Name: 斑马鱼急性酒精性肝损伤的组织学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学习使用2%乙醇处理96小时受精后斑马鱼幼鱼24小时以诱导急性酒精性肝损伤的组织学分析方法。该技术可评估肝脂肪变性和血管肿胀等病理特征，为研究人类酒精性肝病提供可靠的体内模型。

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作者谨向斑马鱼国际资源中心的Katy Murray博士、辛辛那提儿童医院医学中心（CCHMC）的Stacey Huppert博士和Kari Huppert表示感谢，他们为本实验方案提供了有益的建议；同时感谢CCHMC兽医服务部门对斑马鱼的饲养管理。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）R00AA020514基金以及辛辛那提儿童医院医学中心儿科基因组学中心研究基金（资助对象：C.Y.）的支持。部分研究还获得了NIH基金P30 DK078392（消化系统疾病研究核心中心整合形态学核心）的资助。

AB野生型成年及幼体斑马鱼在标准条件下饲养21，符合《实验动物护理和使用指南》（美国国立卫生研究院出版物86-23，1985年修订版）的要求；其使用已获得辛辛那提儿童医院医学中心（CCHMC）机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 溶液的配制
<ol>
	<li>制备卵水。
	<ol>
		<li>通过将40 g商用海盐溶解于1 L双蒸水（ddH₂O）中，配制储备盐溶液。2搅拌直至所有盐完全溶解。</li>
		<li>将0.1 g粉末溶于100 mL ddH₂O中，配制0.1%的亚甲蓝溶液2O. 
		警告：亚甲蓝若接触眼睛或皮肤会引发刺激。操作粉末时务必穿戴实验服和手套。</li>
		<li>将28.125 mL储备盐溶液与7 mL亚甲蓝溶液加入50 mL锥形管中，充分混匀。将该混合液加入15 L去离子水中。2O. 充分振荡混匀，室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 12.1 g Tris 粉末加入 100 mL ddH₂O 中，配制 100 mL 1 M Tris-HCl 溶液2O. 使用盐酸（HCl）将 pH 值调节至 9.0。 
	警告：盐酸（HCl）可导致严重灼伤，吸入后会引起黏膜刺激。操作时务必穿戴实验服和手套，并在通风橱中处理原液瓶。</li>
	<li>配制0.4%三卡因（ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate）溶液。
	<ol>
		<li>将2 g三卡因粉末溶解于489.5 mL的ddH₂O中2O. 加入10.5 mL Tris-HCl（pH 9）溶液，用磁力搅拌器搅拌至所有粉末完全溶解，调节pH至7.0。 
		警告：三卡因粉末可能引起呼吸道刺激。操作粉末时务必佩戴防尘口罩。</li>
		<li>将三卡因溶液分装至50 mL锥形管中，每管45 mL。溶液于4 °C保存以供立即使用，或于-20 °C长期储存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过混合30 mL 95%乙醇、10 mL 37%甲醛、2 mL冰醋酸和58 mL ddH₂O制备Dietrich's固定液2在玻璃培养基瓶中加入 O。轻轻旋转混匀，并在室温下保存。 
	警告：甲醛为疑似致癌物，含甲醛的溶液均应在通风橱中使用。冰醋酸可导致严重皮肤灼伤和眼部损伤。操作时务必穿戴实验服和手套，并在通风橱中处理原液。甲醛、冰醋酸和95%乙醇均为易燃液体，应储存于指定的易燃品柜中。 
	注意：Dietrich 固定液在室温下可稳定保存 1 年。</li>
	<li>配制1 L 10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）溶液：加入80 g氯化钠（NaCl）、2 g氯化钾（KCl）、14.4 g磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）和2.4 g磷酸二氢钾（KH₂PO₄），用去离子水溶解，调节pH至7.4，定容至1 L。2HPO4) 和 2.4 克磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4) 加至 800 mL 去离子水2O. 使用氢氧化钠（NaOH）调节 pH 至 7.4，并加入 ddH₂O2定容至1 L。经液体循环高压灭菌（排气1分钟，121 °C孵育20分钟）后，室温保存该溶液。</li>
