Name: 催化游泳器件的制备及其三维跟踪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 学习利用常规荧光显微镜制备催化活性Janus胶体并测量其三维运动轨迹的方法。该技术可追踪胶体在化学梯度与重力场中的响应，为研究胶体动力学现象提供有效工具。

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本工作得到了英国工程与物理科学研究委员会（EPSRC）职业加速奖 EP/J002402/1 的资助。

警告：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表。本方案中使用的过氧化氢有害，且当其接触铂时会释放氧气，存在爆炸风险。操作过氧化氢溶液时，必须采取所有适当的安全控制措施，包括工程控制（如通风橱）和个人防护装备（安全眼镜、手套和实验服）。
1. 制备催化型Janus颗粒
<ol>
	<li>准备玻璃载玻片基底
	<ol>
		<li>使用去离子水、玻璃去污液和去离子水依次清洗未使用过的标准显微镜载玻片，每种溶液清洗数分钟。然后用体积比为70:30的乙醇-去离子水混合液洗涤，最后在洁净的空气或氮气流中吹干。</li>
		<li>在显微镜下检查玻璃载玻片，确认表面清洁且无颗粒污染物痕迹。如有需要，重复步骤1.1.1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备用于沉积的胶体分散液
	<ol>
		<li>取10 µl 荧光胶体水溶液（10% wt.）加入990 µl 乙醇中。根据所用原液浓度调整体积，以获得约0.1% wt.的胶体悬浮液。</li>
		<li>涡旋混合10秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将胶体分散液旋涂至玻璃载玻片基底
	<ol>
		<li>将洁净的玻璃载玻片安装至旋涂仪上。用移液枪吸取100 µl 上述稀释后的胶体溶液。设定旋涂仪程序为30秒、2,000 rpm。启动旋涂仪，待转速达到设定值后，持续将制备好的溶液滴加到旋转的玻璃载玻片中心。</li>
		<li>从旋涂仪上取下载玻片，放回光学显微镜下观察，确认载玻片中心区域被均匀分散、基本不相互接触的独立胶体颗粒覆盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在胶体修饰的玻璃载玻片上进行铂金属真空蒸发镀膜
	<ol>
		<li>将带有胶体的玻璃载玻片插入金属蒸发仪中，确保胶体修饰面朝向蒸发源。安装铂金属蒸发源，并沉积15 nm厚的铂金属层。 
		注意：金属沉积完成后，样品应保存在惰性气氛中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. &#34;游动&#34; Janus 粒子
<ol>
	<li>将 Janus 胶体重新悬浮于含过氧化物的溶液中
	<ol>
		<li>剪取一块 1 × 1 cm 的镜头纸，用 10 µl 去离子水润湿其一端。用镊子夹住，轻轻擦拭铂涂层胶体修饰的玻片表面（此步骤可将胶体从基底上物理剥离）。</li>
		<li>将镜头纸放入盛有 1.5 ml 去离子水的密封管中，手动剧烈振荡 30 秒，随后取出镜头纸。</li>
		<li>用移液器将 1 ml 含胶体的溶液转移至新容器中，加入 1 ml 30% w/v H2O2 储备液。轻轻混合溶液后，置于室温超声水浴中处理 5 分钟，随后静置孵育 25 分钟（不搅拌）。 
		警告：该溶液可能释放氧气；切勿密封。</li>
		<li>取 100 µl 剩余的水相胶体溶液滴加至扫描电子显微镜（SEM）样品台，干燥后用于 SEM 验证 Janus 胶体结构。14</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备分析用比色皿
	<ol>
		<li>向含有过氧化氢和铂涂层胶体的孵育溶液中再加入 1 ml 去离子水，使燃料浓度稀释至适宜水平（10%），以实现快速推进运动。 
		注意：前期孵育步骤使用较高浓度燃料，旨在清洁铂催化剂表面。</li>
		<li>将孵育后的溶液注入低体积矩形石英玻璃比色皿中，松松地盖上推入式盖帽。 
		警告：存在爆炸风险——切勿使用螺旋盖。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 显微观察
<ol>
	<li>定位目标颗粒
	<ol>
		<li>将比色皿装入配备合适物镜的荧光显微镜中例如， 20倍）并使用合适的滤光片组合激发荧光团发射（激发光450-490 nm，发射光 &#62;515 nm</li>
		<li>在比色皿中手动搜寻荧光胶体。 
		注意：可能需要在保持过氧化物浓度的同时调整胶体密度。例如，当胶体密度较高且存在大量产生气流的氧气泡时，建议进行稀释。胶体体积浓度约为0.003%时可作为推荐的起始点。</li>
		<li>优化三维追踪的光学设置：在合适的照明条件下，处于焦平面上的胶体将呈现为清晰的圆形物体。然而，随着自推进运动使胶体在焦平面内外移动，会观察到一个以球体为中心、尺寸变化明显的亮环，该亮环用于确定z坐标，从而实现三维追踪。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>录制视频
	<ol>
		<li>开始视频采集前，调节显微镜焦距，使目标颗粒呈现同心环状，且颗粒位于其中心 &#34;在……下方&#34; 焦点位置。在视频采集过程中，切勿移动焦平面。</li>
		<li>记录目标粒子的视频。采用30秒的视频时长，帧率高于30 Hz，以实现详细的轨迹重建。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>三维轨迹重建
