Name: 通过细胞因子转导的基质细胞系注射外源性细胞因子在患者来源的异种移植物中的表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: 了解通过细胞因子转导的基质细胞系在患者来源的异种移植物中表达外源性细胞因子的方法。该技术无需构建昂贵的转基因小鼠品系，为癌症和造血研究提供灵活的临床前模型。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R21CA162259、NIH R01CA209829、NIH P20 MD006988、NIH 2R25 GM060507、Hyundai Hope on Wheels 学者希望基金、洛马林达大学医学院病理学与人体解剖学系、基础科学系以及健康差异与分子医学中心，以及洛马林达大学促进协作与转化研究基金（KJP）资助。本内容完全由作者负责，不代表NIH的官方观点。

研究严格按照洛马林达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及机构审查委员会（IRB）批准的方案，并依照所有联邦指南进行。
警告：应按照安全操作规程处理PDX和人源组织，以防止血液传播病原体的传染。
1. 细胞因子转导基质细胞的培养与扩增
注意：每次传代基质细胞时，收集培养上清液（1 mL等分试样），并于-80 °C保存，用于后续细胞因子水平的定量检测 通过 ELISA 检测
<ol>
	<li>按照材料表中的说明配制 R10 培养基和冻存液。</li>
	<li>生成10,11 或获取对照基质细胞（用空载体转导）和细胞因子产生型（TSLP+）基质细胞。6 在液氮（LN2) 直至使用。按所述方法解冻基质细胞12 并分别接种于含有5 mL R10培养基的T-25细胞培养瓶中。将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。2。这是解冻后的 &#34;传代 #1&#34;.</li>
	<li>一旦基质细胞达到汇合（24–48 小时），使用 1× 胰蛋白酶 EDTA（0.25%）进行消化传代，并重新接种至 T-150 培养瓶中。此步骤为冻存后操作 &#34;传代 #2&#34;.</li>
	<li>当T-150培养瓶中的基质细胞达到汇合状态（3-4天后），用胰蛋白酶消化进行传代。将所得细胞悬液用于实验需求。
	<ol>
		<li>细胞扩增至多个培养瓶
		<ol>
			<li>将收获的细胞分装至三个T-150培养瓶中，培养至细胞融合。若需进一步扩增间充质细胞，可重复此步骤。T-150培养瓶中典型的人类基质细胞（HS-27A）融合时细胞数量约为 ~5 x 106.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>细胞储存
		<ol>
			<li>将收集的细胞悬液转移至锥形管中，在500 × g下离心5分钟，弃去上清液，用冻存液重悬细胞。冷冻后于液氮中保存2 ~1.5 × 106 每瓶细胞数。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于小鼠腹腔内基质注射，进行至步骤 4.1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用于监测的ELISA检测 体外 转导基质细胞的细胞因子产生
<ol>
	<li>购买市售的ELISA检测试剂盒，用于检测目标细胞因子。</li>
	<li>解冻对照组和可产生细胞因子（TSLP+）的间质细胞上清液，这些上清液分别来自早期、中期和晚期传代时收获的间质细胞（图2）。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用ELISA试剂盒测定上清液样本中的TSLP浓度。13 汇总这些连续的数据，以监测细胞培养过程中细胞因子产生的稳定性（图2A-B）。
	<ol>
		<li>识别并弃用细胞因子表达降低或未达到最佳水平的细胞因子产生型间质细胞，同时清除储存中相应的冻存管（图2A-B）。</li>
		<li>识别并保留能够稳定产生高水平细胞因子的细胞因子产生型间质细胞。将这些解冻后的细胞用于实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在细胞培养的整个过程中，定期使用ELISA试剂盒监测间质细胞（至少在解冻后早期、中期和晚期各检测一次），以确保细胞因子产生的稳定性，或在对照组间质细胞中确认无细胞因子产生。</li>
</ol>
3. 采用磷酸化流式细胞术检测间质细胞产生的细胞因子活性
注意：在首次实验前，应检测经基因工程改造的基质细胞上清液，以验证该基质细胞产生的细胞因子在特定实验中的相关生物活性6。一旦确认改造后的基质细胞符合要求，除非使用了新载体构建的基质细胞，否则无需再次进行检测。
<ol>
	<li>购买MUTZ5和/或MHH-CALL4白血病细胞系（TSLP响应性），14 重组人细胞因子，以及经批准可用于磷酸化流式细胞术检测适当下游磷酸化靶点的抗体。</li>
	<li>解冻来自对照组和表达细胞因子的基质细胞的收获上清液。</li>
