Name: 将细胞质Foci分类为哺乳动物应激颗粒的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学习使用免疫荧光和荧光原位杂交技术区分哺乳动物细胞中的应激颗粒与其他细胞质灶点。该方法以人骨肉瘤U-2 OS细胞为模型，通过检测G3BP1、eIF4G、eIF3B标记物及mRNA共定位，实现对应激颗粒的准确鉴定与表征。

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我们感谢Ivanov和Anderson实验室的成员对本手稿提出的有益讨论和反馈意见。本研究得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的资助[PA获得GM111700和CA168872，PI获得NS094918]，以及波兰国家科学中心（National Science Centre in Poland）的资助[项目号UMO-2012/06/M/NZ3/00054，授予WS]。WS还感谢波兰科学与高等教育部（Mobility Plus项目）以及波美富布赖特委员会（Polish-American Fulbright Commission）对其在美国开展研究工作的经费支持。

1. 细胞准备
<ol>
	<li>按照 图1A 所示，将已灭菌的盖玻片加入24孔板的12个孔中；可使用连接真空装置的无菌巴斯德吸管逐个吸取盖玻片。轻轻将盖玻片在孔壁上轻触，释放负压，使盖玻片自然落入孔底。</li>
	<li>每孔接种1 × 105 个U-2 OS（U2OS）骨肉瘤细胞，终体积为500 µL培养基。将培养板左右、上下轻轻晃动数次，确保细胞均匀分布。</li>
	<li>用洁净的P1000枪头轻轻按压盖玻片，确保其完全贴附于孔底，且盖玻片下方无气泡。</li>
</ol>
2. 细胞应激处理
<ol>
	<li>次日，使用倒置组织培养显微镜配合10倍物镜，目视检查培养板，确保细胞在盖玻片上均匀分布且融合度一致，因为样品间的差异可能对实验结果的可重复性产生不利影响。</li>
	<li>将培养基预热至37 °C。避免向细胞中添加过冷或过热的培养基，以免分别引起冷休克或热休克。</li>
	<li>用预热的培养基稀释药物。针对每种不同的药物浓度，准备2个含有500 µL培养基的孔，并额外准备500 µL以补偿移液过程中的损耗。分装4个离心管，每管含1.5 mL。
	<ol>
		<li>对于亚砷酸钠：向每个含500 µL培养基的孔中加入1.5 µL的100 mM亚砷酸钠（终浓度：100 µM），或加入0.75 µL的100 mM亚砷酸钠（终浓度：50 µM）。</li>
		<li>对于长春瑞滨：向每个含500 µL培养基的孔中加入22.5 µL的10 mM长春瑞滨（终浓度：150 µM），或加入18.75 µL的10 mM长春瑞滨（终浓度：100 µM）。 
		注：亚砷酸钠是一种特征明确且&#160;常用的应激颗粒诱导剂，因此经典地被用作阳性对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除并弃去B1–4和C1–4孔中的培养基。加入含药物的培养基，孵育60分钟（图1A）。
	<ol>
		<li>向B1和B2孔中各加入500 µL含100 µM亚砷酸钠的培养基；向B3和B4孔中各加入500 µL含50 µM亚砷酸钠的培养基。</li>
		<li>向C1和C2孔中各加入500 µL含150 µM长春瑞滨的培养基；向C3和C4孔中各加入500 µL含125 µM长春瑞滨的培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定前30分钟，向第2列的孔中加入5 µL环己酰亚胺（1 mg/mL储备液），向第4列的孔中加入2 µL嘌呤霉素（1.25 mg/mL储备液）。轻轻摇动培养板以混匀，然后将培养板放回37 °C培养箱中继续孵育。</li>
</ol>
3. 细胞固定与免疫荧光
注意：实验前，确保甲醇已冷却至 -20 °C。配制缓冲液，包括磷酸盐缓冲液（PBS）、含 5% 正常马血清（NHS）的 PBS，以及含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS。
<ol>
	<li>弃去培养基，用 PBS 洗涤含盖玻片的孔板。根据所使用的药物，妥善处理含药物的培养基可能至关重要；请联系当地环境安全办公室获取具体操作指引。为实现有效洗涤，可将 PBS 装入挤压瓶中，剪去瓶口尖端，以使液体流出更柔和，避免形成强力射流，每次吸除原有 PBS 后，用此装置向各孔加入 PBS。</li>
	<li>使用约 250 µL 的 4% PFA 在室温下轻柔振荡固定细胞 15 分钟。确保 PFA 完全覆盖盖玻片表面；250 µL 通常足够，若未完全覆盖，可适量补加。切勿将移液枪头直接对准盖玻片加样，因为某些细胞（或经应激处理的细胞）附着能力可能改变，移液时的冲击力可能导致细胞脱落。</li>
	<li>移除PFA并妥善处理。有关如何正确丢弃多聚甲醛的详细信息，请联系当地环境安全办公室。</li>
	<li>加入约 250 µL 甲醇（-20 °C），在室温下轻轻振荡孵育 5 分钟；此步骤可同时实现细胞通透化和压平。</li>
	<li>移除并弃去甲醇，然后加入约 250 µL 的 5% NHS，在室温下孵育 1 小时，或在 4 °C 过夜以封闭细胞。有关甲醇的正确废弃方法，请咨询当地环境安全办公室。</li>
	<li>对于一抗，使用5% NHS稀释抗体。 
	注意：使用多种应激颗粒（SG）标记物是确认所观察到的颗粒是否为应激颗粒的关键 真正有效的 应激颗粒（SGs）。可使用的SG标记物数量取决于显微镜配备的滤光片。若具备标准的绿色、红色和远红滤光片组，可使用G3BP1、eIF4G和eIF3b，稀释比例为1/250。