	<li>通过将100 mL的10x PBS溶液加入900 mL的ddH₂O中，配制1 L的1x PBS溶液2O. 轻轻振荡混匀，高压灭菌后室温保存。</li>
	<li>在玻璃培养瓶中制备3%琼脂糖用于胚胎封片。
	<ol>
		<li>将 3 g 琼脂糖加入 100 mL ddH₂O 中2O，并轻轻旋转混匀。将混合物放入微波炉中加热以溶解琼脂糖，加热过程中需密切观察，确保沸腾程度最小。 
		注意：尽管加热时间较短，从微波炉中取出的瓶子可能仍然很烫。请使用防护手套或隔热手套取出瓶子。</li>
		<li>从微波炉中取出瓶子。在轻轻摇动的同时，观察是否有未完全溶解的晶体；若无晶体存在，则溶液可直接使用。将3%琼脂糖溶液于室温保存，使用前再次加热。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过滤Harris苏木精储备液，以去除已析出的任何固体物质。
	<ol>
		<li>将咖啡滤纸对折，使其形成一个圆锥形。打开侧面接缝，使液体流经过滤纸，从而截留任何残渣。</li>
		<li>将滤膜放入漏斗中，并将漏斗置于玻璃培养基瓶内。缓慢将储备苏木精溶液通过滤膜过滤。 
		警告：苏木精在接触眼睛、食入或吸入时具有危险性。操作时务必穿戴实验服和手套，并在化学通风橱内处理储备液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将125 µL的12 N HCl加入250 mL的ddH₂O中，配制0.05% HCl2O.</li>
	<li>将25 mL 1%伊红Y（水溶液）、2.5 mL 1%焰红B（水溶液）、195 mL 95%乙醇和1 mL冰醋酸加入玻璃瓶中，配制伊红Y-焰红B混合溶液。轻轻旋转混匀，室温保存。 
	警告：曙红Y在接触眼睛、摄入或吸入时具有危害性。操作时务必穿戴实验服和手套，并在化学通风橱内处理储备液。</li>
	<li>通过将2 mL纯乙醇加入98 mL鸡蛋水中，配制2%乙醇溶液。 
	警告：乙醇对眼睛具有刺激性。操作乙醇时务必佩戴适当的个人防护装备。乙醇易燃，应按照相关规定进行操作和储存。 
	注意：每次进行急性乙醇处理前，需新鲜配制2%乙醇。</li>
</ol>
2. 在斑马鱼幼鱼中进行急性乙醇处理
<ol>
	<li>为获得胚胎，每个交配缸中放入一条野生型雄鱼和一条野生型雌鱼进行交配。用塑料隔板将它们分隔开。 
	注意：在当天最后一次喂食后设置交配，以确保鱼类充分进食。
	<ol>
		<li>次日早上8点，移除隔板，使鱼对进行交配。</li>
		<li>1小时后，将成鱼移回其原始鱼缸。将含有胚胎的水倒入滤网中收集胚胎。将滤网翻转至一个100 mm的培养皿中，并使用装有胚胎水的洗瓶将胚胎冲洗入培养皿。将含有胚胎的培养皿置于28 °C的培养箱中孵育。</li>
		<li>当胚胎发育至至少4细胞期（1 hpf）时，用巴斯德移液管去除未受精的胚胎及水中的碎片，并将含有已受精胚胎的培养皿放回28 °C的培养箱中。在28 °C培养箱中继续孵育胚胎直至受精后96小时。</li>
		<li>通过向胚胎水中加入三卡因溶液（体积/体积比为1-10）来麻醉幼鱼。</li>
		<li>使用巴斯德移液管挑选最多四十条在96 hpf时具有充气 swim bladder（鳔）的幼鱼，并将其平均分至两个新的培养皿中。</li>
		<li>尽可能吸除残留的胚胎水。以每毫升含一条幼鱼的密度，向其中一个培养皿中加入含有2%乙醇的胚胎水，向另一培养皿中加入等量的普通胚胎水作为对照。</li>
		<li>将对照组和乙醇处理组的幼鱼在鱼房中继续培养24小时。 
		注意：在具有14小时光照/10小时黑暗循环的鱼房中进行乙醇处理，相比在培养箱黑暗条件下进行实验，可产生更一致且更显著的肝脏损伤。</li>
		<li>将幼鱼收集至1.5 mL离心管中，每管不超过20条幼鱼。</li>
		<li>尽可能去除幼鱼周围的液体，并在化学通风橱中加入至少1 mL（为组织体积的10倍）Dietrich固定液。在室温下于摇床上固定鱼类至少24小时。 
		注意：鱼类在Dietrich固定液中可稳定保存数周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 组织包埋盒的准备与处理
<ol>
	<li>准备好所需数量的组织包埋盒，每个包埋盒配备两块蓝色活检垫。将其中一块活检垫放置在每个包埋盒的底部。用铅笔在每个包埋盒上清晰标记，以明确标识样本。 
	注意：请勿使用钢笔或记号笔标记包埋盒，因为这些标记在后续步骤中会丢失。</li>
	<li>将幼虫包埋于3%琼脂糖中，以确保所有样本方向一致。
	<ol>
		<li>在通风橱中从离心管中移除固定液，并用1 mL 1×PBS对幼虫清洗3次，每次5分钟。清洗过程中将离心管置于室温下的摇床上。</li>