	<ol>
		<li>校准 z 轴
		<ol>
			<li>在60 °C下，将荧光Janus颗粒悬浮于水中，配制成2% wt.的gellan gum溶液，放入与上述实验相同规格的比色皿中，静置使其凝固，形成含有固定静态胶体的坚硬透明凝胶样品。</li>
			<li>使用上述选定的相同照明条件，聚焦于单个固定的胶体颗粒，随后在相对于该平面已知位移的情况下逐步升高z轴焦点，记录一系列静态图像。</li>
			<li>在每个已知的焦位置处确定环的半径11. 
			注意：最有效的方法是使用图像分析算法，该算法可作为批处理过程应用于所有校准静态帧和视频。典型方法包括对图像进行平滑处理，通过阈值分割确定物体中心的大致位置，然后通过测量环状结构两侧强度峰值之间的距离，精确定位环中心的实际x和y坐标。随后可计算从环中心到强度峰值的平均径向距离。11 这使得亮环的半径和x-y坐标均可实现亚像素精度的测定。通过定位固定在凝胶糖中、距离焦平面30 µm的Janus微球在时间序列图像中的x、y、z位置，可使粒子在各轴方向上的定位误差控制在±25 nm以内。该误差主要来源于图像噪声。信噪比以及定位算法的准确性取决于所检测到的荧光光强。当Janus微球远离焦平面时，其信号强度会变得过弱，无法实现精确追踪。 例如对于直径为4.8 µm的胶体，可实现约200 µm的z轴范围。另一种非算法方法是通过手动测量x、y方向的中心位置和半径，但该方法会降低准确性。</li>
			<li>绘制校准曲线以关联半径与 z 轴位置，并拟合至适当的函数（例如，三次方程）以实现插值。11</li>
		</ol>
		</li>
		<li>校准 x、y 轴
		<ol>
			<li>使用在步骤3.2中选定的相同显微镜条件，拍摄空间校准网格的静态光学显微镜图像。</li>
			<li>测量 &#34;以像素为单位&#34; 根据空间校准标尺图像中已知实际尺寸的物体的尺寸，确定像素与微米之间的转换系数，用于x、y图像平面。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>重建轨迹
		<ol>
			<li>根据3.3.1.3中所述方法确定视频序列每一帧的x和y坐标及半径，使用3.3.1.4中提供的函数将半径转换为z值，并利用3.3.2.2中获得的校准系数将x和y像素坐标转换为微米。该步骤可得到推进颗粒位置随时间变化的精确x、y、z坐标。11 该步骤可使用算法或手动实施。</li>
			<li>确定平均速度等衍生性质，以量化所观察到的催化泳动程度。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ebbens, S. J., Howse, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+pursuit+of+propulsion+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">In pursuit of propulsion at the nanoscale.</a> Soft Matter. 6 (4), 726(2010).</li>
<li>Wang, W., Duan, W., Ahmed, S., Mallouk, T. E., Sen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+power+%3A+Autonomous+nano-+and+micromotors+propelled+by+self-generated+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Small power : Autonomous nano- and micromotors propelled by self-generated gradients.</a> Nano Today. 8 (5), 531-554 (2013).</li>
<li>Gao, W., Dong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Micromotors+in+the+Mouse%27s+Stomach+%3A+A+Step+toward+in+Vivo+Use+of+Synthetic+Motors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Artificial Micromotors in the Mouse's Stomach : A Step toward in Vivo Use of Synthetic Motors.</a> ACS nano. 9 (1), 117-123 (2015).</li>
<li>Restrepo-Pérez, L., Soler, L., Martìnez-Cisneros, C., Sánchez, S., Schmidt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofunctionalized+self-propelled+micromotors+as+an+alternative+on-chip+concentrating+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Biofunctionalized self-propelled micromotors as an alternative on-chip concentrating system.</a> Lab Chip. 14 (16), 2914-2917 (2014).</li>
