研究肺泡巨噬细胞的作用乳腺癌转移

在这里，我们描述了研究肺泡巨噬细胞在癌症转移中功能的模型和方法。为了证明这些细胞在转移中的作用，使用了乳腺癌的同基因 （4T1） 模型与氯膦酸盐脂质体耗竭肺泡巨噬细胞。

这些实验的总体目标是使用乳腺癌的同基因模型确定肺泡巨噬细胞在癌症转移中的作用。这种方法可以回答肿瘤免疫学和癌症转移领域的一些关键问题，例如为什么肺是最常见的靶点之一是致病性癌症转移。这种方法的主要优点是它使用非常成熟的乳腺癌模型和非常特定的肺泡微噬细胞方法。

演示此程序的是我实验室的助理研究员 Surya Kumari Vadrevu。在肿瘤细胞注射当天，首先将剃光的麻醉小鼠放在手术垫上。接下来，将 100 微升 PBS 中的 10 次至第 5 个肿瘤细胞吸入配备有 29 号针头的零点 5 毫升胰岛素注射器中。

然后用拇指和食指提起第二个和第三个附近的皮肤，并将针头插入皮肤下的乳腺脂肪垫中，就在第三个下方。缓慢皮下注射细胞，在皮肤下形成气泡，并在监测下将动物放回笼子，直到完全恢复。接种后 4 到 5 天，为了测量肿瘤，触诊肿瘤部位并使用卡尺使用肿瘤的最大和最小直径来确定肿瘤体积。

为了对注射的 41GFP 细胞进行成像，将麻醉的小鼠放在成像仪内的可移动载物台上，并通过荧光显微镜对肿瘤部位进行成像。在层状气流生物安全柜中，肿瘤细胞注射后 6 天，涡旋脂质体以均匀分布颗粒，并将 60 微升悬浮液吸入无菌移液器吸头中。将尖端放在麻醉肿瘤接种动物的鼻孔附近，然后缓慢释放 5 微升脂质体溶液，让小鼠吸入滴剂。

缓慢施用脂质体溶液，同时保持适当的麻醉水平，让动物在分娩过程中有规律地呼吸，这一点至关重要。当 60 微升给药后，让小鼠完全恢复，然后将动物放回笼子里。为了对肺表面转移进行计数和评分，将肺置于解剖显微镜下并聚焦物镜，直到获得肺表面的清晰视图。

然后手动计数双肺前侧和后侧的 metasteses，并通过荧光显微镜对肿瘤进行成像。对转移灶进行计数和成像后，使用手术剪刀和镊子将肺切碎，并将组织块转移到含有 3 毫升消化缓冲液的 15 毫升锥形管中。在 37 摄氏度的培养箱中，在旋转摇床上对碎片进行染色测试 40 分钟，然后切割浆液以解离组织。

接下来，通过 40 微米过滤器过滤组织悬浮液以去除任何团块，必要时用注射器柱塞将较大的碎片压入过滤器。当获得单细胞悬液后，通过离心收集细胞，并在室温下用 ACK 缓冲液裂解红细胞 10 分钟。然后，在 8 毫升 RPMI 中洗涤沉淀两次。

第二次离心后，我们将细胞悬浮在 3 mL 完全 RPMI 培养基中进行计数，然后再次离心细胞。现在将细胞稀释至每 100 微升 FAX 缓冲液浓度的 1 倍 10 至第 6 个细胞，并将 100 微升细胞转移到 V 形底 96 孔板的各个孔中。通过离心收集孔底部的细胞，然后翻转板让缓冲液排出。

用 100 μL CD16 CD32 FC 封闭剂在 4 摄氏度下封闭细胞 15 分钟，然后再次离心板。然后翻转板以去除上清液，如刚才所示，并将感兴趣的抗体混合物添加到适当的孔中。在 4 摄氏度下放置 30 分钟后，通过离心沉淀细胞，然后用 200 μL FAX 缓冲液洗涤。

然后将沉淀重悬于 200 μL 新鲜 PBS 中，并在 4 摄氏度下用活性染料对样品染色 20 分钟。孵育结束时，用另外 200 微升 PBS 洗涤细胞，并将样品固定在 100 微升 1% 多聚甲醛中，以便在 4 摄氏度下储存。在分析之前，立即将细胞悬液转移到 Polypropelene 流式细胞仪管中。

将 4T1GFP 肿瘤细胞注射到乳腺脂肪垫中导致小鼠肿瘤的形成，这些肿瘤概括了人类乳腺癌的转移扩散，在肺内观察到的快速形成的转移证明了这一点。用 GFP 稳定转染 4T1 细胞有助于追踪转移性肿瘤细胞和定量转移负荷。常规 hastology 与数字病理学算法相结合，也为量化和验证转移提供了很好的工具。

此外，多色流式细胞计量分析甚至可以表征稀有细胞群，例如 CD11b 阴性、CD11c F80 阳性肺泡巨噬细胞。其 biclotrenate 的消耗可以通过溶血酶体处理的动物的解离肺中不存在这些 CD11c F480 阳性细胞来确认。看完这个视频，你应该对如何将肿瘤细胞注射到乳腺脂肪垫中，监测肿瘤生长和转移，并消耗肺泡巨噬细胞，并准备肺细胞进行流式细胞计量分析有了很好的了解。