	<li>将白血病细胞系接种于 R20 培养基中（参见 材料表) 在浓度为 0.2 x 106 每孔接种细胞至96孔组织培养板中，每种条件设3个复孔，以进行三复孔检测。在37 °C孵育2小时，此时间足以消除先前培养条件下可能发生的任何磷酸化修饰。 
	注意：每种细胞系设置12个孔，可为步骤3.4中所示的每种实验条件提供三份重复检测。</li>
	<li>培养2小时后，将每孔中的细胞转移至各自的4 mL离心管中，在4 °C下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。
	<ol>
		<li>将细胞分别重悬于以下每种实验条件的 200 µL 培养基中（每组实验设三个重复）：1）阴性对照——仅培养基；2）阳性对照——含饱和浓度重组细胞因子的培养基（TSLP 15 ng/mL） 等等。）、3）对照基质上清液（来自对照基质）、以及4）细胞因子基质上清液（来自产生细胞因子的基质）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据特定商业磷酸化检测试剂盒说明书指定的时间孵育细胞例如 30 分钟以检测 MUTZ5 或 MHH-CALL4 细胞中 TSLP 刺激后的磷酸化 STAT5。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>按照制造商方案进行磷酸化流式细胞术染色，并采集流式细胞术数据。15</li>
	<li>分析流式细胞术数据。15
	<ol>
		<li>根据前向散射光（FSC，指示细胞大小）和侧向散射光（SSC，指示细胞颗粒度）对完整细胞进行门控。</li>
		<li>测定每份样品中完整细胞的中位荧光强度（MFI）。将间质细胞上清液的三份重复测定所得的平均MFI，与阳性及阴性培养基对照组的MFI进行比较。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 将细胞因子转导的基质细胞注射入小鼠
注意：在将HS-27A基质细胞注射入小鼠前，需至少进行3次冻存后传代培养，以确保细胞状态健康并具备足够的细胞因子产生能力。
<ol>
	<li>基质细胞的制备
	<ol>
		<li>将收获的基质细胞悬液转移至锥形管中，取10 µL进行血细胞计数板计数；使用台盼蓝染色法获得活细胞数量。16 将剩余细胞悬液在500 × g条件下离心5分钟。</li>
		<li>吸除沉淀细胞的上清液，并用适量无菌磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔重悬细胞，用于小鼠注射（根据待注射小鼠数量确定体积）。 
		注意：小鼠注射常用的基质细胞浓度为每只小鼠200 µL PBS中含0.5 × 106–5 × 106个细胞。</li>
		<li>在注射前，将基质细胞悬液置于4 °C（或冰上）保存；注射前确保细胞悬液至少已恢复至室温（RT）（约25 °C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基质细胞注射
	<ol>
		<li>对生物安全柜进行消毒，准备注射所需材料，然后将小鼠笼放入柜内。</li>
		<li>在将200 µL细胞悬液吸入结核菌素注射器之前，轻轻颠倒混匀细胞悬液。</li>
		<li>采用标准的腹腔注射技术17，固定小鼠并将200 µL细胞悬液注入其腹腔内。具体操作细节此前已由Machholz et al.18演示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 小鼠外源性人细胞因子的系列血液采集与血浆监测
<ol>
	<li>血液采集 通过 尾部组织取样
	<ol>
		<li>对生物安全柜进行消毒，并组装小鼠固定器、剪刀及其他手术所需器械/物品。</li>
		<li>将小鼠放入固定器中，并固定管子以尽量减少小鼠移动。</li>
		<li>用异丙醇对尾部和手术剪进行消毒。在尾部涂抹局部麻醉药膏。</li>
		<li>使用非常锋利的手术剪剪去小鼠尾尖约0.5–1 mm。用肝素化毛细管收集约80 µL外周血。 
		注意：若采用此方法采血超过六次，断尾应保守操作，尽量减少断尾长度。随着断尾位置向尾部近端推进，尾部直径增大，出血速度加快，愈合时间延长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血浆分离
	<ol>
		<li>使用吸球将血液从毛细管中转移至已标记的K管中2EDTA 微量采血管；颠倒混匀 20 次以防止凝血。 
		注意：通常情况下，尾尖采血后的凝血速度较快。然而，若出血持续超过约2分钟，应使用止血笔或止血粉以促进凝固。</li>
		<li>根据制造商说明离心采血管，并将血浆分装保存于 -20 °C，直至进行 ELISA 检测。</li>
		<li>如果需要从小鼠血液中获取小鼠-人细胞嵌合数据，则按照步骤6.3.1所述处理剩余的沉淀；否则，弃去血细胞沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>适用于小体积小鼠血浆的改良型ELISA 
	注意：对制造商提供的ELISA操作步骤进行了修改，将推荐的100 µL样本体积调整为40 µL，以适应从小鼠采集的微量样本。无法执行 体内 小鼠血浆样本均设三个重复，且使用上述有限体积进行检测。实验结束时，通过心脏穿刺采集约 500 µL 死后血液。利用 100 µL 安乐死后血浆中的细胞因子浓度，对 40 µL 样本的检测结果进行验证 体内 每只小鼠的数据。