	<ol>
		<li>本实验共使用12个盖玻片，每个250 µL（总计：3 mL 5% NHS），分别加入12 µL以下抗体：抗G3BP1（anti-G3BP1）、抗eIF3b（anti-eIF3b）和抗eIF4G（anti-eIF4G）。在室温下轻轻振荡孵育至少1小时，或在4 °C过夜孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 PBS 洗涤各孔 3 次，每次孵育 5 分钟。</li>
	<li>对于二抗，将所有二抗（1:250 稀释）和 Hoechst 染料（1:1,000 稀释）用 5% NHS 稀释。
	<ol>
		<li>本实验共需12个盖玻片，每个250 µL，总计3 mL 5% NHS。加入下列试剂各12 µL：Cy2-小鼠、Cy3-兔、Cy5-山羊（每种均为1/250稀释），再加入Hoechst染料3 µL。</li>
		<li>将盖玻片与二抗在室温下孵育1小时。在此步骤及后续步骤中，通过用盒子覆盖培养板或在组织培养皿上方覆盖锡箔，避免样品暴露于光照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 PBS 洗涤各孔，每次 5 分钟，共洗涤三次。</li>
	<li>将盖玻片用封片剂固定在已标记的玻璃载片上。将封片剂置于37 °C加热块中加热10分钟，以降低其黏度，便于移液。使用剪去尖端的P200吸头，每张盖玻片滴加25 µL封片剂至载片上；每张载片可放置4–8张盖玻片，前提是显微镜载物台允许。用精细镊子将盖玻片从孔中转移至载片，确保细胞面朝下接触封片剂。用洁净的P200吸头轻压盖玻片，使其固定。</li>
	<li>所有盖玻片封片完成后，用折叠的实验室纸巾用力按压载玻片表面，以去除多余的封片剂。使用装有 H 的挤压瓶2用 O 冲洗掉多余的封片剂，然后用折叠的实验室纸巾再次吸去水分。</li>
</ol>
4. 荧光 原位 杂交（FISH）
<ol>
	<li>参照步骤1和2.1-4进行细胞铺板和处理；后续实验仅需3个盖玻片，因此只需在第1列中铺板细胞。</li>
	<li>确保所有缓冲液已配制完成（即&#160;PBS中的4% PFA、70%乙醇水溶液、2×盐-柠檬酸钠（SSC）缓冲液以及5% NHS），甲醇已预冷至-20 °C，杂交炉已预热至适当温度。</li>
	<li>按照步骤3.1-3.3对细胞进行洗涤和固定。</li>
	<li>加入-20 °C的甲醇，作用10分钟，以通透细胞。</li>
	<li>移除甲醇，将盖玻片置于70%乙醇中孵育，并将培养板置于4 °C过夜。用Parafilm密封培养板以防止蒸发。</li>
	<li>次日，移除乙醇，加入500 µL 2×SSC以重新水化细胞。室温下轻柔振荡孵育5分钟。</li>
	<li>移除2×SSC，再加入500 µL 2×SSC，继续在轻柔振荡条件下孵育5分钟。</li>
	<li>在杂交炉底部平放一张Parafilm。每张盖玻片对应在Parafilm上滴加25 µL杂交缓冲液。从24孔板中取出盖玻片（此时细胞面朝上），将细胞面朝下放置于杂交缓冲液上。在42 °C或可选65 °C条件下孵育15分钟。 
	注意：在65 °C下进行此步骤可使细胞内RNA变性；若polyA因与蛋白质相互作用而被遮蔽，该操作有助于增强信号。</li>
	<li>将Biotin-Oligo(dT)探针（100 ng/µL）用杂交缓冲液稀释至2 ng/µL；每张盖玻片使用25 µL即可。</li>
	<li>针对每张盖玻片，在Parafilm上滴加含Biotin-Oligo(dT)的杂交缓冲液25 µL。用镊子夹起盖玻片，轻轻将其边缘接触实验用纸巾以去除多余液体。将盖玻片转移至含Biotin-Oligo(dT)的杂交缓冲液中；注意保持细胞面朝下。</li>
	<li>将盖玻片放入杂交盒中以减少蒸发。在42 °C条件下，用含Biotin-Oligo(dT)的杂交缓冲液孵育60分钟。</li>
	<li>将2×SSC置于杂交炉中，使其平衡至42 °C。</li>
	<li>向24孔板各孔中加入约500 µL预热的2×SSC，用镊子将盖玻片转移至孔中，孵育10分钟。</li>
	<li>在42 °C下重复上述洗涤步骤两次&#160;，随后在室温下再重复两次。</li>
	<li>完成步骤3.5-3.10，注意使用链霉亲和素荧光染料而非常规抗体来检测Biotin-Oligo(dT)。</li>
</ol>
5. 核糖体嘌呤霉素化检测法评估翻译状态
<ol>
	<li>按照步骤1所述，将U2OS细胞接种于盖玻片上，但每种条件仅接种一个盖玻片（本实验中为3个盖玻片：未处理组、100 µM 砷化钠处理组和150 µM 长春瑞滨处理组）（图1A）。</li>
	<li>按照步骤2的方案对细胞进行应激处理，完成步骤2.1–2.4。</li>
	<li>在固定前5分钟，向每孔含0.5 mL培养基的样品中加入2 µL嘌呤霉素（储备液：1.25 mg/mL；将2 µL稀释至500 µL，终浓度为5 µg/mL）和2.9 µL放线菌酮（emerine）（储备液：20 µg/mL；将2.9 µL加入已含嘌呤霉素的同一溶液中）。</li>
	<li>按上述方法完成步骤3.1–3.10，使用抗嘌呤霉素抗体（1/1000稀释）检测嘌呤霉素信号。理想情况下，在其余荧光通道中同时使用另外两种应激颗粒（SG）标记物进行共染。</li>
	<li>定量嘌呤霉素信号时，所有图像应使用相同的曝光时间采集。曝光时间的选择应以最亮的（未应激）样品为准，将其调整至尽可能明亮但不发生信号饱和的状态。 