<li>Soler, L., Sánchez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+nanomotors+for+environmental+monitoring+and+water+remediation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Catalytic nanomotors for environmental monitoring and water remediation.</a> Nanoscale. 6 (13), 7175-7182 (2014).</li>
<li>Howse, J., Jones, R., Ryan, A., Gough, T., Vafabakhsh, R., Golestanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Motile+Colloidal+Particles%3A+From+Directed+Propulsion+to+Random+Walk%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Letts%22%5BJournal%5D)">Self-Motile Colloidal Particles: From Directed Propulsion to Random Walk.</a> Phys. Rev. Letts. 99 (4), 8-11 (2007).</li>
<li>Ebbens, S., Gregory, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrokinetic+effects+in+catalytic+platinum-insulator+Janus+swimmers%5BTitle%5D)+AND+%22EPL%22%5BJournal%5D)">Electrokinetic effects in catalytic platinum-insulator Janus swimmers.</a> EPL. 106 (5), 58003(2014).</li>
<li>Orozco, J., Jurado-Sánchez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bubble-propelled+micromotors+for+enhanced+transport+of+passive+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Bubble-propelled micromotors for enhanced transport of passive tracers.</a> Langmuir. 30 (18), 5082-5087 (2014).</li>
<li>Peterson, S. D., Chuang, H. -S., Wereley, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+particle+tracking+using+micro-particle+image+velocimetry+hardware%5BTitle%5D)+AND+%22Meas.+Sci.+and+Technol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional particle tracking using micro-particle image velocimetry hardware.</a> Meas. Sci. and Technol. 19 (11), 115406(2008).</li>
<li>Ten Hagen, B., Kümmel, F., Wittkowski, R., Takagi, D., Löwen, H., Bechinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravitaxis+of+asymmetric+self-propelled+colloidal+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Gravitaxis of asymmetric self-propelled colloidal particles.</a> Nat. Commun. 5, 4829(2014).</li>
<li>Campbell, A. I., Ebbens, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravitaxis+in+spherical+janus+swimming+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Gravitaxis in spherical janus swimming devices.</a> Langmuir. 29 (46), 14066-14073 (2013).</li>