	<ol>
		<li>解冻冻存的小鼠血浆样本。</li>
		<li>将ELISA标准品进行系列稀释，每孔加入40 µL，每个浓度设三个复孔。</li>
		<li>向ELISA板中每孔加入40 µL小鼠血浆样品。 
		注意：如果小鼠样本体积小于 40 µL，则用 ELISA 缓冲液补足至 40 µL。记录所加入的稀释液体积，并据此计算每个稀释样本的稀释因子。在分析 ELISA 数据时，将稀释样本的浓度乘以其对应的稀释因子，以确定原始样本中的实际细胞因子浓度。</li>
		<li>根据制造商说明书完成ELISA检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 将造血细胞移植到小鼠体内
<ol>
	<li>亚致死剂量照射用于移植前骨髓预处理 
	注意：洛马林达大学（Loma Linda University, LLU）使用钴-60辐射源。将动物置于固定用的分隔式束缚器中，放置于辐射源下方80 cm处，照射野为20 cm × 20 cm，束缚器上方覆盖一层0.5 cm厚的Lexan材料。照射时间根据辐射源最近一次校准结果计算，以达到225 cGy的剂量（目前该辐射源所需时间为2–3分钟）。
	<ol>
		<li>亚致死剂量照射小鼠（免疫缺陷小鼠的全身照射剂量最高为225 cGy）。</li>
		<li>约24小时后移植造血细胞 通过 尾静脉注射</li>
	</ol>
	</li>
	<li>静脉内造血细胞移植
	<ol>
		<li>每只小鼠用 200 µL 无菌 PBS 制备人细胞悬液用于移植：CD34+ 造血干细胞（HSC）：1 × 105 至 5 × 105 每只小鼠的细胞数以及白血病细胞系/患者样本：1 × 106 至 5 × 106 每只小鼠的细胞数</li>
		<li>将细胞置于 4 °C（运输时需置于冰上）保存，直至移植前即刻。移植前应确保细胞温度至少已升至室温。</li>
		<li>对生物安全柜进行消毒，并准备移植注射所需的操作区域。</li>
		<li>将小鼠置于加温笼中至少5分钟，以使尾静脉扩张。</li>
		<li>轻轻混匀细胞悬液，用结核菌素注射器吸取200 µL。将针头安全放置于无菌环境中备用。</li>
		<li>将小鼠放入固定器中，并用异丙醇对尾部进行消毒。</li>
		<li>采用标准的静脉注射技术，17 将人细胞悬液注射至小鼠尾静脉。 
		注意：尾静脉注射可能需要多次尝试，尤其是对于初学者动物操作人员。参见Kovacscics和Raper在JoVE上的视频19 详细演示了该动物实验技术。</li>
		<li>监测小鼠恢复情况约 5 分钟。记录注射过程中出现的任何不良事件（例如 细胞溢出、严重出血、尾部过度损伤</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠外周血中人源细胞嵌合体的分析
	<ol>
		<li>获取血浆分离后（步骤 5.2.3）微量离心管中剩余的血细胞沉淀。</li>
		<li>对于红细胞（RBC）裂解，将剩余的血细胞沉淀用与去除血浆等体积的磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，并充分混匀（涡旋/移液）。</li>
		<li>将每份重悬的血液样本转移至已标记的4 mL离心管中，然后按1:9的比例加入红细胞裂解缓冲液（每100 µL重悬血液加入900 µL红细胞裂解缓冲液）。室温孵育5分钟。离心（500 × g，5分钟），弃上清。</li>
		<li>进行第二次红细胞裂解缓冲液孵育（室温下5分钟）。离心并倾倒上清，操作同前。</li>
		<li>用约 1 mL PBS 清洗剩余细胞。离心并弃上清，操作同前。</li>
		<li>将沉淀重悬于适量PBS中，PBS体积应符合标准流式细胞术染色的要求（具体体积根据试剂生产商和各实验室的实验方案而定）。20 使用经流式细胞术验证的免疫表型抗体鉴定小鼠细胞（小鼠 CD45+）和人类细胞（人类 CD45+）6,21 以及针对目标细胞谱系特异的其他人白细胞标志物。 
		注意：建议从每只小鼠样品中取少量体积（5 µL–20 µL）用于制备 &#34;混合样本&#34; 用于未染色、活率检测及同型对照样本。最佳实践要求每种实验条件下均设置未染色对照和同型对照。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 功能评估 在体实验 细胞因子活性
<ol>
	<li>小鼠安乐死与组织采集
	<ol>
		<li>处死小鼠 通过 CO2 在指定的实验时间点进行窒息处理。</li>
		<li>采集血液 通过 心脏穿刺并按照步骤 5.2.1-5.2.2 收集血浆 
		注意：应在采集其他组织之前先采集血液，因为血液在死亡后会立即开始凝固。</li>
		<li>处理小鼠血液，分装并按照步骤5.2.2保存血浆。
		<ol>