	注意：抗嘌呤霉素荧光信号的强度反映正在进行的蛋白质翻译过程，因为嘌呤霉素可替代氨基酸，掺入新生肽链，并导致蛋白质合成的提前终止。</li>
</ol>
6. 图像采集与分析
<ol>
	<li>定量分析应激颗粒
	<ol>
		<li>为定量应激颗粒（SG），使用40倍物镜获取3至5张图像，每样本总计包含&#62;100个细胞。也可使用其他倍率的物镜获取图像，但需确保每张盖玻片上计数的细胞数超过&#62;100个，且放大倍数足够高，能够清晰观察颗粒。可通过将盖玻片分为五个大致相等的区域，并从每个区域随机选择一个视野来实现（图1B）；同一视野的图像应包含所有通道，以评估标记物的共定位情况。</li>
		<li>获取所有图像后，合并各通道。某些相机软件会自动完成此操作，而其他软件则需手动合并；可在ImageJ中打开所有图像，然后选择[图像 | 颜色 | 合并通道]来实现。</li>
		<li>通过计数细胞核数量手动统计细胞总数，使用Hoechst作为细胞核标记物。手动计数每个细胞中含有两个以上应激颗粒的细胞数量。 
		注：例如，使用显示G3BP1（绿色）、eIF4G（红色）和Hoechst（蓝色）的三通道合并图像时，通过蓝色通道计数细胞核（或细胞数量）。然后将每个细胞中具有两个或以上黄色斑点的细胞计为SG阳性细胞。当G3BP1的绿色信号与eIF4G的红色信号共定位时，颗粒呈现黄色。</li>
		<li>整合来自3–5个独立区域的数据，计算SG阳性细胞所占百分比： 
		（SG阳性细胞数 / 细胞核总数）* 100 = SG阳性细胞百分比</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过线扫描分析评估共定位——手动方法
	<ol>
		<li>打开ImageJ。可从（）免费下载。</li>
		<li>打开ROI管理器：[分析 | 工具 | ROI管理器…]。</li>
		<li>在ImageJ中打开合并图像：[文件 | 打开]。</li>
		<li>使用ImageJ工具栏中的直线工具，在穿过一个应激颗粒的位置画一条线，确保包含颗粒前后的区域。通过点击ROI管理器窗口中的[添加]按钮，将该直线添加至ROI管理器。</li>
		<li>将合并图像拆分为独立通道，以评估各标记物在颗粒中的定位情况：[图像 | 颜色 | 拆分通道]；此操作会将合并图像拆分为三张黑白图像。</li>
		<li>在黑白图像中，确保已选中该直线；若直线出现在图像中，则表示已被选中。若未显示，在ROI管理器窗口中点击面板中的直线；这将使ROI管理器窗口中的直线高亮为蓝色，并在黑白图像上显示该直线。若直线仍不可见，请确认ROI管理器中已勾选&#34;显示全部&#34;，然后点击图像中的直线。</li>
		<li>分析直线的强度：[分析 | 绘制剖面图]；这将弹出&#34;绘制剖面图&#34;窗口，该窗口绘制出沿直线方向信号强度的变化曲线。</li>
		<li>在&#34;绘制剖面图&#34;窗口中，点击[列表]，将弹出包含图表原始数据的窗口。复制该窗口中的所有数据并粘贴至电子表格文件中。操作方法为：选中窗口中所有数据：[编辑 | 全选]；复制数据：[编辑 | 复制]；打开电子表格文件并粘贴数据：[编辑 | 粘贴]。</li>
		<li>对每个通道分别重复步骤6.2.6至6.2.8。务必记录正在分析的通道。</li>
		<li>在电子表格中生成结果的折线图。按住[Ctrl]键并点击每列顶部的字母，选择包含数据的列。然后选择折线图：[插入 | 折线图]。</li>
		<li>在多个独立实验中的多个应激颗粒上重复此分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过线扫描分析评估共定位——ImageJ插件法
	<ol>
		<li>从ImageJ网站下载并安装RGB剖面工具（https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt）；正确安装后，工具栏中会出现一个红、绿、蓝（RGB）线条图标。</li>
		<li>在ImageJ中打开图像（例如，Tiff、JPG）：[文件 | 打开]。</li>
		<li>点击ImageJ工具栏中的RGB图标。</li>
		<li>点击并拖动以添加一条穿过应激颗粒的直线，确保包含相邻区域；直方图图像将出现在弹出窗口中。</li>
		<li>将数据保存为图像：[文件 | 另存为 | Tiff]。或者，可导出数据并在其他绘图软件中作图，方法参见上述步骤6.2.8。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

正如多种疾病的免疫组织学研究所示，慢性应激可导致不同类型的细胞内焦点结构形成。例如，大多数神经退行性疾病均以细胞内不溶性蛋白聚集为特征。当此类聚集物中存在应激颗粒（SG）相关蛋白时，通常据此推断这些焦点结构即为应激颗粒。当在经新型应激刺激处理的细胞中观察到SG标志物阳性的胞质焦点时，也常得出类似结论。本方案提供了一种简便的工作流程以鉴定 真正有效的 应激颗粒。
要确认假定的应激颗粒（SG）确实为SG，必须满足若干标准，包括对其组成和动态特征的表征。首先，SG是细胞质中的焦点结构，含有翻译停滞的mRNP复合物。因此，第一步是利用两种基于显微镜的技术——polyA-FISH和免疫荧光（IF）——来分析其组成。FISH是一种可靠的方法，可用于可视化与SG共定位的mRNA。使用寡核苷酸(dT)40探针检测在应激条件下聚集到SG中的多聚腺苷酸化mRNA。由于寡核苷酸(dT)不能检测去腺苷酸化的mRNA（后者是P小体（Processing Bodies, PBs）的核心组分），因此在细胞质焦点中出现强烈的寡核苷酸(dT)信号是这些焦点可能为SG的第一个提...

