视网膜神经节细胞定义子集的单细胞RNA-Seq

该程序的总体目标是从活的全支架视网膜中分离荧光标记的单细胞。这种方法可以帮助回答神经科学中的关键问题。例如，存在多少个特定神经元类的亚型，以及每种亚型的遗传标记是什么？

这种技术的主要优点是我们不需要视网膜组织解离，让细胞在分离之前能够在更健康的环境中存活。该技术的意义延伸到任何荧光标记的细胞群，因此可以应用于其他系统，以了解细胞多样性和在健康和疾病中的功能。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为这种技术依赖于研究人员在不影响细胞活力的情况下对细胞进行膜片钳的能力。

该方法的未来演示至关重要，因为 RNA 分离步骤可能难以学习，因为如果处理不当，少量 RNA 很容易降解。要开始此过程，请用针戳角膜并在角膜和巩膜的边界处将其切掉。然后，使用镊子取下晶状体。

轻轻地在巩膜上撕开并切断视网膜和巩膜交界处的视神经。小心地完成从视网膜上去除粘膜。接下来，去除透明玻璃体。

将视网膜切成两半，并在室温下将它们储存在含氧细胞外溶液中直至使用。当准备好将组织安装在记录室中时，将一块视网膜转移到酶溶液中，在培养皿中用 500 μL 含氧细胞外溶液稀释，并在室温下在摇床上孵育 2 分钟。随后，在含氧细胞外溶液中洗涤视网膜，并用塑料移液管将其转移到玻璃底记录室中。

之后，用镊子小心地将组织压平，感光层朝下。使用移液管去除多余的液体，并使用带有尼龙网的铂环固定组织。然后，用含氧细胞外溶液填充腔室并将其安装到显微镜载物台上。

以每分钟 2 至 4 毫升的含氧细胞外溶液灌注组织。为了准备此过程，使用微量移液器拉拔器脉冲一些玻璃微量移液器进行电生理记录。使用 IR-DIC 光学元件观察神经节细胞层。

然后，使用约 480 纳米的落射荧光鉴定 GFP 加神经节细胞。接下来，在 DIC 中找到装满细胞内溶液的移液器。在放大器上施加轻微的正压并将任何电压偏移归零。

随后，降低 GFP 正极电池上的玻璃微量移液器并应用测试电压命令步骤来监测密封电阻。负压应在移液器和细胞膜之间形成千兆级密封。形成稳定的密封后，通过施加短暂的负压脉冲来破坏膜，以获得整个细胞的通道。

等待 1 到 2 分钟，让细胞的树突充满荧光示踪剂。在此步骤中，用 10 毫升注射器施加负压，小心地将细胞质内容物提取到移液器中。同时，通过可视化细胞体大小的减小来监测 DIC 中的提取。

提取细胞质内容物后，小心地将移液管从组织中取出，然后迅速从溶液中取出移液管。接下来，从头部支架上快速取出移液器，并用 DEPC 处理的 H 2 O 短暂冲洗移液器吸头。然后，通过紧密配合的管道将移液器连接到 1 毫升注射器。

立即将细胞排出到 10 μL 裂解缓冲液中，1 μL 在 0.2 mL PCR 管中。在台式微型离心机中以 2000 次 g 的离心力短暂离心试管 10 秒。然后立即将样品在干冰上快速冷冻 5 分钟。

冷冻后，将它们存放在零下 80 摄氏度长达两周以获得最佳效果。为了准备此过程，通过将倒置的 P20 或 P200 尖端支架的顶部贴在 96 孔磁力架上来设置磁分离器装置。然后，制备新鲜的 70% 乙醇，每个样品约 1 毫升。

从 4°C 储存中取出 RNA 磁珠，并在室温下解冻。RNA 珠在室温下后，涡旋 30 秒，以确保溶液充分混合。之后，在室温下解冻细胞 1 分钟。

然后，向每个样品中加入 5 微升不含 Rnase 的 H 2 O 并上下移液。然后，向每管中加入 22 μL RNA 珠并充分混合。将样品在室温下孵育 5 分钟，让 RNA 与磁珠相互作用并结合。

之后，将试管放在磁选装置上 8 分钟。在继续之前，请确保上清液是透明的。从一个调色板观察珠子，并确保在移液过程中不要将其从试管侧面分离。

从样品中取出上清液，加入 150 微升 70% 乙醇。然后，去除乙醇并再重复洗涤两次。让样品风干 6 分钟。

间歇性检查，看看试管底部是否收集了更多的乙醇，并相应地将其取出。请记住，适当干燥珠子至关重要。如果磁珠不够干燥，乙醇可能会与洗脱液一起通过，从而降低总产量，而过度干燥的磁珠会导致 RNA 损失。

当样品干燥时，通过将 19 μL 裂解缓冲液 2 和 1 μL Rnase 抑制剂混合来制备 10x 反应缓冲液。短暂地将其旋转并保持在冰上。一旦样品干燥并且微珠沉淀不再有光泽，从磁性分离器中取出试管并添加 9.5 μL 不含 Rnase 的 H 2 O 以重新水化样品。

然后，将样品放在冰上，并向每个样品中加入 1 微升 10x 反应缓冲液。该图像显示了视网膜的神经节细胞层，在整个视网膜支架制备中使用 IR-DIC 进行可视化。在约 480 纳米的落射荧光中观察相同的制剂，以识别 GFP 阳性神经节细胞。

该图像显示了一个 GFP 阳性细胞，该细胞以膜片钳记录为目标，并填充了荧光示踪剂。在内丛状层的上和下亚层中成像的 ipRGC 树突的共聚焦图像允许对这些细胞类型进行分类该生物分析仪输出显示了经过逆转录、扩增和纯化的文库的示例。泳道 1 到 3 显示理想的 DNA 弥散条带，而泳道 4 代表处理不良的样品。

对照泳道应包含两个分子量为 35 bp 和 10380 bp 的干净峰。这是一个成功制备的文库的详细轨迹，强度约为 2 kb。该轨迹也表明制备成功，但弥散条带集中在 500 bp 左右。

该图显示了样品片段化、扩增和纯化后的生物分析仪输出。可以在此处看到成功标记样品的详细轨迹，对应于泳道 1 中的样品。不完全的标记将导致像这里看到的痕迹，需要用新的稀释重新标记。

观看此视频后，您应该对如何从完整视网膜中的荧光标记细胞类型中分离 RNA 有很好的了解。在尝试此过程时，重要的是要记住 RNA 对降解非常敏感，并且拥有健康的视网膜细胞是关键。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两天内完成。

按照此程序，可以执行其他方法，如 qPCR、NC2 杂交或免疫组织化学，以回答其他问题，例如已鉴定的基因是否对给定的细胞亚型具有特异性。这项技术为神经科学领域的研究人员铺平了道路，他们试图了解各个大脑区域神经元的异质性。了解这种异质性将有助于未来研究分子鉴定群体中的细胞功能和连接性。