<li>Ebbens, S., Tu, M. -H., Howse, J. R., Golestanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+dependence+of+the+propulsion+velocity+for+catalytic+Janus-sphere+swimmers%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review.+E+Stat.+Nonlin.+Soft+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Size dependence of the propulsion velocity for catalytic Janus-sphere swimmers.</a> Physical Review. E Stat. Nonlin. Soft Matter Phys. 85, Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22463141 020401(2012).</li>
<li>Ebbens, S. J., Howse, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+the+direction+of+motion+for+spherical+catalytic+swimmers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Direct observation of the direction of motion for spherical catalytic swimmers.</a> Langmuir. 27 (20), 12293-12296 (2011).</li>
<li>Archer, R. J., Campbell, aI., Ebbens, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glancing+angle+metal+evaporation+synthesis+of+catalytic+swimming+Janus+colloids+with+well+defined+angular+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Glancing angle metal evaporation synthesis of catalytic swimming Janus colloids with well defined angular velocity.</a> Soft Matter. 11, 6872-6880 (2015).</li>
<li>Zhao, G., Sanchez, S., Schmidt, O. G., Pumera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poisoning+of+bubble+propelled+catalytic+micromotors%3A+the+chemical+environment+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Poisoning of bubble propelled catalytic micromotors: the chemical environment matters.</a> Nanoscale. 5 (7), 2909-2914 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Hernandez, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bipolar+electrochemical+mechanism+for+the+propulsion+of+catalytic+nanomotors+in+hydrogen+peroxide+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Bipolar electrochemical mechanism for the propulsion of catalytic nanomotors in hydrogen peroxide solutions.</a> Langmuir. 22 (25), 10451-10456 (2006).</li>
<li>Dunderdale, G., Ebbens, S., Fairclough, P., Howse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+particle+tracking+and+calculating+the+mean-squared+displacement+in+distinguishing+nanopropulsion+from+other+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Importance of particle tracking and calculating the mean-squared displacement in distinguishing nanopropulsion from other processes.</a> Langmuir. 28 (30), 10997-11006 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在制备铂金Janus颗粒的过程中，多个变量会影响观察到的运动轨迹。使用直径为2 µm的颗粒时，所描述的参数将产生约每秒10 µm的推进速度。若使用更小的颗粒，推进速度会增加；而增大颗粒尺寸则会降低推进速度。12 蒸镀工艺的具体条件也会影响所观察到的轨迹。在本实验方案中，建议采用稀疏分布的胶体颗粒，并使金属蒸镀方向垂直于载玻片表面。这些条件可形成如图2所示的对称Janus结构，从而在布朗旋转扩散的限制范围内实现线性运动轨迹。13 相反，若对紧密排列的胶体颗粒进行掠角沉积，则可能破坏Janus帽层的对称性，从而诱导颗粒产生旋转行为。14 本方法制备的颗粒在三维空间中表现出相对各向同性的运动；然而，若使用更厚的铂涂层或更大的颗粒，则可能引入向上的运动偏向或重力趋向性。11 制备完成后Janus胶体的储存条件也可能影响其游动速度。蒸镀后暴露出的高表面能洁净铂表面容易受到表面污染，例如来自碳氢化合物，尤其是硫醇类物质的吸附。15