细胞采用多种机制来应对压力。其中一些反应发生在转录后水平，涉及对mRNA翻译和/或稳定性的调控1,2。受压力调控的mRNA翻译抑制及其降解过程与特定的无膜细胞焦点结构的形成相关，其中研究最为清楚的是应激颗粒（Stress Granules, SGs）3。SGs是存在于细胞质中的焦点结构，在响应压力（例如，氧化应激、热休克、营养缺乏和病毒感染）而发生翻译停滞的细胞中，可富集非翻译状态的mRNPs4。除了非翻译mRNA外，SGs还包含翻译起始因子、RNA结合蛋白以及多种信号转导蛋白5。SGs是蛋白质翻译受抑和RNA代谢改变的生物标志物，且已被证实与细胞存活和凋亡、信号通路以及核内过程相关5。
应激颗粒是动态结构，其形成与细胞翻译状态密切相关6尽管应激颗粒（SG）在外观上看似结构稳定，但其大多数蛋白质组分会快速进出，停留时间仅为数秒。虽然应激颗粒可持续存在数分钟至数小时，但其大部分组分始终处于快速动态交换状态。翻译起始的抑制以及随之而来的正在翻译的多聚核糖体解聚，会促进应激颗粒的形成；因此，应激颗粒与正在翻译的多聚核糖体之间处于动态平衡状态。这种多聚核糖体/应激颗粒之间的平衡对于区分 真正 应激诱导的其他焦点中的SGs6,7.
抑制翻译起始会导致包含 mRNA、翻译起始因子（eIF）和 40S 核糖体亚基的、具有翻译能力的翻译前起始复合物（即 48S 复合物）转化为翻译停滞的复合物（即 48S* 复合物），后者可聚集形成应激颗粒（SGs）4,6SGs 的形成由 48S 复合物形成上游两个不同步骤的翻译停滞所促进：干扰帽结合复合物 eIF4F 的功能（例如， 靶向其eIF4A亚基）或由四种eIF2激酶中的一种或多种介导的翻译起始因子eIF2的α亚基磷酸化。停滞的48S复合物的存在（即&#160;40S核糖体亚基和特定翻译起始因子的聚集是应激颗粒（SGs）的标志性特征8,9.
应激颗粒与多种病理状态相关，如病毒感染、神经变性、自身免疫和癌症3,10,11,12,13多种应激颗粒组分的突变形式与神经退行性疾病相关（例如， 肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis），其中神经元表现出细胞内病理性包涵体，这些包涵体可能在神经元死亡中发挥积极作用13一些病毒会劫持应激颗粒（SG）组分以抑制应激颗粒的形成，从而促进病毒复制14近期研究还将应激颗粒与癌症联系起来15 以及化疗和放疗处理下癌细胞的存活10,16,17,18,19,20尽管此类发现极大地激发了人们对应激颗粒生物学的兴趣，但许多已发表的研究报告缺乏重要的对照实验，无法区分应激颗粒的形成 真正 与其他应激诱导的焦点区分开的SGs。
应激颗粒（SGs）最初被描述为无膜结构的细胞质灶状聚集体，由特定的mRNA结合蛋白（RBPs）组成，包括T细胞胞内抗原1（TIA-1）和多聚腺苷酸结合蛋白（PABP）、翻译起始因子、多聚腺苷酸化mRNA以及小核糖体亚基4,6,21,22。传统上，其组分的鉴定依赖于免疫染色以及荧光标记蛋白的异源表达等技术23,24。由于应激颗粒具有高度动态的特性，对SG相关蛋白和/或mRNA进行免疫定位仍是检测应激颗粒的定义性方法23,24。迄今为止，已有超过120种不同的蛋白质被报道为应激颗粒的组成成分11。由于许多定位于应激颗粒的蛋白质在依赖或不依赖应激的条件下均可发生定位改变，并可能在其他细胞内区室或灶状结构中聚集，因此选择正确的应激颗粒标志物并结合功能标准以区分应激颗粒与其他类型的应激诱导灶状结构显得尤为重要。Bona fide应激颗粒含有mRNA、翻译起始因子和小核糖体亚基，并与翻译过程处于动态平衡状态。
这一简单的工作流程旨在确定应激诱导的焦点是否 真正 SGs。该实验流程采用U2OS细胞，这是一种常用于SG研究的细胞系。U2OS细胞具有较大的细胞质、形态较扁平，并能牢固贴附于玻璃盖玻片，因此是理想的研究材料。尽管其他类型的细胞也可用于SG研究，但需注意，不同细胞在应激颗粒形成的时间、药物浓度以及成核蛋白的丰度方面可能存在差异，这些因素会影响SG的形成动力学和组分构成。此外，某些细胞在经多聚甲醛固定后会出现细胞表面出泡（blebs），导致细胞呈现皱褶状外观，进而引起部分SG标志物呈现点状定位；若缺乏严谨分析，这些结构可能被误判为SG。这凸显了在鉴定应激诱导的焦点结构时，必须全面评估所有必要标准的重要性。 真正有效的 应激颗粒。长春瑞滨（VRB），一种促进应激颗粒形成的抗癌药物20，以及作为强烈且特征明确的应激颗粒诱导剂的亚砷酸钠（SA），在本实验方案中被用作处理刺激。
经典的应激颗粒（SGs）包含多种在细胞质焦点中发生共定位的SG标志物（包括蛋白质和mRNA）。本方案同时采用免疫荧光和荧光技术 原位 杂交（FISH）以检测蛋白标志物和多聚腺苷酸化mRNA的定位22，分别。简言之，间接免疫荧光利用抗体（即&#160;一抗）特异性结合细胞内特定蛋白质以实现检测。随后，与荧光染料偶联的二抗（通常具有物种特异性）识别一抗，从而显示目标蛋白的定位情况。通过荧光显微镜观察细胞内信号的定位。利用来自不同物种的一抗，并使用不同颜色的荧光二抗进行检测，可实现多种蛋白的共定位分析，表明其对应的靶蛋白存在于相同位置23选择已验证可共定位的标记物至关重要 真正有效的 应激颗粒。
FISH 使用带有标记的探针，该探针与特定的 RNA 或 DNA 序列碱基配对25. 为了检测 mRNA，本方案采用生物素标记的寡聚(dT)40 与mRNA的polyA尾杂交（或碱基配对）的探针即&#160;polyA FISH）。随后使用荧光标记的链霉亲和素检测生物素化的探针，因为链霉亲和素对生物素具有高亲和力。在评估应激颗粒（SGs）时，将polyA FISH与针对SG标志物的免疫荧光染色相结合非常重要，正如在 真正有效的 应观察到两种信号在SGs中发生共定位。
使用本方案，可通过多种方式评估共定位。在多通道（即&#160;RGB（红、绿、蓝）图像中，共定位会改变重叠信号的颜色例如&#160;共定位的红色和绿色呈现黄色23此外，通过线扫描分析以图形方式定量共定位，即测量给定直线上每种颜色的强度8,20本方案介绍了使用ImageJ进行两种线扫描分析的步骤26一种方法是手动操作，需完整执行整个流程；另一种方法则使用宏，即通过一个可自动执行手动步骤的简单程序。理解宏操作的前提是先掌握手动操作的流程。