			<li>在后期评估安乐死时采集的血浆中外源性细胞因子浓度 通过 根据制造商说明书进行ELISA实验。评估并比较来自连续时间点的小鼠血浆中外源性细胞因子浓度 体内 血液采集及安乐死后血浆样本的获取（见第5.3节）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>向剩余的血样中加入 PBS 以补充血浆体积，并按照步骤 6.3.1 和 6.3.2 所述进行处理。立即进行流式细胞术检测，或用冻存液重悬细胞以用于液氮保存2 储存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从PDX小鼠中收获骨髓（BM）和脾脏，并按先前所述方法制备单细胞悬液。22</li>
	<li>使用3%乙酸与亚甲蓝（可裂解细胞膜和红细胞，保留活细胞完整细胞核）按1:1比例稀释，对每只PDX小鼠组织样本进行细胞计数，并用血细胞计数板计数。统计并制表记录每只动物骨髓和脾脏样本的总细胞数。</li>
	<li>离心（500 × g，15 分钟）细胞悬液，弃去上清液。立即进行骨髓和/或脾细胞的流式细胞术检测，或重悬于冻存液中用于液氮保存2 储存。 
	注意：每只小鼠冷冻保存10份骨髓样品（用于未来的生化检测）和约5份脾脏样品（用于未来的PDX移植）。</li>
	<li>免疫表型分析以鉴定 体内 功能效应
	<ol>
		<li>配制一种用于免疫表型分析的流式细胞术抗体主混合液（MM），以鉴定对目标细胞因子有响应的造血细胞群体，同时配制第二种同型对照抗体主混合液（MM）图5 以及材料表。</li>
		<li>解冻第7.4步制备的PDX组织等分试样（37 °C珠浴）。</li>
		<li>将解冻的细胞转移至锥形管中，加入至少3倍体积的PBS洗涤。离心（500 × g，5分钟），弃去上清液。</li>
		<li>重复洗涤步骤（7.5.3）。</li>
		<li>通过从每个PDX样本中取约10 µL–20 µL细胞，制备混合分装样本，用于未染色对照、活力对照及同型对照（参见步骤6.4.6的注释）。除未染色对照外，所有样本均使用可固定活力染料（死细胞标记物）进行染色，并按照试剂制造商的说明书进行孵育和洗涤。</li>
		<li>根据标准流式细胞术染色方案，使用表型鉴定用多色抗体组合（phenotyping-MM）对每份PDX细胞样品进行染色；同样，使用同型对照多色抗体组合（isotype-MM）对混合的同型对照样品进行染色。所有样品孵育后，用PBS洗涤，并重悬于1%多聚甲醛中固定。</li>
		<li>收集流式细胞术数据，并使用适用于目标细胞群体的设门策略分析数据（图5典型的设门方式如下：
		<ol>
			<li>通过绘制FSC和SSC门来定义完整细胞，以排除碎片。</li>
			<li>通过圈选对死细胞标记物呈阴性的细胞来鉴定活细胞群体（此为 &#34;总活细胞数&#34;).</li>
			<li>使用子门控 within the &#34;总活细胞数&#34; 以确定具有目标免疫表型的细胞群体（见图5）。</li>
			<li>从流式细胞术分析中获取各亚群细胞在总活细胞数中的频率。6,21 </li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过将每个组织中B细胞亚群占总活细胞的百分比（步骤7.5.6.4中获得）乘以该组织的总活细胞数（步骤7.3中获得），计算各组织中目标细胞的数量（% B细胞亚群 × &#34;血细胞计数板细胞计数&#34;；参见 表1)</li>
		<li>比较对照PDX小鼠与表达细胞因子（TSLP+）PDX小鼠中目标细胞群体的细胞计数，以确定 体内 外源性人细胞因子的功能效应（表1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. 
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<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Kovacsics, D., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+proteins+by+hydrodynamic+gene+delivery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种简单、快速且相对低成本的方法，用于构建表达外源性人源细胞因子的PDX模型。该策略基于每周腹腔注射经基因工程改造后表达人源细胞因子TSLP的基质细胞系。在实施本文所述方法之前，已预先构建了能够高水平表达目标细胞因子（TSLP）的工程化基质细胞，以及经类似改造的对照基质细胞。在本文提供的实验方案中，基质细胞在体外扩增，并检测其是否能够长期稳定地高水平分泌细胞因子（对照基质细胞则检测其无细胞因子分泌）。通过功能检测验证了基质细胞所分泌细胞因子的生物学活性，并制定了基质细胞注射的时间进程，以建立具有生理水平人源TSLP的PDX模型（以及不表达人源TSLP的对照小鼠模型）。文中还提供了监测小鼠血浆中人源TSLP水平并验证其功能的实验步骤 体内 对细胞因子应答细胞群体的功能效应进行了检测。
在选择本方案中所使用的基质细胞和载体时，应考虑多个因素。基质细胞系不应内源性地高水平产生细胞因子，也不应对所关注的细胞因子产生反应。本研究中选用人骨髓基质细胞系 HS-27A，因其在培养中生长 robust，且细胞因子产生水平较低。8</s...

