螺旋神经节神经元外植体培养及电多电极阵列

该程序的总体目标是演示如何在多电极阵列上培养和记录听觉神经元的电生理活动。这种方法可以帮助回答听力研究领域的关键问题，例如表征听觉神经元的电生理特性和电极区域的刺激。该技术的主要优点是它允许细胞外非侵入性同时记录大量听觉神经元的神经元活动。

这种技术的影响延伸到治疗。事实上，它们可用于实现人工耳蜗等假肢的神经电接口，以恢复聋人的听力。要开始此程序，请先在冰上解冻 ECM 混合物，以制备 ECM 涂层溶液。

然后在基本培养基中以 1 比 10 的比例稀释 ECM 混合物，并将其储存在冰上。对于层流罩中的新 MEA，将其浸入 70% 乙醇中 30 秒。随后，用蒸馏水清洗 30 秒。

然后让 MEA 干燥 30 分钟。要涂覆 MEA，请用 200 μL 冷移液器吸头将 50 μL 包被溶液移液到 MEA 上。然后让 MEA 在室温下放置 30 分钟到 1 小时。

之后，去除涂层溶液。加入 100 微升补充有 10% FBS 和每毫升 5 纳克 BDNF 的培养基，并将其置于室温下直至铺板组织。接下来，将含有涂层 MEA 的培养皿放入一个大培养皿中，并加入一个含有 PBS 的小培养皿进行加湿。

在此过程中，用 70% 乙醇对幼犬的头部进行消毒。然后沿矢状线切断皮肤和颅骨之间的连接。接下来，矢状切开头骨并取出大脑。

之后，从颅骨上切下颞骨，并将它们放入含有无菌冰冷 HBSS 的培养皿中。在解剖显微镜下，使用一对细镊子解剖鼓膜大疱并隔离内耳。然后，去除耳蜗的骨头。

接下来，用镊子握住螺旋神经节的基底部分和 SV，然后从基部到顶点慢慢松开 SV，将螺旋韧带和 SV 一起去除。通过用镊子握住螺旋神经节的基部和 Corti 器官，并从基部到顶点缓慢展开 Corti 器官，将 Corti 器官与 modiolus 中的螺旋神经节分开。然后，使用镊子或精细的显微解剖剪刀或刀从螺旋神经节上切下侧向外植体。

现在将螺旋神经节外植体和 Corti 器官转移到 MEA 上。然后，将 SG 外植体放在电极区域和距离电极区域约 5 毫米的 Corti 器官上。将外植体和 Corti 器官放在 MEA 上，同时避免损伤组织。

然后，将 MEA 小心地放入培养箱中，并在 37 摄氏度和 5% CO 2 下培养。第二天，目视检查外植体是否附着在 MEA 上。然后，每天加入 100 微升含有 10% FBS 和 BDNF 的培养基，连续 5 天。

第 6 天，加入 2 毫升含有 10% FBS 和 5 ng/mL BDNF 的培养基，并将组织再培养 13 天。集体培养 18 天后，用早些时候在室温下制备的细胞外溶液洗涤 MEA 培养物。然后，用一张纸巾擦干 MEA 芯片的触点，并将 MEA 安装在 MEA 支架上。

最后，在录制设置上安装 MEA。之后，加入 300 微升细胞外溶液并等待 10 分钟，让系统稳定后再记录。现在，记录所有电极两分钟的自发活动并识别活性电极。

然后，确定对刺激有反应的电极。要排除刺激伪影，请从同一电极刺激 10 次。如果培养物在 10 次中至少有 8 次反应，则可以假设它在电极诱导刺激后为阳性反应。

为了识别背景噪音，将浓度为 1 微摩尔的 TTX 应用于培养物中，以阻断电压门控钠通道，然后记录 2 分钟。以下是 63 个电极中 6 个电极的原始记录轨迹，这些电极显示出自发活动，这是尖峰检测后 6 个电极的光栅图。每个条形代表一个动作电位。

此栅格图包括所有有源电极。从 63 个电极记录活动两分钟。该图表明，总持续时间为 80 微秒且振幅为 80 微安的双相刺激用于来自一个电极的培养刺激。

这个原始数据跟踪的代表性示例显示了动作电位，刺激后都没有反应。这是在实验结束时对神经元标志物 TUJ 进行免疫染色的 MEA 上的螺旋神经节培养物，以可视化电极区域的神经元覆盖。用于刺激的电极以绿色表示，响应电极以红色表示。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 50 分钟内完成。虽然这些方法可以深入了解螺旋神经节神经元电生理学，但它也可以应用于其他系统，例如大脑或脊髓培养。经过开发，该技术为材料科学和纳米技术领域的研究人员铺平了道路，神经元记录和刺激电极的快速印迹表面修饰。

观看本视频后，您应该对如何通过在多电极阵列上排列神经元外植体来培养和记录电生理活性有很好的了解。