应激颗粒（SGs）在翻译受到抑制的细胞中形成；因此，与未经处理的细胞相比，含有应激颗粒的细胞应表现出全局翻译水平的降低。实验上采用核糖体嘌呤霉素化（ribopuromycylation）方法。在固定前，将嘌呤霉素和放线菌酮（emetine）短暂加入细胞中，使嘌呤霉素掺入正在合成的多肽链中，导致翻译提前终止27,28。需使用放线菌酮以防止翻译重新起始29。随后可用抗嘌呤霉素抗体检测嘌呤霉素，从而获得翻译活性的瞬时快照。该方法因其快速、无需预先在缺乏特定氨基酸的培养基中饥饿处理（从而避免对细胞造成潜在的预刺激），并能揭示蛋白质翻译的亚细胞定位，而被广泛使用。其他方法，特别是使用修饰的氨基酸类似物，例如甲硫氨酸类似物L-叠氮高丝氨酸（AHA），结合&#34;点击化学&#34;技术30，已被用于证明含有应激颗粒的细胞比邻近细胞的翻译水平显著更低31。然而，该技术需要先进行甲硫氨酸饥饿处理，随后进行15–30分钟的脉冲标记。甲硫氨酸饥饿本身构成额外的应激，而较长的标记时间（i.e.&#160;15–30分钟）导致检测的是累积翻译量而非实时进行中的翻译，并且允许新合成的蛋白质从其合成位点转移至细胞内的最终定位位置。相比之下，核糖体嘌呤霉素化方法更快，且适用于任何培养基，例如用于通过葡萄糖饥饿诱导应激颗粒形成的无葡萄糖培养基。
经典的应激颗粒（SGs）与活跃翻译的多聚核糖体处于动态平衡状态。这一现象可通过药物处理样本进行实验评估，这些药物能够稳定或破坏多聚核糖体，从而改变应激颗粒与多聚核糖体之间的平衡状态23放线菌酮（或作用机制类似的emetine）可抑制延伸过程 &#34;冷冻&#34; 核糖体结合到mRNA上，从而减少可用于形成应激颗粒（SG）的非多聚核糖体mRNPs的数量。实验上，该原理可通过两种方式应用：在施加应激前加入环己酰亚胺（或放线菌酮），以阻止SG的形成；或在SG形成后加入环己酰亚胺（或放线菌酮），即使不移除应激因子，也能诱导SG解聚，因为停滞的翻译起始前复合物会缓慢进入多聚核糖体组分。相反，嘌呤霉素导致翻译提前终止，促进多聚核糖体解聚，增加能够组装成SG的起始mRNA数量。实验上，嘌呤霉素处理可增加SG的数量，或降低其在梯度应激或药物剂量下形成的阈值。在评估嘌呤霉素效应时，重要的是使用目标药物的亚最大剂量，因为嘌呤霉素预期会增强药物效应并提高显示SG的细胞百分比——但如果药物或应激本身已使100%细胞初始即形成SG，则此增强效应无法体现。这与环己酰亚胺处理形成对比：环己酰亚胺可诱导SG解聚，其效果在初始约95%细胞呈现SG时最为显著，以便观察到最大程度的减少并进行准确量化。
本方案提供了一个在哺乳动物细胞中研究应激颗粒（SGs）的框架。方法包括：（1）免疫荧光染色结合ImageJ分析，以评估假定应激颗粒中经典应激颗粒相关标志物eIF4G、eIF3b和Ras GTPase活化蛋白结合蛋白1（G3BP1）的共定位情况；（2）寡聚(dT)荧光 原位 杂交（polyA FISH）检测聚腺苷酸化mRNA；（3）使用环己酰亚胺和嘌呤霉素处理，以确定应激诱导的焦点是否与多聚核糖体处于动态平衡；（4）核糖体嘌呤霉素化检测，以评估含有疑似应激颗粒（SGs）的细胞的翻译状态。综合这些实验方法，可判断应激诱导的焦点是否可被归类为 真正有效的 应激颗粒

<table><tbody><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;reg;HTB-96&amp;trade;</td><td>常用写法 &quot;U2OS&quot;&lt;br/&gt; 在37℃培养 &amp;deg;5% CO₂条件下，37°C&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 在含10% FBS的DMEM中</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>康宁</td><td>10-013-CV</td><td>含 4.5 g/L 葡萄糖、丙酮酸钠和酚红&lt;br/&gt; 添加10% FBS、10 mM HEPES及青霉素/链霉素&lt;br/&gt; 预热先前的药物稀释液</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F2442-500ml</td><td>用于补充培养基</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>用于补充培养基</td></tr><tr><td>青霉素 链霉素</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ml</td><td>用于补充培养基</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>实验室用纸巾（Kimwipes）</td><td>KIMTECH SCIENCE</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>用于生长盖玻片的盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>使用前已高压灭菌&lt;br/&gt; 在组织培养罩中保持无菌</td></tr><tr><td>亚砷酸钠 &amp;ge;90%（SA）</td><td>Sigma</td><td>S7400-100G</td><td>溶于水配制成 1 M 浓度，然后稀释至 100 &amp;micro;M 作为工作储备液</td></tr><tr><td>长春瑞滨（Vinorelbine，VRB）</td><td>TSZ CHEM</td><td>RS055</td><td>溶于水至 10 