		<li>在清洗的同时，将预先配制的3%琼脂糖置于水中，使用微波炉加热融化。每次加热30秒，并仔细观察以尽量减少沸腾。将液态琼脂糖置于设定为90 °C的加热板上，持续轻柔搅拌。</li>
		<li>使用移液管将最多8只幼虫转移至塑料组织学模具中，并尽可能去除PBS。使用剪去尖端的移液管，将模具完全充满3%琼脂糖。</li>
		<li>使用胰岛素注射器将幼虫聚集至模具中央，并推至底部。如需制备矢状切面，应将幼虫排成一行，头部朝向模具上方。为确保肝脏方向一致，应将幼虫旋转至身体左侧朝下，并紧贴模具底部平整放置。 
		注意：由于肝脏位于身体左侧，此种摆放方式可最大限度减少到达肝脏前所需切去的切片数量。应尽量使幼虫彼此靠近。</li>
		<li>将模具静置4–5分钟，使琼脂糖完全凝固。将琼脂糖块从模具中取出，并使用剃刀片修剪幼虫周围的琼脂糖。将琼脂糖块竖立，沿厚度方向切成两半，使最终的琼脂糖块厚度约为2–3 mm。</li>
		<li>将小型琼脂糖块转移至已准备好的组织包埋盒（步骤3.1），并在琼脂糖块上方放置第二块活检垫。盖上包埋盒，将组装完整的包埋盒放入密封容器中，加入新配制的70%乙醇（溶于ddH2O中）。 
		注意：若包埋盒不会立即处理，应将其置于含70%乙醇的容器中，并在4 °C保存，以避免固定效果减弱。包埋盒在4 °C下可稳定保存最多3天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织处理 
	注意：可将样本送至配备组织处理仪的组织学或病理学实验室，进行石蜡包埋处理。请要求使用标准的过夜（O/N）处理程序，而非快速程序，以确保石蜡充分渗透琼脂糖。
	<ol>
		<li>通过梯度乙醇系列（乙醇浓度逐步升高）转移组织包埋盒，以脱水组织，具体如下：70%乙醇处理2次，每次45分钟；80%乙醇处理45分钟；95%乙醇处理2次，每次45分钟；100%乙醇处理2次，每次45分钟。</li>
		<li>用溶剂（100%二甲苯，处理2次，每次45分钟）替代乙醇，以便石蜡浸入组织。 
		警告：二甲苯具有刺激性，吸入有害。务必始终在通风橱中操作。二甲苯易燃，必须妥善储存。</li>
		<li>将包埋盒置于60–65 °C的培养箱中，与石蜡共同孵育过夜（O/N）。在包埋前保持包埋盒处于温暖状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将处理后的琼脂糖块包埋入石蜡中。
	<ol>
		<li>从包埋机的加热抽屉中取出一个包埋盒，打开盒盖，并移除顶部的活检垫。向组织学模具中注入液态石蜡，并将其置于包埋机的加热板上保温。</li>
		<li>使用预热的镊子从包埋盒中夹取琼脂糖块，并转移至含石蜡的组织学模具中。确保琼脂糖块中靠近表面的鱼体一侧朝下。丢弃底部的活检垫，并将整个组织学模具转移至包埋机的冷却板上。</li>
		<li>使用镊子迅速将琼脂糖块置于模具中央，并紧贴底部放置。待位置正确后，将包埋盒底部置于组织学模具上方，并注入半满的液态石蜡。将模具直接放置于4 °C冷却板上，至少10–15分钟内不得扰动，以使石蜡充分凝固。在第一个块凝固的同时，对剩余的块重复此过程。</li>
		<li>当所有石蜡块完全凝固后，轻轻按压模具以松动，将组织学模具从石蜡块上取下。这些石蜡块可在室温下长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 石蜡包埋块的切片
<ol>
	<li>切片前一天，使用切片机对石蜡包埋块进行修块，去除覆盖在组织表面的多余石蜡。每次切5 µm，直至组织暴露于石蜡块表面。停止切片并丢弃所有已切下的切片。将包埋块底面朝下浸泡于4 °C的1×PBS中过夜。 
	注意：包埋块应至少浸泡8小时，建议在当天工作结束时开始浸泡。若包埋块在1×PBS中浸泡时间过长，组织可能吸水膨胀并发生变形。</li>
	<li>每次从1×PBS中取出一个包埋块，用切片机切取5 µm厚的切片。用镊子或刷子轻轻将切片带末端从刀片上拉开，以分离切片带。用镊子夹住切片带末端，将其转移至42 °C的水浴中。让切片带在水面漂浮至少5分钟。 
	注意：转移切片时，镊子在仍接触石蜡的情况下不得接触水面，否则石蜡会熔附在镊子上，导致分离困难。如有必要，可用洁净的镊子将切片带轻轻分开为较小的组，以便其能顺利贴附于载玻片上。可轻触切片之间的接缝处实现分离，避免损伤组织。</li>
	<li>将一张带电荷的载玻片以45度角插入水中，并小心地将其置于待收集的切片组下方。缓慢将载玻片从水中提起，使切片自然贴附于载玻片表面。</li>
	<li>用无绒纸轻轻吸去切片上多余的水分。将载玻片放入玻片架或储存盒中。继续切片直至获得所需组织。对所有包埋块重复上述切片过程。</li>
	<li>将载玻片置于55 °C的培养箱或烘箱中烘烤3–16小时，以熔解石蜡。从烘箱中取出载玻片，待其冷却后再开始染色。 
