kdalton 截留分子量旋转过滤器离心浓缩反应混合物。
用新鲜的 20 毫摩尔磷酸盐缓冲液重复离心 2 到 3 次，直到滤液澄清。对于镍基纯化，用 3 毫升超纯水、3 毫升 100 毫摩尔乙酸镍溶液和 6 毫升超纯水洗涤 1 毫升移动化金属亲和色谱柱。然后，将含镍色谱柱连接到进样定量环和 UV viz 检测器之间的 FPLC 上。
然后，以每分钟 0.5 mL 的流速，用三个柱体积的 20 毫摩尔磷酸盐、0.5 摩尔氯化钠缓冲液平衡色谱柱。通过 0.22 微米针式过滤器过滤后，将 100 μL 粗反应混合物加载到仪器的进样回路中。用三个柱体积的缓冲液洗涤柱子，以洗脱未反应的细胞色素 C，然后使用咪唑梯度从 0 到 125 毫摩尔在三个柱体积上洗脱细胞色素 C 生物偶联物。
细胞色素 C 生物偶联物从色谱柱中洗脱后，用 250 毫摩尔咪唑缓冲液洗涤 5 个柱体积。然后用 20 毫摩尔磷酸盐 0.5 摩尔氯化钠缓冲液重新平衡色谱柱。接下来拉出生物偶联物组分。
并使用 3.5 kdalton 分子量截留自旋过滤器离心浓缩。离心后，将浓缩的生物偶联物加载到 3.5 道尔顿分子量的截断透析盒中，并用超纯水透析过夜。第二天，通过紫外-可见光谱法测定纯浓生物偶联物溶液的浓度。
在 410 纳米处使用与 ISO1 细胞色素 C 相同的摩尔吸收率值。将剩余的生物偶联物以 25 微升等分试样储存在零下 20 摄氏度。对于凝胶电泳，通过用预混的十二烷基硫酸锂缓冲液稀释生物偶联物至终浓度约为每孔 20 μg，制备 10 μL 的每种蛋白质样品进行运行。
然后将样品加热至 70 摄氏度 10 分钟。让样品冷却至室温后，使用长移液器吸头将其小心地加载到预制的 12%bis tris、1 毫米 10 孔凝胶上，以协助上样。将预染的 10 蛋白质分子量标准品上样到凝胶的中间孔中，以帮助分析。
现在在 200 伏特下运行凝胶 35 分钟。电泳完成后，用市售考马斯蓝溶液对凝胶染色 2 小时。去除考马斯蓝溶液后，用超纯水洗涤凝胶 48 小时。
在细胞色素 C 生物偶联物的多 tof 质谱中不存在未反应蛋白质的质量增加表明钌马来酰亚胺复合物与细胞色素 C 的成功等效键以及生物偶联物的后续纯化。细胞色素 C 生物偶联物的产量通常在 15% 到 27% 之间，并且可以从紫外-可见光谱计算。生物偶联物由马来酰亚胺与蛋白质的一对一连接组成。
这是通过将生物偶联物的光谱与起始材料的预测一对一加成光谱进行比较来推断的。此外，纯化过程中色谱图中出现新峰证实了新物种的合成。一旦掌握，如果执行得当，该程序可以在三天内完成。
在尝试此程序时，请务必戴上手套小心处理蛋白质溶液，以防止蛋白质进入样品。该程序可用于其他马来酰亚胺与含半胱氨酸的蛋白质的偶联。为了回答其他问题，例如膜蛋白是否在活的原生动物膜中。
开发后，这项技术为生物分子领域的研究人员更多地了解蛋白质功能和基于视觉的约束中的定位铺平了道路。观看本视频后，您应该对如何利用半胱氨酸马来酰亚胺化学试剂以高产率标记生物大分子有很好的了解。不要忘记，使用具有未知特性的研究化学品可能非常危险。
并且在执行此程序时应采取适当的预防措施，例如 PPE。
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概览
本协议详细说明了含半胱氨酸蛋白与马来酰亚胺的生物结合，重点关注试剂纯化、反应条件和生物结合物的表征。该技术对于确保蛋白质修饰的特异性至关重要，影响着生物结合物的活性。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物结合
- 蛋白质化学
- 纳米医学
背景
- 半胱氨酸-马来酰亚胺化学允许在蛋白质上进行特定位点修饰。
- 这种特异性对于抗体-药物结合物等应用至关重要。
- 该技术因其高产率和特异性而具有优势。
- 它适用于荧光显微镜和系统化学等领域。
研究目的
- 合成具有高特异性的蛋白质生物结合物。
- 增强对蛋白质结构和功能的理解。
- 为相关领域的研究人员提供一种可靠的方法。
使用的方法
- 将细胞色素C溶解在磷酸盐缓冲液中。
- 用DTT还原细胞色素C。
- 通过低蛋白结合过滤器过滤溶液。
- 注射到色谱介质上进行纯化。
主要结果
- 成功地将含半胱氨酸的蛋白质进行生物结合。
- 反应中实现了高特异性和高产率。
- 生物结合物的表征确认了所需的修饰。
- 展示了在各种科学领域中的适用性。
结论
- 半胱氨酸-马来酰亚胺化学是蛋白质修饰的强大工具。
- 该方法可以显著影响纳米医学和相关领域的研究。
- 进一步探索该技术可能会在生物结合物研究中带来新的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cysteine-maleimide bioconjugation enables site-specific protein modification critical for developing antibody-drug conjugates and nanomedicines with predictable activity. This method supports target validation by ensuring defined molecular structures that reduce mechanistic uncertainty in early discovery. Its high specificity and yield under mild conditions improve predictive confidence in lead identification workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise cysteine residue modification.
- Operational Value: Provides reproducible bioconjugation for functional target de-risking.