mM</td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Sigma</td><td>P9620</td><td>用于评估翻译水平（核糖体嘌呤霉素化）&lt;br/&gt; -用于评估应激颗粒与活跃翻译之间的关联&lt;br/&gt; 用水稀释至 10 mg/mL</td></tr><tr><td>盐酸依米丁水合物</td><td>Sigma</td><td>E2375</td><td>与嘌呤霉素联用以评估总体翻译水平&lt;br/&gt; 用于评估应激颗粒与活跃翻译之间的关联&lt;br/&gt; -用水稀释至10 mg/mL</td></tr><tr><td>环己酰亚胺（Cycloheximide, CHX）</td><td>Sigma</td><td>C4859</td><td>用于评估应激颗粒与活跃翻译之间的关联&lt;br/&gt; 用水稀释至 10 mg/mL</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Lonza / VWR</td><td>95042-486</td><td>免疫荧光洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>试剂级多聚甲醛，结晶状（PFA）</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>在通风橱中，用热 PBS 配制 4% 溶液，搅拌至完全溶解&lt;br/&gt; 分装样品可在 -20 ℃ 保存 &amp;deg;数月&lt;br/&gt; 危险，使用通风橱&lt;br/&gt; 丢弃至特殊废物容器</td></tr><tr><td>甲醇，ACS级</td><td>BDH / VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td>预冷至 -20 &amp;deg;使用前置于 C&lt;br/&gt; 丢弃至特殊废物容器</td></tr><tr><td>正常马血清（NHS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31874</td><td>用 PBS 稀释至 5%&lt;br/&gt; 加入叠氮化钠以用于4℃保存 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 免疫荧光封闭液</td></tr><tr><td>乙醇，纯品，200 proof（100%），USP，KOPTEC</td><td>Decon Labs / VWR</td><td>89125-188</td><td>用水稀释至70%</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 G3BP1 抗体（TT-Y）</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-81940</td><td>4°C 保存 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/100 稀释</td></tr><tr><td>兔抗 eIF4G 抗体（H-300）</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11373</td><td>4°C 保存 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 稀释度</td></tr><tr><td>山羊抗 eIF3&amp;eta; (N-20) 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16377</td><td>eIF3&amp;eta; 也称为 eIF3b&lt;br/&gt; 4°C 保存 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 稀释度</td></tr><tr><td>小鼠抗嘌呤霉素 12D10 抗体</td><td>Millipore</td><td>MABE343</td><td>4°C 保存 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/1,000 稀释度</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure 驴抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-225-150</td><td>按制造商说明用水溶解&amp;rsquo;s 指示后，于 4 ℃ 保存 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 稀释</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure 驴抗兔 IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-165-152</td><td>根据制造商说明用水溶解&amp;rsquo;s 指示后，于 4 ℃ 保存&amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/2,500 稀释度</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure 驴抗山羊IgG（H+L）</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-175-147</td><td>根据制造商说明用水溶解&amp;rsquo;s 指示后，于 4 ℃ 保存&amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 