患者来源的异种移植模型（PDX）是一种强大的体内模型，可用于在“天然”的哺乳动物环境中研究正常和恶性造血细胞的生成。通常通过将人类细胞注射或移植到免疫缺陷小鼠体内来建立PDX模型。利用正常人造血干细胞构建PDX模型，可实现对人类正常血液和免疫细胞发育的体内研究。而由白血病或其他癌细胞建立的PDX模型则使得研究人员能够在人类群体中存在的多种遗传背景和突变条件下，研究致癌机制并筛选有效的治疗方法。1 因此，PDX模型目前已成为转化生物医学研究中的金标准，用于识别有效疗法，同时也是理解癌症进展机制的重要工具。PDX模型对于研究由特定基因损伤引起的健康差异相关疾病，或任何患者遗传背景的变异可能显著影响肿瘤发生及治疗效果的疾病，均具有不可或缺的作用。
人鼠异种移植模型（PDX）之所以可行，是因为许多小鼠细胞因子在小鼠体内能够有效模拟其人类对应物，激活人类细胞的细胞因子受体。例如，白细胞介素-7（IL-7）为人类B细胞的发育提供了关键信号。2 在此情况下，小鼠 IL-7 与人类 IL-7 具有足够高的同源性，因此小鼠细胞因子可激活人类 B 细胞前体中的信号通路。2,3,4 然而，胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）的情况并非如此，5,6 包括其他细胞因子（IL-3、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、干细胞因子（SCF）），7 对正常和恶性人类造血细胞的生成具有重要意义。当小鼠和人类细胞因子同源性较低时，小鼠细胞因子无法激活人类细胞上的相应受体。为克服这一障碍，已采用多种策略在PDX小鼠中实现人类细胞因子的表达，包括注射重组人类细胞因子、DNA的水动力注射、慢病毒表达、转基因表达以及基因敲入替换。7 本报告描述了一种用于构建可产生人源细胞因子的PDX模型的方法 通过 基质介导的细胞因子递送（图1).
在本方法中，将PDX小鼠构建为表达人源细胞因子TSLP，或作为细胞因子阴性对照。表达TSLP的PDX小鼠通过每周腹腔注射经转导后高表达人TSLP的基质细胞来实现。细胞因子阴性的PDX“对照”小鼠以类似方式构建，但对照组基质细胞被转导携带空载体的对照病毒。该方法可在注射TSLP阳性基质细胞的PDX小鼠体内实现正常生理水平的人TSLP表达，而在接受细胞因子阴性基质细胞的小鼠中则无法检测到TSLP。我们选择人源基质细胞系HS-27A用于本研究，因其在培养中生长 robust，且细胞因子分泌水平极低，无法支持分离的前体细胞在共培养体系中的增殖。8 为实现人TSLP表达，基质细胞被转导一种源自先前报道骨架的新型自失活慢病毒载体，9 该载体包含cPPT/cts元件以及土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE），以增强外源基因的表达。人TSLP基因被构建至该载体中，并由延伸因子-1（EF-1）α启动子驱动，以实现强效、组成型且长期的表达。
人源细胞因子增强型PDX模型的构建包含四个主要步骤。第一步，扩增经转导的基质细胞 体外 并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）评估其稳定、高水平的细胞因子产生。其次，利用磷酸化流式细胞术验证经转导的基质细胞所产生的人源细胞因子的生物学活性，并确认对照基质细胞无细胞因子活性。已知对目标细胞因子（在此为TSLP）有反应的细胞系与基质细胞上清液共孵育，检测细胞因子诱导的磷酸化水平。第三，将经转导的人源基质细胞注射至小鼠体内，随后每周通过ELISA检测小鼠血浆中人源细胞因子的水平。第四，移植人源造血细胞，并对 体内 在已知靶标上评估人细胞因子的功能效应（例如细胞群体）
<img alt="人-小鼠白血病模型示意图；PDX构建、细胞因子监测、细胞收获流程" src="/files/ftp_upload/55384/55384fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：在小鼠体内可产生外源性人源细胞因子的PDX模型 (1A设计实验并获取转导的人类基质细胞（1B获取人细胞（造血干细胞、白血病细胞， 等等.) 以建立PDX（患者来源的异种移植）小鼠模型。2A) 注射工程化间质和（2B) 根据实验方案将人源细胞移植到免疫缺陷小鼠体内。3A-B通过ELISA检测基质上清液和小鼠血浆中的细胞因子浓度。4) 收集人源细胞并进行评估 体内 PDX 中存在的人源细胞因子的功能效应 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55384/55384fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
人细胞因子递送 通过 与在PDX小鼠中递送/产生人源细胞因子的其他方法相比，基质细胞具有优势和劣势。7 与重组人细胞因子注射相比，基质介导的递送通常成本更低（基质细胞培养的成本低于重组细胞因子的成本）且劳动强度更小（每周一次注射 versus 每周多次注射）。由于基质细胞可持续产生外源性细胞因子，细胞因子半衰期短的问题也得以缓解。细胞因子的递送 通过 DNA的水动力注射可能比其他递送方式成本更低 通过 基质。然而，这种方法同样具有短暂性，且可能比基质介导递送所需的简单每周腹腔注射需要更高的技术操作水平。在小鼠中使用慢病毒进行基因表达可能提供一种持续时间更长的细胞因子递送方法；但在我们的实验中，未能达到生理水平的TSLP表达。此外，该方法工作量大，需要持续制备慢病毒载体。转基因或基因敲入小鼠可实现细胞因子的稳定长期表达，并可设计为组织特异性表达，这是一大优势。然而，对于PDX小鼠模型所需的免疫缺陷小鼠背景上转入人类细胞因子基因的转基因模型，在模型价值尚未明确之前就需要投入大量资源。此外，转基因模型通常无法灵活调控细胞因子表达的启动时间或表达水平 体内 细胞因子产生。通过间质细胞介导的递送方式，仅需改变间质细胞注射的起始时间点或注射的间质细胞剂量即可实现上述调控。
本文详细描述的基质细胞介导的细胞因子递送方法已被用于构建PDX模型，以评估TSLP在正常人B细胞发育4,6以及高危B细胞急性淋巴细胞白血病中的作用6。该方法为使用除TSLP以外的其他人源细胞因子构建类似模型提供了替代性的细胞因子递送方式。此外，该模型还可用于生成初步数据，有助于判断构建细胞因子转基因或细胞因子敲入型PDX模型是否值得投入大量时间和经费。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;湿实验试剂&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-25 Nunc 细胞培养处理 EasYFlasks，容量 7 mL&amp;nbsp; 25 cm&amp;sup2; 培养区域</td><td>赛默飞世尔科技 / 费舍尔</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Falcon 细胞培养处理烧瓶，250 mL 容量，75 cm²&amp;sup2; 培养区域 &amp;和通气盖</td><td>康宁公司 / 费舍尔</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>T-150 Falcon 组织培养处理培养瓶，600 mL 容量，150 cm²&amp;sup2; 培养区域 &amp;和通气盖</td><td>康宁公司 / 费舍尔</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 mL&amp;nbsp; 聚丙烯锥形管</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 圆底聚苯乙烯管</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 聚丙烯锥形管</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 冻存管，外螺纹</td><td>康宁公司 / 费舍尔</td><td>4230659</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 移液器吸头</td><td>Fisher</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L型移液器吸头&amp;nbsp;</td><td>德文特科学公司</td><td>P3020-CPS</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L型移液器吸头</td><td>丹维尔科学</td><td>P-1096-CP</td><td></td></tr><tr><td>带SFCA膜的无菌一次性过滤装置，Nalgene Rapid-Flow</td><td>Fisher</td><td>09-740-28D</td><td></td></tr><tr><td>2 NH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>BioLegend</td><td>423001</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS），1&amp;times;</td><td>Corning cellgro / Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>人TSLP ELISA Max Deluxe试剂盒</td><td>BioLegend</td><td>434204</td><td></td></tr><tr><td>3%乙酸与亚甲蓝</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>25-900-Cl</td><td></td></tr><tr><td>&quot;胰蛋白酶&quot; 1x 0.25% 胰蛋白酶 2.21 mM EDTA（溶于HBSS中）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25-053</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7949</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;&amp;ldquo;R10&amp;rdquo; 细胞培养基，占总体积的百分比（配制565 mL）&lt;/strong&gt;</td><td>-</td><td>&lt;强&gt;-&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;实验方案&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>RPMI，88.5%（500 