通过细胞因子转导的基质细胞系注射外源性细胞因子在患者来源的异种移植物中的表达

该程序的总体目标是生产具有循环人类细胞因子的异种移植小鼠。这种方法可以帮助回答癌症和造血领域的关键问题，例如，特定细胞因子在正常和恶性淋巴细胞发育中的作用是什么？该技术的主要优点是研究人员可以根据实验的需要摄入异种移植动物体内外源细胞因子的循环浓度。

这消除了生产新的和昂贵的转基因小鼠品系的需要。这项技术将有助于研究新的癌症疗法，因为这种临床前模型可用于测试抗癌药物，类似于临床中使用的模型。虽然这种方法可以深入了解正常的造血功能，但它也可以用于研究特定疾病，例如白血病。

当我们需要一个体内模型来评估 TSLP 细胞因子在正常和恶性人类 B 细胞产生中的作用时，我首次提出了这个想法。首先，在单个 T25 培养瓶中，将产生细胞因子的细胞中的新鲜解冻的对照空载体转导基质接种在 5 mL R-10 培养基中。对于他们的培养，在 37 摄氏度和 5% 的 CO2 中放置 24 到 48 小时。

当基质汇合时，用 EDTA 中的胰蛋白酶分离细胞，在 T150 培养瓶中重新铺板 3 至 4 天。当基质在 T150 培养瓶中汇合时，收集上清液并在 80 摄氏度下冷冻，以便稍后通过 ELISA 评估其细胞因子的产生。然后，将每个 T150 培养瓶培养物传代到三个新的 T150 培养瓶中进行培养，直至汇合。

为了在适当的传代次数后储存细胞，将收获的细胞悬液转移到锥形管中进行离心，并将沉淀重悬于冷冻培养基中。然后将 1.5E6 细胞等分试样转移到长期储存管中，以储存在液氮中。为了验证由工程基质产生的上清液，解冻从表达细胞因子的基质中的对照中收获的上清液样品，并在 Au-20 培养基中以每孔 2E5 个细胞的浓度在 96 孔组织培养板中接种每个条件的三个孔中的白血病细胞系。

将细胞在 37 摄氏度下孵育 2 小时，以使其先前培养的磷酸化丢失。然后将细胞从每个孔转移到单独的 4 毫升试管中，并通过离心收集细胞。在每个实验条件下以 600 μL 重悬沉淀。

每种条件，每孔接种 200 μL 细胞，一式三份。根据特定的商业磷酸化测定将细胞孵育适当的时间。在孵育结束时，通过离心使细胞沉淀。

根据制造商的方案，通过磷酸流式细胞术染色标记细胞。然后使用标准流式细胞术分析方案通过流式细胞术分析细胞，以验证基质上清液中的细胞因子磷酸化白血病细胞。解冻后至少三次传代后，将收获的基质细胞悬液转移到单独的锥形管中进行计数。

通过离心沉淀细胞，并轻轻地将它们重悬于适当体积的无菌 PBS 中用于注射。将细胞保持在 4 摄氏度，直到注射前，此时应将悬浮液加热至至少室温。当细胞准备好时，通过倒置轻轻混合第一个样品，并将 200 微升细胞吸入结核菌素注射器中。

然后抑制第一只动物并使用标准腹膜内注射技术将细胞注射到腹膜腔中。要收集外周血样本，首先将鼠标轻轻地放在消毒过的小动物约束装置中，并固定管子以尽量减少动物的运动。接下来，用新鲜的异丙醇擦洗尾巴，然后涂抹局部麻醉霜。

使用非常锋利的手术剪刀，从尾巴尖端剪下约 5 到 1 毫米，并将大约 80 微升外周血收集到肝素化毛细管中。使用球形注射器将血液样本转移到标记的 EDTA 钾微量管中，并将管倒置 20 次以防止凝固。按照制造商的说明离心采血管后，小心收集血浆层并将等分试样储存在 20 摄氏度，并将血浆分装在 20 摄氏度储存。

在 ELISA 当天，解冻冷冻小鼠血浆样品，并将 ELISA 标准品连续稀释成 120 μL 体积。现在，将 40 μL 每种标准品一式三份接种到 ELISA 板的相应孔中，然后将 40 μL 的每种小鼠血浆样品添加到适当的孔中。然后根据制造商的说明完成 ELISA 分析。

照射小鼠 24 小时后，准备用于异种移植的人造血细胞。当您在无菌 PBS 中重悬造血细胞时，最好额外准备大约 15% 到 20% 的血液，以防在移植过程中溢出。将细胞保持在 4 摄氏度，直到移植，并将第一只受体动物转移到温暖的笼子中至少 5 分钟，以促进尾静脉扩张。

现在将细胞加热至室温。轻轻混合细胞悬液，并将 200 μL 吸入结核菌素注射器中。将鼠标放入限制器中，并用异丙醇对尾部进行消毒。

将细胞注射到侧尾静脉中。然后监测小鼠至少五分钟，以确认没有与移植相关的不良反应。注射对照基质的患者来源的异种移植物或 PDX 动物始终显示小鼠血浆中人胸腺基质淋巴细胞生成素 （TSLP） 水平低于 ELISA 检测阈值。

注射 TSLP 转导基质的 PDX 小鼠中人 TSLP 的血浆水平与前一至两周注射的 TSLP 基质细胞的量成正比。尽管以简化方式进行，但使用改良 ELISA 对血浆 TSLP 水平进行的每周评估得出的结果通常随着时间的推移是一致的。TSLP 已被证明可以增加正常人 B 细胞前体的产生。

事实上，与对照 PDX 动物相比，早在 B 细胞前体阶段，TSLP plus 小鼠的 B 系细胞就显著增加，这表明 TSLP plus PDX 动物中产生的人 TSLP 对靶细胞群产生了预期的体内功能影响。一旦优化，这些程序可以在 3 到 4 周内生成具有可检测水平的人细胞因子的异种移植小鼠。随着时间的推移，监测基质细胞上清液中的细胞因子浓度非常重要。

这确保了细胞因子的产生在产生细胞因子的基质中持续存在，而在对照基质中不存在。PDX 小鼠可用于临床前研究以回答其他问题，例如，通过改变体内感兴趣的实验细胞因子的生理水平如何改变目标特定药物的疗效？这种创新模型为血液学和肿瘤学领域的研究人员提供了一种研究 TSLP 在白血病发展中的作用及其在正常造血系统中的作用的新方法。

只要您能够获得细胞因子转导的细胞系，您就可以使用本视频中演示的技术，为使用多种免疫缺陷小鼠品系的患者来源的异种移植疾病模型提供任何外源细胞因子。不要忘记，与人类造血细胞一起工作可能是危险的。在处理这些液体和细胞时，您应该始终采取预防措施，以避免血源性病原体的传播。