此外，用于重新悬浮 Janus 胶体的溶液性质对于观察其自推进行为至关重要。过低的过氧化氢浓度会导致推进速度减慢，因为产生运动的分解反应速率随之降低。6 此外，盐浓度过低会显著降低推进速度。7
本文所制备胶体的一个关键特征是其具有中性浮力，这使其适用于三维追踪。通常情况下，关于游动装置的研究领域对三维效应关注较少，部分原因是某些典型示例由高密度金属制成，导致其迅速沉降16，此外也由于进行相关测量所涉及的技术难度和高昂成本。对于这些快速运动的胶体而言，一些已建立的三维追踪方法存在明显缺陷，例如共聚焦扫描激光显微镜可能因时间分辨率不足，无法采集足够数量的图像以准确解析运动轨迹。在此背景下，本文所提出的方法具有显著优势：仅需单帧图像即可估算z坐标，从而实现高帧率成像。此外，由于z坐标的重建仅依赖于单帧图像中失焦胶体的相对对比度，而非荧光信号的绝对强度，因此该方法对荧光染料的猝灭和闪烁效应具有较强的抗干扰能力。这些优势的实现需以牺牲三维轨迹重建的有效景深为代价，且要求胶体之间充分分离、不发生重叠。我们希望，通过详细描述该实验方案，能使其他对游动装置三维行为感兴趣的研究团队能够便捷、高精度地获取相关信息。显然，将对这些装置的理解拓展至三维空间，将有助于揭示一系列富有意义的新现象并推动未来应用的发展。对于轨迹分析更详细内容感兴趣的读者，可参考文献17，该文献阐述了推进系统中常见的伪影问题以及如何准确量化推进速度的方法。

催化泳动装置是一类能够在流体环境中自主产生运动的微小尺度无系留胶体。1,2 这类装置正受到广泛的研究关注，因其有望实现多种新颖功能，例如药物递送3、芯片实验室中的物质运输4以及环境修复5。其中被广泛研究的一类典型实例是催化&#34;Janus&#34;泳动体。6 这些粒子因其具有两个截然不同的侧面（或称“面”）而得名（Janus 是罗马神话中具有两张面孔的神祇）。其中一侧具有催化活性，能够催化分解反应，而另一侧则为惰性。在存在合适溶解燃料分子的条件下，这种不对称的化学反应会在胶体周围形成浓度梯度，从而通过自扩散泳/电泳效应驱动其运动。7
表征这些快速移动物体的运动具有挑战性，迄今为止许多实验观测仅限于二维（2D）。然而，未来的应用很可能会利用催化泳动装置在三维（3D）体相溶液中运动的能力。8 为解决这一问题，本文介绍了一种可准确测定泳动装置三维轨迹的实验方案。该方法基于对使用固定焦平面物镜观察时，离焦荧光胶体所产生的环状结构进行解析，9 并且可在常规未经改装的显微镜上简便实施。本文对该方法进行了清晰阐述，使本领域的其他研究人员能够获取此类三维信息，从而有助于深入理解泳动装置的运动特性。近期已有研究报道了泳动装置受重力引导的运动行为，10,11 这一现象通过三维追踪技术得以直观呈现，11 充分体现了该方法的应用潜力。
本文还清楚地记录了一种制造催化型Janus粒子游泳器件的方法，这将进一步有助于统一现有研究这些器件的科研团队所采用的方法，同时为有意制备和研究游泳器件的新研究人员提供指导。

<table><tbody><tr><td>蒸发仪</td><td>Moorfield (UK)</td><td></td><td>Minilab 80 e-beam evaporator</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>Eclipse LV100</td></tr><tr><td>荧光光源</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon B2A filter cube</td></tr><tr><td>物镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>20X, 0.45 NA</td></tr><tr><td>比色皿</td><td>Hellma</td><td></td><td>fused quartz, 40 x 10 x 1 mm</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>IKA</td><td></td><td>Lab Dancer S2</td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>Laurell Technologies Corp.</td><td></td><td>Model WS-400BZ-6NPP/Lite</td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>Eumax</td><td></td><td>2 liter</td></tr><tr><td>镜头纸</td><td>Whatman</td><td>2105 841</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31642-1L</td><td>30 wt%</td></tr><tr><td>铂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>267171</td><td>0.25 mm, 99.99%</td></tr><tr><td>胶体</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Fluoro-Max PS microspheres, d = 