mL）&amp;nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>10-040-CV&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS，9.9%（56 mL）&amp;nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺，0.99%（5.6 mL）&amp;nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素，0.50%（2.8 mL）&amp;nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇，0.10%（560 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td><td>MP</td><td>190242</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;&amp;ldquo;R20&amp;rdquo; 细胞培养基，占总体积的百分比（配制195 mL）&lt;/strong&gt;</td><td>-</td><td>-</td><td>&lt;强&gt;实验方案配方&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; RPMI，76.84%（150&amp;nbsp; mL</td><td>见上文</td><td>见上文</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; FBS，20.49%（40 mL）</td><td>见上文</td><td>见上文</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 2 mM L-谷氨酰胺，1.02%（2 mL）</td><td>见上文</td><td>见上文</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1 mM Na-丙酮酸盐，1.02%（2 mL）</td><td>见上文</td><td>见上文</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 青霉素-链霉素&amp;nbsp; 0.51%（1 mL）</td><td>见上文</td><td>见上文</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 2-巯基乙醇，0.10%（0.1 M）&amp;nbsp; 0.10% (200 &amp;micro;L</td><td>见上文</td><td>见上文</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;&amp;ldquo;冻存液&amp;rdquo;，占总体积的百分比&lt;/strong&gt;</td><td>-</td><td>&lt;强&gt;-&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;实验方案&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&amp;ldquo;R10&amp;rdquo; 培养基，45%</td><td>见 &quot;R10&quot; 配方</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FBS，20%</td><td>见上文</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO，10%</td><td>康宁</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>D(-)(+)-海藻糖二水合物，5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2687-100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;生物制剂&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&quot;HS-27&quot; HS-27A 人源间质细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-2496</td><td></td></tr><tr><td>&quot;CALL-4&quot; MHH-CALL-4细胞系，人B细胞前体白血病</td><td>DSMZ</td><td>ACC 337</td><td></td></tr><tr><td>&amp;ldquo;NSG小鼠&amp;rdquo; NOD.Cg-Prkdc&lt;sup&gt;scid&lt;/sup&gt; Il2rg&lt;sup&gt;tm1Wjl&lt;/sup&gt;/SzJ，雄性或雌性，6周龄 &amp;ndash; 8 周</td><td>杰克森实验室小鼠&amp;nbsp;</td><td># 005557</td><td></td></tr><tr><td>MUTZ-5细胞系，人类B细胞前体白血病</td><td>DSMZ</td><td>ACC 490</td><td></td></tr><tr><td>重组人TSLP蛋白</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1398-TS-010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;流式细胞术抗体（克隆）*&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45 FITC（30F11）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-778</td><td></td></tr><tr><td>CD127 PE（MB15-18C9）（别名为 IL-7R）&amp;alpha;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-094</td><td></td></tr><tr><td>CD34 APC（8G12）</td><td>BD 生物科学</td><td>340667</td><td></td></tr><tr><td>CD45 PE-Cy7&amp;nbsp; (HI30)</td><td>eBioscience</td><td>25-0459</td><td></td></tr><tr><td>&quot;FVD&quot; 可固定的活力染料&amp;nbsp; eFluor 780&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865</td><td></td></tr><tr><td>Ig &amp;kappa; 轻链 FITC&amp;nbsp; (G20-193)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555791</td><td></td></tr><tr><td>Ig &amp;lambda; 轻链FITC（JDC-12）</td><td>BD Pharmingen</td><td>561379</td><td></td></tr><tr><td>IgD PE（IA6-2）</td><td>BioLegend</td><td>348203</td><td></td></tr><tr><td>IgM PE-Cy5（G20-127）</td><td>BD 生物科学</td><td>551079</td><td></td></tr><tr><td>pSTAT5 PE，&amp;nbsp; 小鼠抗-STAT5（pY694）</td><td>BD PhosphoFlow</td><td>612567</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;其他材料 &amp;和设备&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带套管的动物可植入式纳米应答器</td><td>Trovan&amp;nbsp;</td><td>ID-100B(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>EMLA 利多卡因麻醉乳膏（通过动物护理机构凭处方获取）</td><td>处方</td><td>处方</td><td></td></tr><tr><td>BD &amp;frac12; cc 低剂量U-100胰岛素注射器 28G&amp;frac12;&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>#329461</td><td></td></tr><tr><td>含 K 的 BD Microtainer 管&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>#365974</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>贝克曼库尔特</td><td>Alegra X-15R&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand 毛细管（肝素化）</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>小鼠Pie笼</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MPC-1</td><td></td></tr><tr><td>小鼠尾部照明固定器</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MTI STD</td><td></td></tr><tr><td>手枪式植入器</td><td>Trovan&amp;nbsp;</td><td>IM-300(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;定量&amp;nbsp;</td><td>Bio-Tek Instruments Inc.</td><td>MQX200</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 流式细胞术分析软件</td><td>FlowJo, LLC</td><td>版本 10</td><td></td></tr><tr><td>*所有抗体均为抗人源，除非另有说明。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过注射经细胞因子转导的基质细胞系在患者来源的异种移植瘤中表达外源性细胞因子