稀释度</td></tr><tr><td>Hoechst 33258 溶液</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>孵育二抗&lt;br/&gt; dH2O 中配制的 0.5 mg/mL 储存液&lt;sub&gt;2&lt;sub&gt;0，避光保存&lt;br/&gt; -4 ℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Cy3 链霉亲和素</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-084</td><td>按制造商说明用水溶解&amp;rsquo;s 指示操作，然后于 4 ℃ 保存 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 稀释度</td></tr><tr><td>oligo-(dT)&lt;sub&gt;40x&lt;/sub&gt; 探针生物素化</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>/</td><td>用水重悬至 100 ng/mL，分装后于 -20 ℃ 保存 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 使用前用杂交缓冲液按1/50比例稀释&lt;br/&gt; 定制订单</td></tr><tr><td>杂交盒</td><td>/</td><td>/</td><td>使用任意储存载玻片盒，在底部加入湿润的滤纸以制作湿化 chamber&lt;br/&gt; - 使用前将盒子预热</td></tr><tr><td>20x SSC缓冲液</td><td>Thermo Fisher Ambion</td><td>AM9763</td><td>用无RNase水（DEPC处理）稀释至2x SSC&lt;br/&gt; 室温保存&lt;br/&gt; FISH 洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>PerfectHybPlus 杂交缓冲液</td><td>Sigma</td><td>H7033-50ml</td><td>FISH 实验用封闭与探针孵育缓冲液</td></tr><tr><td>封片介质</td><td>自制</td><td>/</td><td>将5 g的 &amp;ldquo;冷可溶性&amp;rdquo; 聚乙烯醇（poly(vinyl alcohol)）溶于20 mL PBS中&lt;br/&gt; 经超声处理混匀，随后室温下搅拌过夜&lt;br/&gt; 加入5 mL甘油和0.2 mL 20%叠氮化钠，室温下搅拌16 h&lt;br/&gt; 20,000 g 离心 20 分钟，弃去大沉淀&lt;br/&gt; 分装黏稠液体，-20℃长期保存 &amp;deg;C，4℃下保存1周 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot;</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇</td><td>Sigma</td><td>P-8136-250G</td><td>用于制备乙烯醇的试剂</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516-100ML</td><td>用于制备乙烯醇的试剂</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2002-5G</td><td>封闭液和明胶的防腐剂&lt;br/&gt; 在水中配制20%的稀释液</td></tr></tbody></table>

将细胞质焦点归类为哺乳动物应激颗粒的方法

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

细胞经常面临突发的环境变化。应激颗粒（Stress Granules, SGs）是细胞在应激条件下形成的细胞质核糖核蛋白复合物，参与调控细胞代谢和存活的多个方面。SGs 可调节细胞信号通路、转录后基因表达以及应激反应程序。这些含 mRNA 颗粒的形成与细胞翻译过程直接相关。翻译起始受抑制会触发 SG 的组装，而翻译激活或翻译延伸受抑制则促进 SG 的解聚。这种关系也体现在 SG 的组成上。SG 的核心组分包括停滞的翻译前起始复合物、mRNA 以及特定的 RNA 结合蛋白（RBPs）。SG 组装的目的是通过隔离处于翻译停滞状态的管家基因 mRNA 来节约细胞能量，从而促进应激响应蛋白的高效翻译。除了停滞的翻译前起始复合物等核心成分外，SGs 还包含大量其他蛋白质和信号分子。SG 形成缺陷会损害细胞对压力的适应能力，从而可能导致细胞死亡。SGs 及类似的含 RNA 颗粒已被发现与多种人类疾病相关，包括神经退行性疾病和癌症，这促使近年来人们开始关注对 RNA 颗粒亚型进行分类和定义。本实验方案描述了用于表征和定量哺乳动物细胞中应激颗粒的检测方法。

应激诱导的焦点结构不一定是应激颗粒（SG）。应激颗粒被定义为含有 mRNA、翻译起始因子和 RNA 结合蛋白的细胞质焦点结构，且与活跃的翻译过程处于动态平衡状态。上述实验方案可作为模板，用于鉴定某种特定应激是否能够诱导形成真正的应激颗粒（bona fide SGs）。
应激颗粒（SGs）与其它已知的SG标志物共定位，包括蛋白质和mRNA。SA和VRB可诱导形成含有G3BP1、eIF4G和eIF3b的细胞质灶状结构（图2A）。通过线扫描分析以及更高倍数的单通道图像，进一步证实了这些标志物的共定位（图2A）。此外，这些灶状结构还含有mRNA，这由polyA FISH检测结果证实，其中寡聚(dT)信号与G3BP1的免疫荧光信号共定位（图2B）。关键的是，需证明polyA-FISH信号与已知的SG标志物重叠，因为应激可能促进多种类型的灶状结构...