1.9&amp;nbsp;microns</td></tr><tr><td>玻璃去污液</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/0025/15</td><td>Decon 90</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0600DF/17</td><td>Absolute Ethanol</td></tr><tr><td>去离子水</td><td>Elga</td><td></td><td>Purelab Option filtration system (15 MW)</td></tr><tr><td>结冷胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169-100G</td><td>&quot;Phytagel&quot;</td></tr></tbody></table>

催化泳动装置的制备与三维追踪

Preparation and 3D Tracking of Catalytic Swimming Devices

我们报道了一种制备具有催化活性的Janus胶体的方法，该胶体可在流体中“游动”，并描述了如何利用荧光显微镜测定其三维运动。目前常用于实现催化活性胶体增强运动的方法之一是通过非对称分布的催化剂。本研究中，该结构通过旋涂法将分散的荧光聚合物胶体层沉积在平坦的平面基底上，随后采用定向铂蒸镀法对暴露的胶体表面进行半面覆盖，从而形成具有两面结构的“Janus”颗粒。随后将Janus胶体从平面基底上重新悬浮至含有过氧化氢的水溶液中。过氧化氢作为铂催化剂的燃料，在胶体的一侧被分解为水和氧气，而另一侧则无此反应。这种不对称性导致了梯度的形成，从而产生增强的运动，即“游动”。使用荧光显微镜配合摄像机记录单个胶体的运动。通过图像分析确定荧光发射的中心位置，从而获得视频每一帧中胶体的x和y坐标。在保持显微镜焦平面位置固定的情况下，胶体发出的荧光呈现出特征性的同心环图案，通过图像分析该图案可确定粒子相对的z轴位置。由此获得游动胶体的三维轨迹，从而精确测量其游动速度，并检测可能影响胶体运动方向的物理现象，如趋地性（gravitaxis）。

图1展示了在沉积铂之前，胶体在洁净玻璃载片上的典型分散状态。图2显示了一种典型的半铂包覆Janus微泳者在背散射扫描电子显微镜（SEM）下的图像，在该成像模式下，铂包覆区域呈现明亮的对比度，可见所需的半球形铂层结构清晰。图3展示了固定在结冷胶中的典型荧光Janus微泳者在最佳照明条件下的外观。微泳者呈现为一个对称的环状特征，该环的半径可用于确定胶体相对于焦平面位置的z轴坐标。图4展示了用于结合图像分析算法以精确定位胶体中心及其表观半径的径向亮度强度分布的代表性截面图。图5为利用固定胶体样品和经过校准的显微镜z轴平移台获得的校准曲线，用于关联胶体表观尺寸与离焦距离。该曲线拟合为一个三次函数，用于将表观半径转换为z坐标。最后，图6展示了一个典型荧光Janus颗粒微泳者的x、y、z三维运动轨迹。
<img alt="聚苯乙烯微球显微镜图像，显示颗粒分布和粒径分析。" src="/files/ftp_upload/54247/54247fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 直径为1.9 µm的聚苯乙烯微球的光学图像。 微球在铂沉积前分散于洁净的玻璃载玻片上。比例尺代表40 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54247/54247fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于结构分析和科学研究的球形纳米粒子的扫描电子显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/54247/54247fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 1.9 µm 直径聚苯乙烯微球的 SEM 背散射图像。 显示的是经铂沉积后的微球。比例尺为 2 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54247/54247fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="静态平衡，微米尺度下粒子分布显微图像，实验数据。" src="/files/ftp_upload/54247/54247fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 使用20倍物镜（0.4 数值孔径）记录的固定在结冷胶中的直径为4.8 µm的荧光聚苯乙烯微球的校准图像。 每幅图像下方的距离表示物镜焦平面相对于微球上方的高度。当焦平面从0 µm逐渐离焦至200 µm时，原本清晰聚焦的亮圆盘图像逐渐转变为一个亮环，其半径大小取决于放大倍数、微球尺寸以及其与焦平面之间的距离。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54247/54247fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="定位亮环中心并测量半径；数据拟合；强度与像素关系图分析。" src="/files/ftp_upload/54247/54247fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. x、y、z 粒子追踪流程。 通过一组自编算法，首先提取若干垂直和水平线，找出亮环亮区峰值之间的平均中点，从而确定亮环的 (x, y) 中心位置（a）。