	注意：石蜡切片可在室温下长期保存，烘烤前后均可。</li>
</ol>
5. 石蜡切片的苏木精和伊红染色
<ol>
	<li>将切片浸入100%二甲苯中15分钟以脱蜡；更换为新鲜的100%二甲苯，再浸泡15分钟。</li>
	<li>将切片依次浸入下列梯度乙醇溶液中进行水化，直至液体能顺畅地从切片上流下。每种溶液中浸入8–10次，每次2秒：100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇，最后为去离子水。 
	注意：此步骤处可暂停操作，切片可在水中室温放置数小时。如有需要，切片可在水中于4 °C过夜保存。</li>
	<li>将切片放入100%过滤的哈里斯苏木精染液中染色4分钟。立即转移回盛有去离子水的容器中。将去离子水注入容器远离组织切片的一侧角落。定期排空并更换容器中的水，直至水不再呈紫色。 
	注意：切勿让水流直接冲击切片，以免组织从载玻片上脱落。</li>
	<li>使用解剖显微镜配合鹅颈灯快速检查苏木精染色强度；切勿让切片干燥。若染色强度已达到理想程度，则继续下一步操作。若颜色不够深，将切片再次放入100%苏木精染液中1分钟，重复水洗后再行检查。 
	注意：苏木精染色需足够深，以确保在后续伊红染色过程中不褪色。然而，若在细胞质中观察到苏木精着色，则表明切片染色过度。</li>
	<li>将切片浸入0.05%盐酸中两次，随后立即转移回盛有洁净去离子水的容器中。排空并重新加水两次。</li>
	<li>将切片转移至95%乙醇中30秒，然后转移至另一新容器中的95%乙醇中再浸泡30秒。</li>
	<li>将切片放入伊红Y-焰红B溶液中染色2分钟。将切片转移回前一步的95%乙醇容器中，迅速在解剖显微镜下检查染色强度。若染色充分，则进入下一步。若不足，则返回伊红溶液中再染30秒，重新检查，必要时重复此过程。 
	注意：充分的伊红染色应呈现明亮的粉红色，并与苏木精染色形成明显对比。检查时务必擦净载玻片背面的溶液，避免产生假性颜色。由于伊红溶液含有95%乙醇，长时间停留在95%乙醇中检查染色强度可能导致部分染料被洗脱。</li>
	<li>将切片转移至100%异丙醇中15秒。更换为新鲜的100%异丙醇，再次将切片放入15秒。重复此过程，共完成6次异丙醇洗涤。 
	警告：异丙醇对眼睛和呼吸道具有刺激性。操作时务必佩戴适当的防护装备，避免飞溅。该试剂高度易燃，应妥善储存和处理。 
	注意：为节约试剂，仅弃去第一次（最粉红色）的异丙醇洗涤液。其余五次洗涤液分别保存于编号为1至5的瓶子中，供下次染色重复使用。重复使用时，从编号为&#34;1&#34;的瓶子开始，使用后即弃去。当编号为&#34;2&#34;的洗涤液使用后，将其倒入编号为&#34;1&#34;的瓶子中，依此类推。最后一次洗涤必须使用新鲜的异丙醇。</li>
	<li>将切片放入100%二甲苯中3分钟。每次取出一张切片，并加盖盖玻片。
	<ol>
		<li>加入足量封片介质覆盖组织区域，并将切片浸入100%二甲苯中。 
		注意：此步骤可使封片介质表面平滑，并去除任何气泡。</li>
		<li>将盖玻片贴附于载玻片底部。 
		注意：封片介质应能自动将盖玻片拉至正确位置。若盖玻片未对齐或未完全贴合，可轻轻敲击使其就位。</li>
		<li>用纸巾吸除多余的封片介质，直至仅剩一条细线。将纸巾浸入二甲苯中，擦拭载玻片背面以去除滴落的介质。将切片平放于坚固但可移动的表面（如硬纸板）。以相同方式完成其余切片的封片。在通风橱中静置10分钟，使二甲苯完全挥发。 
		注意：所有被二甲苯污染的材料均应移除，并置于通风橱内的密封容器中丢弃，以防止蒸气逸出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下静置过夜，使封片介质完全固化。</li>
</ol>
6. 染色玻片的成像与保存
<ol>
	<li>在倒置复合显微镜下观察切片。18 
	注意：载玻片可长期在室温下保存。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本方案详细描述了对斑马鱼幼鱼进行急性乙醇处理以及随后通过H&amp;#38;E染色进行组织病理学分析的具体步骤。急性乙醇处理不应早于受精后96小时（hpf）进行，因为此阶段斑马鱼肝脏才开始表达乙醇代谢酶13。2%乙醇是幼鱼可耐受的最高剂量13,14。经乙醇处理的幼鱼在处理8小时后即开始出现肝脂肪变性，且随着持续处理至24小时，出现脂肪变性的幼鱼比例持续上升14。斑马鱼幼鱼在120 hpf之前完全依赖卵黄提供营养。因此，不建议在120 hpf之后进行乙醇处理&#160;，因为饥饿本身也可能导致脂肪变性14。与此前其他实验室发表的方案13,24相比，本方案的主要改进在于乙醇处理是在具有14小时光照/10小时黑暗循环的鱼类养殖设施中进行。该条件相较于在培养箱黑暗环境中进...