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

由患者来源的异种移植（PDX）小鼠是通过将人类细胞移植到免疫缺陷小鼠体内而建立的模型。这类模型是研究正常与恶性造血机制的重要工具，也是筛选多种恶性肿瘤有效化疗药物的金标准。PDX模型得以实现的原因在于，许多小鼠的细胞因子同样可作用于人类细胞。然而，并非所有细胞因子都具有这种跨物种活性，其中包括一些对研究人类细胞正常与恶性造血至关重要的细胞因子。构建可表达人类细胞因子的转基因或基因敲入小鼠模型虽可行，但需投入大量经费，且在验证其有效性之前成本较高。其他方法则劳动密集，例如注射重组细胞因子或慢病毒，某些情况下还需较高的技术门槛（如DNA的水动力注射）。本报告介绍一种简便的方法，用于构建表达外源性人类细胞因子（TSLP，胸腺基质淋巴细胞生成素）的PDX小鼠模型。 通过 每周一次腹腔注射经转导后过表达该细胞因子的基质细胞。该方法的使用可提供一种 体内 持续产生细胞因子的来源，可在小鼠体内实现循环人源细胞因子的生理水平。通过调整注射的基质细胞数量，可调节人源细胞因子的血浆浓度，并可在实验的任意时间点启动细胞因子的产生。该方法还包括细胞因子阴性对照小鼠，其制备方式相似，但通过腹腔注射经对照载体转导的基质细胞实现。我们先前已证明，与对照PDX来源的白血病细胞相比，来自表达TSLP的PDX的白血病细胞表现出更接近原始患者样本的基因表达模式。综上，通过该方法产生的细胞因子阳性与阴性PDX小鼠共同构成一个模型系统，已被我们成功用于研究TSLP在正常与恶性造血中的作用。

该模型的概述见图1。在获得可产生细胞因子的基质细胞（TSLP+基质）和对照基质细胞后，需在体外进行扩增培养。在将基质细胞注射入小鼠体内之前，需通过ELISA检测基质细胞上清液，以确认细胞因子的产生（图2），并采用磷酸化流式细胞术（方案#3）验证基质细胞所产生细胞因子的活性。当基质细胞传代时，从融合生长的基质细胞培养物（对照基质和TSLP+基质）中收集上清液。在早期、中期和晚期传代过程中，至少各进行一次ELISA检测，以监测上清液中TSLP的浓度。对照基质细胞的代表性数据见图2A。若对照基质细胞培养物中检测到TSLP表达（及其冻存的细胞管），应予以弃用。TSLP表达不可检出的对照培养物则进行扩增并冻存，以备后续实验使用。如图2B所示，TSLP+基质细胞培养物中若TSLP产量较低（及其冻存的细胞管），也应予以弃用。选择TSLP产量稳定且高水平的TSLP+基质细胞进行扩增和冻存，用于后续实验。对照基质和TSLP+基质多个培养物上清液中TSLP的...

本文介绍了一种通过每周腹腔注射经细胞因子转导的基质细胞系，在患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型中产生外源性细胞因子的方法。该方法拓展了PDX模型的应用范围，并为在多种PDX模型中实现外源性细胞因子的瞬时或持续递送提供了选择。

通过将人类细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，可制备患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型。这些模型是研究……的重要工具。