随后，从亮环中心向外辐射方向上，对平均像素灰度值进行样条拟合，根据其峰值强度计算出环的半径（b）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54247/54247fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="半径与距离（像素）的多项式拟合图，方程为 Y=-7.05+0.68X+0.003X²-5.71X³。" src="/files/ftp_upload/54247/54247fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. 通过测量固定在结冷胶中的 Janus 微球亮环半径获得的 z 坐标校准图（见图 3 和图 4）。 该校准图供我们的算法使用，将测得的环半径转换为 z 坐标。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54247/54247fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示在XYZ轴上以微米为单位的路径的3D轨迹图，用于分析数据跟踪。" src="/files/ftp_upload/54247/54247fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6. 一种典型的荧光Janus微球泳动装置的运动轨迹。 在30秒的时间内以33 Hz的帧率记录了该泳动装置运动的一系列图像。通过定位亮环中心（图4 (a)），并将每幅图像中测得的环半径与校准图进行比对，从而获得轨迹的(x, y, z) 坐标（图4 (b) 和 图5）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54247/54247fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

介绍了一种制备具有催化活性的Janus胶体的方法，该胶体可在流体中“游动”并确定其三维运动轨迹。

我们报道了一种制备具有催化活性的Janus胶体的方法，该胶体可在流体中“游动”，并描述了如何利用荧光技术测定其三维运动……

本实验的总体目标是测量一种催化泳动装置的三维轨迹。该技术有助于解释泳动装置的多种现象，例如它们在伏特溶液中运动时如何响应化学梯度和重力场。该技术的一个关键优势在于，可使用任何常规的荧光显微镜进行应用。本技术将由我的博士生 Richard Archer 演示。对于本方案，请按照文中所述准备玻片。接着，制备用于沉积到玻片上的胶体分散液。首先，将10 µL质量分数为10%的水相荧光胶体溶液加入990 µL乙醇中，配制成总体积为1 mL、质量分数为0.1%的胶体悬浮液。然后，将混合液涡旋振荡10秒。接着，将该胶体分散液旋涂在已制备好的玻璃载片基底上。准备将100微升稀释后的胶体溶液加载到载玻片上。当转速达到2000 rpm后，逐渐将悬浮液滴加至载玻片中心。从开始滴加时计时，离心旋转30秒。将包被的玻片转移至光学显微镜下，确认玻片中央区域覆盖有均匀分散且大部分互不接触的独立胶体颗粒。随后，在金属蒸发仪中对玻片进行铂金属的真空蒸发镀膜。务必确保将玻片放置时使胶体面朝向蒸发源。使用铂金属蒸发源，在载玻片上沉积15纳米的铂。金属沉积完成后，将载玻片存放在惰性气氛中。至此，完成储备型Janus颗粒的制备。第一步是将 Janus 粒子悬浮在溶液中。为此，取一块一乘一厘米的镜头纸，用移液器吸取 10 µL 去离子水润湿其一端。然后用镊子夹住纸片，将润湿部分轻轻擦拭铂涂层胶体修饰玻璃片的表面。接下来，将镜头纸浸入含有1.5毫升去离子水的离心管中。盖紧管盖，手动振荡30秒。然后取出镜头纸，用移液器吸取1毫升已含有胶体的水溶液，加入另一含有1毫升30%（质量/体积）过氧化氢溶液的小离心管中。轻轻混匀溶液，然后将试管置于室温下的超声波清洗仪中。容器不应密封，以便氧气可能逸出。超声处理五分钟后，将混合物在室温下静置孵育25分钟，期间不进行任何搅拌。同时，取100微升剩余的水相胶体溶液进行干燥，并使用扫描电子显微镜对其进行表征，以验证Janus胶体结构。随后，向两毫升溶液中加入一毫升去离子水，使过氧化氢浓度降低至10%，该浓度可作为Janus胶体快速推进的适宜燃料浓度。然后，用制备好的溶液填充一个低体积的矩形石英玻璃比色皿，并松散地盖上推入式盖子，使溶液能够透气。接着，按照文本方案中的说明，将比色皿装入荧光显微镜中。在开始视频采集之前，快速调节显微镜焦距，使目标颗粒在焦平面下方呈现出以该颗粒为中心的同心环结构。在视频采集过程中不要移动焦平面。找到目标粒子后，以每秒30帧的速度录制30秒的视频。一次实验采集约20个视频即可为文本方案中所述的轨迹重建提供足够的细节。将胶体沉积在洁净的玻璃载玻片上。在沉积铂之前，使用光学显微镜观察载玻片表面的聚苯乙烯微球分散情况。比例尺为40微米。添加铂后，通过扫描电镜成像确认了所需的半球形铂层，比例尺为2 µm。当荧光Janus微泳体固定在结冷胶中并在最佳离焦条件下观察时，可清晰看到对称环状结构。通过环的半径来确定胶体的相对Z轴位置。通过提取一系列垂直和水平线，并计算亮峰之间中点的平均值，从而确定胶体的中心位置。随后，通过从环中心向外辐射的平均像素波形值拟合样条曲线，并根据其峰值强度计算环的半径。随后使用固定的胶体样品和经过校准的显微镜绘制校准曲线，以关联胶体表观尺寸与离焦位置之间的距离。由此，从数据中获得了荧光Janus粒子泳动器的三维轨迹。通过观看本实验，您现在应能够利用常规荧光显微镜对泳动微器件进行三维追踪。研究人员已使用该方法探索诸如重力趋向性等现象。本实验涉及使用过氧化氢，这是一种危险化学品，尤其当其与催化泳动装置结合时会释放大量氧气，因而特别危险。因此，在这些步骤中，容器不得完全密封。

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