酒精性肝病（ALD）由过量饮酒引起，是酒精相关发病率和死亡率的主要原因。在美国，近一半的肝病死亡病例与酒精有关1，而ALD几乎导致了约三分之一的肝移植手术2。ALD具有广泛的疾病谱。在大量饮酒的早期阶段，肝细胞内出现过量脂质积聚，表现为脂肪变性，这种状态在停止饮酒后是可逆的。在遗传和环境因素影响下，若持续饮酒，肝脂肪变性可能进一步发展为酒精性肝炎，并最终进展为肝硬化3。利用啮齿类动物ALD模型的研究已为该疾病提供了大量认识，但这些模型存在局限性（详见参考文献3）。通过口服酒精饮食仅能在啮齿类动物中诱导出脂肪变性4,5。若需诱导炎症和纤维化，则必须施加额外损伤因素6,7，或采用慢性经胃灌注方式，但后者具有侵入性且技术难度较高8,9。硬骨鱼类中的斑马鱼在急性和慢性酒精处理下同样会出现肝损伤10,11,12,13,14,15。特别是斑马鱼幼体，是一种理想且具有互补性的模式生物，适用于研究急性酒精性肝损伤10,11,13,15。斑马鱼肝脏在受精后4天（dpf）即具备功能，并能产生乙醇代谢所需的关键酶13,16,17。乙醇可直接加入水中，以2%乙醇浓度暴露24小时足以在斑马鱼幼体中诱导肝脂肪变性和促纤维化反应13,15。
据报道，用2%乙醇处理24小时后，斑马鱼幼鱼组织中的乙醇浓度可达80 mM13。其他研究显示，幼鱼能够耐受该浓度，且经处理动物中观察到的肝脏表型特异性地由乙醇暴露引起11,13,15,18。然而，由于80 mM的乙醇浓度对人类而言已接近致死水平19，因此有必要评估乙醇处理后斑马鱼的肝脏组织学特征，并确定其对人类的生理相关性。
斑马鱼幼体体外发育迅速且身体透明，使得研究人员能够在实时观察以及固定样本中表征酒精对肝脏的作用。细胞类型特异性荧光转基因品系的可获得性，以及共聚焦显微镜技术的最新进展，促进了对不同肝细胞类型在急性乙醇处理下形态和行为变化的研究11,15。然而，在研究肝脏组织学时，荧光转基因斑马鱼的共聚焦成像无法完全替代苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色。利用转基因斑马鱼同时标记所有肝细胞类型，需要构建多个独立的转基因品系，每个品系使用一种独特的荧光蛋白标记一种肝细胞类型。将不同的转基因背景引入同一条鱼中需要多代杂交，耗时且成本高昂。此外，检测细胞外基质成分还需额外进行免疫荧光染色。相比之下，H&amp;#38;E染色可同时标记所有肝细胞类型和细胞外基质成分，从而提供肝脏的整体结构视图20。更重要的是，该染色方法能够清晰显示多种肝脏疾病的组织病理学特征，如肝细胞死亡、脂肪变性和纤维化。尽管H&amp;#38;E染色在哺乳动物肝脏组织学中是常规手段，但在斑马鱼肝脏研究中并不常用，相关实验方案也尚未完善。
本研究描述了一种对斑马鱼幼鱼进行急性乙醇处理的实验方案，以及后续采用H&amp;#38;E 染色。H&amp;#38;E 染色法可用于所有肝脏发育与功能研究。此外，石蜡切片还可用于免疫组织化学染色，以及肝脏病理学中的其他特殊染色，包括三色染色、网状纤维染色 等等.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>E &amp;amp; K Scientific</td><td>280150</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>VWR International</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>VWR International</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>95% 乙醇（EtOH）</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2801</td><td>易燃</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Newcomer Supply</td><td>10010A</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Research Products International</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>铝制染色缸架</td><td>Newcomer Supply</td><td>5300JRK</td><td></td></tr><tr><td>带盖细菌培养皿</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>活检垫片</td><td>Simport</td><td>M476.1</td><td></td></tr><tr><td>带电荷载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-16</td><td></td></tr><tr><td>透明封片介质</td><td>Fisher Scientific</td><td>8310-16</td><td>可用其他透明封片介质替代</td></tr><tr><td>商用海盐</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>一次性切片刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>4280L</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica Mz 95</td><td></td></tr><tr><td>封闭式组织处理仪</td><td>Leica Biosystems</td><td>ASP300 S</td><td></td></tr><tr><td>伊红-品红染色试剂盒</td><td>Newcomer Supply</td><td>1082A</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>易燃</td></tr><tr><td>甲醛溶液，ACS 级试剂，37 wt.% 溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，含 10–15% 甲醇作为稳定剂（防止聚合）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>疑似致癌物；刺激性</td></tr><tr><td>10% 缓冲福尔马林</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>疑似致癌物；刺激性</td></tr><tr><td>带刻度培养基瓶</td><td>VWR International</td><td>16159-520</td><td></td></tr><tr><td>哈里斯苏木精染液</td><td>Poly Scientific R&amp;amp;D Corp.</td><td>s212</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>组织学包埋模具</td><td>Sakura Finetek USA Inc</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>加热板/搅拌器</td><td>VWR International</td><td>47751-148</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>VWR International</td><td>97058-220</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>BD Medical</td><td>BD-309301</td><td></td></tr><tr><td>倒置复合显微镜</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>491912-9850-000</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Newcomer Supply</td><td>12094E</td><td>易燃</td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica Jung BioCut 2035&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>旋转混合器</td><td>VWR International</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td>疑似致癌物；刺激性</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>VWR International</td><td>53283-916</td><td></td></tr><tr><td>移液器泵（10 mL）</td><td>VWR International</td><td>53502-233</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Grainger</td><td>4A807</td><td></td></tr><tr><td>载玻片染色套装</td><td>Newcomer Supply</td><td>5300KIT</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Fisher BioReagents</td><td>S318-500</td><td>高度危险</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢筛网（5 英寸直径）</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>L0906045in</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋盒</td><td>Simport</td><td>M505.12</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋中心</td><td>Sakura Finetek USA Inc</td><td>#5100</td><td></td></tr><tr><td>组织擦拭纸，单层</td><td>Fisher Scientific</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>移液吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>137117M</td><td></td></tr><tr><td>三卡因粉末/3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>Tris 基础缓冲液，一级标准品和缓冲剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>洗瓶，低密度聚乙烯，宽口</td><td>Nalge Nunc International</td><td>2402-0750</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>刺激性</td></tr></tbody></table>