本实验的总体目标是制备携带循环人源细胞因子的小鼠异种移植模型。该方法有助于回答癌症与造血研究领域中的关键问题，例如：特定细胞因子在正常及恶性淋巴细胞发育过程中发挥何种作用？该技术的主要优势在于，研究人员可根据实验需求，调控异种移植动物体内外源性细胞因子的循环浓度。这消除了构建新的昂贵转基因小鼠品系的需要。该技术将有助于癌症新疗法的研究，因为这种临床前模型可用于测试抗癌药物，类似于临床中所使用的方法。尽管该方法可为正常造血过程提供研究视角，也可用于研究白血病等特定疾病。我们最初在需要建立一个体内模型以评估TSLP细胞因子在正常和恶性人B细胞生成中的作用时，提出了这一设想。首先，将新近解冻的对照空载体转导的基质细胞以每瓶5毫升R-10培养基接种于单独的T25培养瓶中，用于细胞因子的产生。随后，在37摄氏度、5% CO2条件下培养24至48小时。当基质细胞长至融合时，用含EDTA的胰蛋白酶消化并传代至T150培养瓶中，继续培养三至四天。当T150培养瓶中的基质细胞达到融合状态时，收集上清液，并于-80摄氏度保存，以备后续通过ELISA检测其细胞因子分泌水平。随后，将每瓶T150培养物传代至三个新的T150培养瓶中，继续培养至细胞融合。在完成适当次数的传代后，为保存细胞，将收获的细胞悬液转移至锥形管中进行离心，并将细胞沉淀重悬于冻存液中。然后将含有1.5×10⁶个细胞的分装液转移至长期保存管中，置于液氮中储存。为验证由基因工程基质细胞产生的上清液效果，将从表达细胞因子的基质细胞中收获并冻存的上清液样本解冻，并在96孔组织培养板中，以每孔2×10⁵个细胞的浓度，每种条件接种三孔白血病细胞系，培养基为Au-20培养基。将细胞在37摄氏度下孵育两小时，以消除其先前培养中的磷酸化。随后将每个孔中的细胞转移至各自的4毫升离心管中，并通过离心收集细胞。根据每种实验条件，用600微升缓冲液重悬细胞沉淀。每种条件设三个复孔，每孔接种 200 微升细胞。根据特定的商用磷酸化检测试剂盒说明，孵育适当时间。孵育结束后，通过离心收集细胞。根据生产商说明书，通过磷酸化流式细胞术染色对细胞进行标记。然后采用标准流式细胞分析方案进行流式细胞术分析，以验证基质上清液中的细胞因子是否使白血病细胞发生磷酸化。在解冻后至少传代三次后，将收集的基质细胞悬液转移至各自的锥形管中进行计数。通过离心沉淀细胞，并用适当体积的无菌 PBS 重悬细胞以用于注射。在注射前，将细胞置于 4 摄氏度保存，注射前立即将细胞悬液升温至至少室温。当细胞准备就绪后，轻轻颠倒混匀第一个样品，并用结核菌素注射器吸取 200 µL 细胞悬液。然后固定第一只动物，采用标准的腹腔注射技术将细胞注入腹腔。为采集外周血样本，首先将小鼠轻轻放入已消毒的小动物固定器中，并固定管子以尽量减少动物的活动。接着，用新鲜的异丙醇擦拭尾部，随后涂抹局部麻醉霜

expression-exogenous-cytokine-patient-derived-xenografts-via

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通过细胞因子转导的基质细胞系注射外源性细胞因子在患者来源的异种移植物中的表达

本文介绍了一种从荷瘤宿主的肿瘤引流淋巴结或其他继发性淋巴组织中高效扩增肿瘤反应性T细胞的ex...

ex vivo 扩增肿瘤反应性T细胞的方法：使用海兔毒素1/离子霉素及共同γ链细胞因子组合方案

小鼠骨髓移植是一种广泛使用的技术，用于研究调控人类移植物抗宿主病的免疫学机制。体内监测T细胞迁移模式的能力，使得能够对移植物抗宿主病过程中T细胞反应的发生与发展进行详细分析。...

移植物抗宿主病的诱导 在体 内 使用MHC匹配的小鼠模型监测T细胞

本文介绍了用于ex vivo T细胞刺激的技术，以提高T细胞内干扰素-γ（interferon-gamma或IFN-gamma）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis...

胰腺肿瘤中T细胞的离体刺激：一种提高T细胞细胞因子产生的方法

本视频展示了白血病细胞中由基质细胞因子诱导的蛋白质细胞内磷酸化的评估方法。这些细胞内磷酸化蛋白通过磷酸化流式细胞术进行定量。...

利用磷酸流式细胞术评估基质细胞因子诱导的细胞内蛋白磷酸化

本文介绍一种微创的同基因型小鼠肺腺癌细胞原位移植模型，该模型可节省时间和成本，用于研究非小细胞肺癌。...

同基因型肺癌腺癌细胞的原位移植用于研究PD-L1表达

本文介绍了一种在异种移植物抗宿主病（xenoGVHD）模型中诱导并评估疾病发生的方法。xenoGVHD...

异基因小鼠模型中移植物抗宿主病的诱导与评分及使用数字PCR定量小鼠组织中的人源T细胞

移植物抗宿主病是异基因骨髓移植后的主要并发症。树突状细胞在移植物抗宿主病的发病机制中起着关键作用。本文介绍了一种新型骨髓移植平台，用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病发生以及移植物抗白血病效应中的作用。...

用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病中作用的骨髓移植平台

本研究描述了一种从胚胎干细胞中分离富含携带免疫刺激性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的外泌体富集型细胞外囊泡的方法。...

从胚胎干细胞中分离富含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的外泌体富集型细胞外囊泡

本文介绍了一种从外周血单个核细胞中分离和扩增细胞因子诱导的CD3+CD56+杀伤细胞的实验方案，并利用体外诊断流式细胞术系统展示其对血液系统肿瘤和实体瘤细胞的细胞毒性作用。...

用于癌症治疗的细胞毒性细胞因子诱导杀伤性T细胞的分离与扩增

本方案描述了原位胰腺肿瘤的手术建立方法以及新鲜分离的小鼠胰腺肿瘤的快速消化过程。消化后，可获取具有活性的免疫细胞群体，用于后续分析，包括 离体...

原位胰腺肿瘤的构建与 离体 肿瘤浸润性T细胞毒性的表征

本方案描述了如何将人皮肤移植到非肥胖型糖尿病（NOD）-scid...

异种移植皮肤模型用于调控人类免疫反应 体内

了解通过细胞因子转导的基质细胞系在患者来源的异种移植物中表达外源性细胞因子的方法。该技术无需构建昂贵的转基因小鼠品系，为癌症和造血研究提供灵活的临床前模型。

通过注射经细胞因子转导的基质细胞系在患者来源的异种移植瘤中表达外源性细胞因子

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