猪胫骨移植术后血管生成的动物模型

目前, 任何一种带血管的复合异体移植都依赖于长期免疫抑制, 难以支持非致命的适应症。我们提出了一个新的猪胫骨 VCA 模型, 可用于研究骨 VCA 和示范使用的外科血管生成, 以维持骨骼的生存能力, 而无需长期免疫调节。

该项目的总体目标是建立一种新的大型动物模型，用于使用血管化复合胫骨同种异体移植研究节段性骨丢失和重建。每年，美国进行大约 3， 000 例保肢手术，以重建由肿瘤、感染、先天性异常或创伤引起的节段性骨缺损。目前的重建选择与显著的活动度和高并发症发生率相关。

使用骨同种异体移植可能允许用大小和形状匹配的活骨替换切除的骨头。临床上很少进行骨同种异体移植，部分原因是需要长期免疫抑制以防止排斥反应和导致组织死亡。小动物模型展示了药物免疫抑制或耐受性诱导的替代方案。

与任何器官或肢体同种异体移植一样，血流是通过显微外科修复营养血管来维持的。在手术中，执行另一个独特的步骤，将受体来源的血管供应放置在移植段的髓管内。随着免疫抑制治疗在 2 周后停止，由此产生的新血管生成血液供应迅速发展。

在临床使用之前，谨慎的做法是在大型动物模型中进一步研究骨同种异体移植，如本视频所述。在两支团队的方法中，一对两只主要的 SLA 不匹配的尤卡坦迷你猪同时运行，每头猪作为受体和捐赠者。首先，从每头猪的右胫骨收获的胫骨段

在这个过程中，每头猪都会产生一个节段性胫骨缺损。以交叉移植方式，在两只尤卡坦迷你猪之间交换胫骨节段，以重建每个胫骨缺损。在放置同种异体胫骨段和产生的胫骨缺损后，来自下后肢的受体来源的动脉静脉束被植入同种异体胫骨段，以促进受体来源的新血管生成循环在骨段内。

为了完成同种异体移植的血管化，将同种异体胫骨段的营养蒂与受体下后肢的肌肉分支进行显微外科吻合术。骨固定是通过锁定加压板实现的。在接下来的两周内，进行短期免疫抑制以维持同种异体营养蒂的通畅，直到建立从植入的动脉静脉束开始的新的受体来源的循环。

手术前一天禁食尤卡坦迷你猪并称重用于对照药物给药。镇静后，在耳静脉中放置用于静脉注射药物和液体的外周导管，并给予镇痛药和预防性抗生素。接下来，将迷你猪仰卧在加热垫上。

剃掉右后肢，洗腿 3 次。以无菌方式准备和覆盖。使用抗菌切口铺巾封闭所有伤口。

监测血压、脉搏率、体温和呼吸频率。用记号笔画一条切口线，从膝关节上方开始，沿着胫骨前嵴到胫距关节做一个前外侧切口。解剖皮肤和皮下组织，将胫骨与前隔室肌肉组织分开。

接下来，从胫骨前肌的起点释放一部分。使用摆动锯去除一部分胫骨脊以改善视野。确定颅胫动脉和静脉，以后用作动脉静脉束以促进新血管生成。

接下来，打开骨间膜并确定颅胫动脉的下降支，称为胫动脉尾动脉，它产生了胫骨干的营养蒂。现在非常小心地解剖颅动脉和尾胫动脉，并确定胫骨骨干的营养蒂。接下来，用微型夹固定椎弓根。

不要分离血管蒂。确定前肌隔室中的肌肉分支，稍后用于骨血管化同种异体移植的吻合术。接下来，开始收获胫骨段，包括血管蒂。

使用切割夹具确保预先确定大小且可重复的骨切除。将切割夹具固定在胫骨内侧表面。在夹具的引导下，在正好 3.5 厘米的距离内进行平行骨切割，以获得同种异体移植和 3.5 厘米的缺损。

然后取下切割夹具。通过旋转胫骨段，可视化胫骨段的营养蒂。小心地分离营养蒂并释放胫骨片，在其表面留下一个薄的肌肉袖带，完成胫骨段的抬高，包括其血管蒂。

一旦移除，胫骨段现在就可以进行微血管转移了。接下来，将颅胫动脉静脉束向远端结扎，以转座到同种异体胫骨段。现在以交叉移植的方式在两头主要不匹配的迷你猪之间交换收获的胫骨段。

为了允许颅胫动脉静脉束通过，从胫骨近端接骨侧去除一个 V 形段，并在远端接骨侧钻一个孔。接下来，将受体动物的 AV 束引入同种异体移植中，以便随后发展新的血管生成循环。以端到端的方式将骨同种异体移植的营养蒂吻合到胫骨前室准备好的肌肉分支。

使用 9 孔 3.5 锁定板实现接骨术。进行筋膜和分层皮肤闭合。最后，在伤口上涂抹封闭性压缩敷料。

对于术后免疫抑制药物的给药和监测，将静脉导管放入颈外静脉。通过颈部的纵向前侧切口，露出静脉。通过隧道，从背面插入 Hickman 导管。

将导管放入颈静脉并用不可吸收的缝合线固定。此外，将导管固定在皮肤上并关闭颈部层。让猪恢复 60 分钟，然后密切监测直到完全恢复。

然后将迷你猪放回自己的围栏中，让其随意饮水和吃食物。对于术后镇痛，使用 Carprofen。此外，每天预防性使用抗生素，持续两周。

为了在 AV 束血管生成期间维持骨血管化同种异体移植通过营养蒂的血流，进行由他克莫司、吗替麦考酚酯和泼尼松龙组成的三联疗法，持续 14 天。根据目标血谷水平调整免疫抑制药物的每日剂量。逐渐减少泼尼松龙的初始剂量，直到获得维持剂量。

所述技术在 4 头 SLA 主要错配尤卡坦迷你猪中成功进行。所有迷你猪都存活到随访结束，并且走路没有一瘸一拐。血液样本分析显示，他克莫司和吗替麦考酚酯达到治疗谷水平。

这确保了足够的免疫抑制，以防止术后前两周因排斥反应而导致的营养血管损伤和血栓形成。此后，在同种异体骨同种异体移植中建立了新的受体来源的血液供应，消除了对骨同种异体循环的需求。使用 25 分评分系统来量化 VCA 掺入。

定期放射学评估显示，在研究期间，骨 PCA 进行性愈合。维持内固定，无复位或松动损失。我们开发了一种可靠且可重复的骨 VCA 大型动物模型，可用于测试手术血管生成联合短期免疫抑制。

该模型将作为未来研究血管生成、同种异体移植存活和免疫反应之间相互作用的基础。此外，它可用于描述骨 VCA 排斥的复杂过程和其他创新的免疫模块化策略。