斑马鱼急性酒精性肝损伤的组织学分析

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

酒精性肝病（ALD）是指由于急性和慢性酒精滥用所导致的肝脏损伤。它是酒精相关发病率和死亡率的主要原因之一，在美国影响超过200万人。深入了解酒精诱导肝损伤的细胞和分子机制，对于开发有效的ALD治疗方法至关重要。斑马鱼幼鱼在暴露于2%乙醇仅24小时后即表现出肝脂肪变性和纤维化形成，因此适用于急性酒精性肝损伤的研究。本文描述了对斑马鱼幼鱼进行急性乙醇处理的操作流程，并展示了其可导致肝脂肪变性以及肝血管肿胀。此外，还提供了一种优化用于斑马鱼幼鱼肝脏组织学分析的苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色详细方案。相较于免疫荧光染色，H&amp;#38;E染色具有多项独特优势：它可同时标记所有肝细胞及细胞外成分，并能便捷地检测肝损伤，如脂肪变性和纤维化。鉴于斑马鱼在模拟毒素或病毒诱导肝损伤以及遗传性肝病研究中的应用日益广泛，本方案可作为上述各类研究中组织学分析的参考标准。

10% 缓冲福尔马林和 4% 多聚甲醛（PFA）是组织学实验中最常用的两种固定剂。然而，它们对斑马鱼肝脏组织的固定效果并不理想（图1 和 Table 1）。使用 10% 福尔马林或 4% PFA 固定常导致组织收缩，从而在肝脏与周围组织之间形成较大空隙（图1A、B；图1B 展示了组织收缩的一个示例）。部分肝组织甚至可能从切片中脱落。肝细胞的细胞质也常常丢失（图1A、1B）。这两种固定剂均可引起肝细胞形态扭曲，表现为细胞发生收缩或肿胀，不再维持上皮细胞特有的柱状形态。PFA 固定还有一个额外问题，即肝细胞之间出现的空隙并非真实结构，使组织看起来呈断裂状（图1B）。此外，使用这两种...