应激颗粒（Stress Granules, SGs）是细胞在多种应激条件下形成的无膜细胞质结构，包含mRNA、RNA结合蛋白、小核糖体亚基、翻译相关因子以及多种细胞信号蛋白。本实验方案描述了一套工作流程，结合多种实验方法对SGs进行检测、表征与定量分析。 真正 应激颗粒。

细胞常常面临突发的环境变化。应激颗粒（Stress Granules, SGs）是细胞在暴露于……时形成的细胞质核糖核蛋白复合物。

本实验流程的总体目标是确定在细胞质内识别出的焦点结构是否为真正的应激颗粒，即发挥重要细胞生理功能的RNA颗粒。该流程的主要优势在于能够检测应激颗粒的所有基本特性。尽管本流程以人骨肉瘤U-2 OS细胞为例进行展示，但也可适用于其他类型的细胞系和原代细胞。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为并非所有应激诱导形成的焦点都是应激颗粒。我们的工作流程包含了区分这两者的全部必要实验。我将与Anais Aulus共同演示该操作流程。我们是 Paul Anderson 和 Pavel Ivanov 实验室的博士后研究员。首先，按照文本方案所述，将细胞接种到置于 24 孔板中的盖玻片上。过夜培养后，吸出 24 孔板中 B1 至 B4 孔以及 C1 至 C4 孔的培养基。向 B1 和 B2 孔中加入 500 微升含 100 微摩尔/升亚砷酸钠的培养基，然后向 B3 和 B4 孔中加入 500 微升含 50 微摩尔/升亚砷酸钠的培养基。接着，向 C1 和 C2 孔中加入 500 微升含 150 微摩尔/升长春瑞滨的培养基。最后，向 C3 和 C4 孔中加入 500 微升含 125 微摩尔/升长春瑞滨的培养基。将培养板在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育 30 分钟后，向第二列的细胞中加入 5 微升 1 毫克/毫升环己酰亚胺溶液，向第四列的细胞中加入 2 微升 1.25 毫克/毫升嘌呤霉素溶液。轻轻振荡培养板以混匀溶液，并将培养板放回孵箱继续孵育 30 分钟。固定细胞时，移除孔中的培养基，并用约 250 微升 PBS 清洗细胞。加入约 250 微升缓冲的 4% 多聚甲醛溶液以固定细胞，确保盖玻片上表面完全被覆盖。随后，将培养板置于室温下的摇床上静置 15 分钟。接下来，移除并妥善处理多聚甲醛。加入约 250 µL 冰甲醇以透化并展平细胞。将培养板在室温下于摇床上继续孵育 5 分钟。透化完成后，弃去甲醇，并加入约 250 微升封闭缓冲液，在室温下封闭细胞 1 小时。随后，通过将 12 微升抗 G3BP1、eIF4G 和 eIF3B 抗体加入 3 毫升封闭缓冲液中，制备一抗溶液。每孔加入 250 微升抗体溶液至 24 孔板的每个孔中。将培养板置于摇床上，室温孵育至少一小时。孵育一小时后，移除抗体溶液，并用约 250 微升 PBS 洗涤细胞五分钟。接着，将 12 微升 Anti-Mouse Cy2、Anti-Rabbit Cy3 和 Anti-Goat Cy5 抗体与 3 微升 hooks 染料一同加入 3 毫升封闭缓冲液中，配制二抗溶液。向每个孔中加入 250 µL 二抗溶液，并覆盖培养板以保护样品避光。在室温下于摇床上孵育一小时。孵育结束后，移除抗体溶液，并用 PBS 洗涤细胞五分钟。将封片剂置于37摄氏度的加热块中加热10分钟，以降低其黏度。然后使用预切的200微升移液枪头，取25微升封片剂滴加至已标记的玻片上。用精细镊子将盖玻片从孔中转移至玻片，翻转盖玻片方向，使细胞面朝向封片剂。使用干净的P200枪头轻压盖玻片。待所有盖玻片封片完成后，用实验室纸巾紧压载玻片以去除多余的封片剂。随后，用清水冲洗载玻片。立即用实验室纸巾再次吸干。将预固定的细胞与250微升冰甲醇在室温下孵育10分钟以进行通透处理。随后，向板的空孔中加入约250微升70%乙醇，并用封口膜密封，防止蒸发。将培养板在4°C下孵育过夜。过夜孵育后，除去乙醇，并加入500微升2×SSC缓冲液以重悬细胞。将盖玻片置于室温下，在摇床上孵育5分钟。然后，弃去溶液，再次加入 500 µL 的 SSC。在温和振荡条件下，将培养板继续孵育 5 分钟。接着，将 Parafilm 覆于杂交炉底部，在其表面移取 25 µL 杂交缓冲液。将盖玻片从24孔板中转移至杂交炉内，翻转盖玻片使其细胞面朝向杂交缓冲液。在42摄氏度下孵育盖玻片15分钟。用移液器吸取25微升生物素标记的寡聚dT溶液，滴加到杂交炉内石蜡膜上。然后，用镊子夹起盖玻片，将其边缘在实验室纸巾上轻蘸，以去除多余的杂交缓冲液。将盖玻片转移至生物素化寡核苷酸dT溶液中，确保细胞面朝下，于42摄氏度孵育60分钟。杂交完成后，在24孔板的各孔中加入约500微升预热的2×SSC溶液。然后，用镊子将盖玻片转移至孔板中，在42摄氏度下孵育10分钟。用抗体溶液对细胞进行进一步染色后，使用荧光显微镜观察样本。此处展示的是未经处理的U-2 OS细胞图像，这些细胞中不含任何被应激颗粒标志物G3BP1、eIF4G和eIF3B染色的颗粒或焦点。在用亚砷酸钠或长春瑞滨处理的U-2 OS细胞中，可诱导形成含有G3BP1、eIF4G和eIF3B的细胞质焦点。通过在更高放大倍数下对每个通道进行线扫描分析，并将所得图像叠加，证实了这些标志物的共定位。此外，经处理细胞中鉴定出的细胞质焦点含有mRNA，这一点通过poly A FISH得以证实。寡核苷酸dT信号与G3BP1信号共定位，证实了应激颗粒的身份。一旦掌握，若操作得当，整个实验流程可在三天内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何进行免疫荧光和荧光原位杂交。正确表征和鉴定应激颗粒的关键步骤。请注意，使用多聚甲醛可能具有极高危险性。在进行本实验操作时，应始终采取适当的预防措施，例如穿戴个人防护装备并确保通风良好。

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