- Strategic Value: Supports predictive confidence in protein function studies for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates homogeneous protein-dye or protein-drug conjugates for reliable assay readouts.
- Operational Value: Delivers quantifiable bioconjugates amenable to HPLC and UV-Vis characterization.
- Strategic Value: Facilitates scalable preparation of labeled proteins for high-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains protein structure-function relationships through site-specific labeling.
- Operational Value: Yields purified bioconjugates suitable for biodistribution and pharmacokinetic studies.
- Strategic Value: Reduces late-stage attrition by confirming target engagement via defined conjugates.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within early discovery to preclinical workflows where site-specific protein labeling informs target validation and lead optimization decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via controlled modification of surface-accessible cysteines.
- Screening: Enables preparation of fluorescent or drug-conjugated proteins for quantitative binding assays.
- Analytics: Provides MALDI-TOF MS and UV-Vis outputs for bioconjugate verification and yield calculation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through characterized bioconjugates with known drug-to-protein ratios.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized platform applicable to diverse cysteine-containing proteins and payloads.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through site-specific modification reducing off-target effects.
- Operational Value: High yield and purity under mild conditions ensure manufacturing feasibility.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions via defined bioconjugate activity profiles.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on validated conjugation efficiency.
Implementation Considerations
- Protein chemistry expertise for cysteine accessibility and reduction optimization.
- FPLC and UV-Vis instrumentation for purification and characterization.
- Standardized buffers and reducing agents (DTT/TCEP) for reproducible results.
- Adaptation considerations for solvent compatibility with acetonitrile-soluble maleimides.
- Practical limitations include potential cysteine oxidation requiring inert handling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:43
Purification of Cytochrome c
2:11
Synthesis of Cytochrome c Bioconjugates
3:47
Purification of Cytochrome c Bioconjugates
6:02
Investigation of Bioconjugates by Gel Electrophoresis
7:08
Results: Synthesis and Characterization of Cytochrome c Bioconjugates
8:02
Conclusion