本方案描述了对经2%乙醇处理24小时的斑马鱼幼鱼肝脏进行的组织学分析。这种急性乙醇处理会导致肝细胞脂肪变性和肝血管系统的肿胀。

酒精性肝病（Alcoholic Liver Disease, ALD）是指由于急慢性酒精滥用所导致的肝脏损伤。它是酒精相关性疾病中的主要病因之一。

本实验的总体目标是评估急性乙醇损伤对斑马鱼幼体肝脏造成的病理组织学影响。该方法有助于解答酒精性肝病领域中的一些关键问题，例如急性酒精性肝损伤的组织学特征，以及斑马鱼肝脏对急性酒精损伤的反应在多大程度上类似于人类的反应。该技术的主要优势在于，我们的乙醇处理所诱导的反应比其他已发表的方法更为显著。此外，我们的组织学方案可提高切片的组织完整性。首先使用巴斯德吸管挑选最多40条96小时受精后、鳔已充气的幼鱼，将其均匀分至两个新的培养皿中。尽可能去除残留的卵水，然后向其中一个培养皿中加入含有2%乙醇的卵水，密度为每毫升1个幼虫。向另一培养皿中加入等量不含乙醇的卵水作为对照。将对照组和乙醇处理组的幼虫置于鱼房中培养24小时。24小时结束后，将幼虫收集到1.5毫升离心管中，每管不超过20只幼虫。在通风橱内操作，尽可能去除幼虫中的液体，然后加入至少1毫升Dietrich固定液。将样品置于室温下，在旋转仪上固定至少24小时。将组织包埋盒以及每个包埋盒对应的两块蓝色活检垫准备好。在每个包埋盒底部放置一块活检垫。用铅笔在每个包埋盒上清晰标记，注明样本信息。在通风橱中操作时，从离心管中移除固定液，并用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）将幼虫清洗三次，每次五分钟。清洗过程中将离心管置于室温下的旋转混合仪上。在清洗的同时，使用微波炉加热3%琼脂糖水溶液，使其完全融化。每次加热30秒，并仔细观察以尽量减少沸腾。溶解后，将液体琼脂糖置于设定为90摄氏度的加热板上，轻轻搅拌。使用移液管将最多八只幼虫转移至塑料组织学模具中，并尽可能去除PBS。使用剪去尖端的移液管，将3%琼脂糖完全充满模具，然后用胰岛素注射器将幼虫聚集到模具中央，并推至底部。对于矢状切面，将幼虫排成一行，头部朝向模具上方。为确保肝脏方向一致，调整幼虫方向，使其身体左侧朝下，并紧贴模具底部。静置琼脂糖 4 到 5 分钟使其凝固后，将琼脂糖块从模具中取出，并用剃刀片修整幼虫周围的琼脂糖。将琼脂糖块竖立放置，沿厚度方向切成两半，使最终的琼脂糖块厚度约为 2 至 3 毫米。将小块琼脂糖转移至已准备好的组织包埋盒中，并将第二块活检垫置于琼脂糖块上方。关闭胶盒，将组装好的胶盒放入密封容器中，并加入用双蒸水新配制的70%乙醇。组织经石蜡包埋后，使用切片机以每次5微米的厚度切片，去除覆盖在组织表面的多余石蜡，直至组织暴露于石蜡块表面，此时停止切片并将所有切下的片弃去。将石蜡块切面朝下浸泡在PBS中，并于4摄氏度下过夜。第二天，从 PBS 中逐个取出组织块，使用切片机切出 5 微米厚的切片。用镊子或毛笔轻轻将最后一张切片从刀片上拉开，从而将切片带与刀片分离。用镊子夹住切片带的末端切片，将其转移至 42 摄氏度的水浴中。 让切片条带在水面上漂浮至少五分钟。用镊子将切片分开成较小的组，以便放置在载玻片上。将一张带电载玻片以45度角放入水中，并小心地将其置于待收集的切片组下方。小心地将载玻片从水中提起，使切片附着在载玻片上。用无绒纸巾吸去切片上多余的水分。将载玻片放入载玻片架或载玻片盒中。继续切片直至收集到所需的组织。完成后，将载玻片置于55摄氏度的培养箱或烤箱中烘烤3至16小时，以熔化石蜡。经过规定时间后，检查石蜡是否已完全熔化，然后让载玻片冷却，再进行染色。将切片浸入100%二甲苯中两次，每次15分钟以脱蜡，然后通过梯度乙醇进行再水化。每种溶液中浸入8至10次，每次2秒，直至液体从切片上干净流下。将切片置于100%过滤的哈里斯苏木精染液中4分钟。四分钟后，迅速将它们移回去离子水容器中。将去离子水注入容器中距离切片最远的后方角落。定期排空容器，直至水不再呈现紫色。使用鹅颈灯在解剖显微镜下快速检查苏木精染色强度。如果需要进一步染色，将玻片重新放入100%苏木精溶液中染色一分钟。达到理想的苏木精染色效果后，将玻片在0.05%盐酸中浸洗两次，然后立即转移回盛有洁净去离子水的容器中。将容器中的水倒空并重新加水冲洗两次。将玻片转移至两个盛有95%乙醇的容器中，每个容器中浸泡30秒。将玻片放入伊红Y-品红B溶液中染色2分钟。两分钟后，将切片转移回先前的95%乙醇容器中，然后在解剖显微镜下检查染色颜色的强度。如果染色不足，返回伊红溶液中复染30秒。根据需要重复此步骤。当获得所需强度的染色后，将切片转移至100%异丙醇中15秒。更换新鲜的100%异丙醇，再次将切片放入异丙醇中15秒。重复此过程，共进行六次异丙醇洗涤。将一张切片浸入100%二甲苯中三分钟后取出。加入足量封片介质覆盖组织部分，然后将切片再次浸入100%二甲苯中。盖上盖玻片，并用纸巾吸去多余的封片介质，直至仅剩一条细线，随后将纸巾浸入二甲苯中，擦拭切片背面，去除滴落的介质。将载玻片平放在坚固且便于移动的表面（如硬纸板）上，置于通风橱中使二甲苯挥发10分钟。将载玻片在室温下放置过夜，使封片介质充分硬化后再进行成像。此为受精后120小时的斑马鱼幼鱼肝脏，已在室温下浸入Dietrich固定液中固定24小时。Dietrich 固定液可为此组织提供最佳固定效果。使用 10% 甲醛固定时，肝细胞常会丢失其细胞质，组织经伊红染色后着色不良，呈现紫色。经4%PFA固定后，可见肝细胞之间存在间隙。4%PFA会导致肝组织收缩，因此肝组织与周围组织之间似乎出现较大空隙。虚线标记了周围组织的边界。此高倍图像显示了作为乙醇处理研究一部分的野生型未处理对照幼鱼肝脏的 H&E 染色结果。同样，该幼鱼在受精后 120 小时使用 Dietrich 固定液进行固定。该图像展示了从受精后 96 小时至 120 小时经 2% 乙醇处理对肝脏的影响。这种急性乙醇处理会导致肝脂肪变性和血管肿胀。箭头指向含有大量圆形脂滴沉积的肝细胞，星号标记的是肿胀的肝血管。在进行该操作时，重要的是要记住在具有明暗循环条件的鱼类饲养设施中进行乙醇处理。对于H&E染色，建议使用Dietrich固定液以获得最佳的组织保存效果。同时需注意经常检查染色强度，避免染色过深或过浅。

histological-analyses-of-acute-alcoholic-liver-injury-in-zebrafish

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

为了理解乙醇诱导的发育损伤的分子机制，我们建立了一种乙醇暴露的斑马鱼模型，并正在探索乙醇暴露后发生的物理、细胞和遗传改变1。随后，我们试图在此动物模型中寻找潜在的干预措施并快速对其进行测试。...

评估酒精暴露胎儿斑马鱼模型中的致畸变化

为了帮助评估斑马鱼胆管驱动的肝脏再生背后的分子机制，我们建立了一种肝损伤模型，该模型中表达硝基还原酶的肝细胞在甲硝唑处理后被遗传性消融。在本方案中，我们描述了如何熟练地操作、监测和分析肝细胞消融及胆管驱动的肝脏再生过程。...

斑马鱼肝细胞特异性消融以研究胆管驱动的肝脏再生

持续的纤维化伴随过量细胞外基质蛋白沉积可导致肝硬化。酒精滥用是严重肝病的主要病因之一。我们建立了一种乙醇诱导的斑马鱼肝纤维化模型，用于研究酒精诱导损伤后促进肝细胞再生的机制与策略。...

建立乙醇诱导的斑马鱼肝纤维化模型以研究前体细胞介导的肝细胞再生

本文展示了一种定量分析幼年斑马鱼肝脏大小的方法，可用于评估基因和药物干预对肝脏生长与发育的影响。...

利用明场显微镜定量斑马鱼幼鱼肝脏大小

本研究介绍了一种利用顶空气相色谱法测定斑马鱼胚胎中乙醇含量的实验方案，内容涵盖从适当的暴露方法到胚胎处理及乙醇分析的全过程。...

利用顶空气相色谱法测定斑马鱼胚胎中的乙醇含量

本方案描述了在成年斑马鱼中切除肝脏腹叶以研究肝脏再生的过程。...

成年斑马鱼的部分肝切除术

本文介绍了如何构建与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）相关的肝细胞癌（HCC）斑马鱼模型，以研究胆固醇过量对肝脏微环境及免疫细胞格局的影响。...

斑马鱼非酒精性脂肪性肝病相关肝细胞癌早期进展过程中肝脏微环境分析

本实验方案的目的是阐述建立和使用成年斑马鱼社会偏好检测方法的必要步骤，并证明该方法可用于表征乙醇诱导的社会行为缺陷。...

在斑马鱼中建立胎儿酒精谱系障碍模型以表征不良胚胎环境对成年社会行为的影响

在此，我们介绍一种通过注射庆大霉素诱导急性肾损伤来研究成年肾脏再生的可靠方法。我们证明了损伤程度依赖于庆大霉素剂量和环境温度 原位 杂交标记 lhx1a+ 形成新的肾单位。...

通过庆大霉素诱导损伤实现成年斑马鱼的肾脏再生

本文介绍了一种在斑马鱼胚胎中制造机械性血管损伤的方法。该损伤模型为研究止血、与损伤相关的炎症反应以及伤口愈合提供了一个理想的平台，适用于实时显微镜观察的生物体。...

斑马鱼胚胎中的机械性血管损伤

学习使用2%乙醇处理96小时受精后斑马鱼幼鱼24小时以诱导急性酒精性肝损伤的组织学分析方法。该技术可评估肝脂肪变性和血管肿胀等病理特征，为研究人类酒精性肝病提供可靠的体内模型。

斑马鱼急性酒精性肝损伤的组织学分析

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