将细胞质Foci分类为哺乳动物应激颗粒的方法

该工作流程的总体目标是确定在细胞质中鉴定的病灶是否是真正的应激颗粒，这些颗粒是在细胞生理学中起重要作用的 RNA 颗粒。该工作流程的主要优点是它可以测试应力颗粒的所有基本特性。虽然该工作流程是针对人骨肉瘤 U-2 OS 细胞提出的，但它也可以应用于其他类型的细胞系和原代细胞。

一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为并非所有压力诱发的病灶都是压力颗粒。我们的工作流程包括区分它们所需的所有实验。我将与 Anais Aulus 一起演示此过程。

我们是 Paul Anderson 和 Pavel Ivanov 实验室的博士后研究员。首先，按照文本方案中的说明，将细胞接种到放置在 24 孔板中的盖玻片上。孵育过夜后，从 24 孔板的 B1 至 B4 孔和 C1 至 C4 孔吸出培养基。

将 500 微升补充有 100 微摩尔亚砷酸钠的培养基添加到 B1 和 B2 孔中，然后将 500 微升补充有 50 微摩尔亚砷酸钠的培养基添加到 B3 和 B4 孔中。接下来，向 C1 和 C2 孔中加入 500 微升含有 150 微摩尔长春瑞滨的培养基。最后，将 500 微升补充有 125 微摩尔长春瑞滨的培养基添加到 C3 和 C4 孔中。将板在 30 摄氏度下孵育 37 分钟。孵育 30 分钟后，向第 2 列的细胞中加入 5 微升 1 毫克/毫升的放线菌酮溶液，向第 4 列的细胞中加入 2 微升 1.25 毫克/毫升的嘌呤霉素溶液。轻轻摇动板以混合溶液，然后将板放回培养箱中再孵育 30 分钟。

要固定细胞，请从孔中取出培养基，并用大约 250 微升 PBS 洗涤细胞。加入大约 250 微升缓冲的 4% 多聚甲醛溶液以固定细胞，确保盖玻片的顶部完全覆盖。然后，将板放在台式摇床上，在室温下放置 15 分钟。

接下来，去除并正确丢弃多聚甲醛。加入大约 250 微升冰冷的甲醇以透化和压平细胞。将板在室温下放在摇杆上再孵育 5 分钟。

透化完成后，弃去甲醇，并在室温下施用约 250 μL 封闭缓冲液 1 小时，封闭细胞。然后，将 12 μL 抗 G3BP1、eIF4G 和 eIF3B 抗体添加到 3 mL 封闭缓冲液中，制备一抗溶液。向 24 孔板的每个孔中加入 250 μL 抗体溶液。

将板在摇杆上室温孵育至少 1 小时。孵育 1 小时后，去除抗体溶液，用大约 250 μL PBS 洗涤细胞 5 分钟。接下来，将 12 μL 抗小鼠 Cy2、抗兔 Cy3 和抗山羊 Cy5 抗体以及 3 μL 钩状染料添加到 3 mL 封闭缓冲液中，以制备二抗溶液。

向每个孔中加入 250 μL 二抗溶液，并盖上板以保护样品避光。将板在摇杆上室温孵育 1 小时。孵育完成后，取出抗体溶液，用 PBS 洗涤细胞 5 分钟。

将封片剂放入 37 摄氏度的加热块中加热 10 分钟以降低粘度。然后使用预先切割的 200 μL 移液器吸头，将 25 μL 封固剂放在贴标签的载玻片上。用细镊子将盖玻片从孔转移到载玻片上，倒置顶部，使细胞面向封固剂。

使用干净的 P200 尖端向下压盖玻片。安装所有盖玻片后，将实验室组织用力压在载玻片上，去除多余的封固剂。然后，用水冲洗载玻片。

并立即再次用实验室组织吸干。将前缀细胞与 250 μL 冰冷的甲醇在室温下孵育 10 分钟，使其透化。然后，向板的空孔中加入大约 250 微升 70% 乙醇，并使用封口膜密封板以防止蒸发。

将板在 4 摄氏度下孵育过夜。过夜孵育后，去除乙醇并通过添加 500 微升 2XSSC 为细胞再水化。将盖玻片在摇床上室温孵育 5 分钟。

然后，丢弃溶液并再次加入 500 微升 SSC。轻轻搅拌将板再孵育 5 分钟。接下来，将封口膜放在杂交炉的底部，并在其顶部吸取 25 微升杂交缓冲液。

从 24 孔板转移盖玻片，倒置顶部，使细胞面向杂交缓冲液。将盖玻片在 42 摄氏度下孵育 15 分钟。将 25 微升生物素寡核苷酸 dT 溶液移液到杂交炉中的封口膜上。

然后，使用镊子拿起盖玻片并将其边缘印迹在实验室组织上以去除多余的杂交缓冲液。将盖玻片转移到生物素寡核苷酸 dT 溶液中，确保细胞面朝下并在 42 摄氏度下孵育 60 分钟。杂交完成后，向 24 孔培养皿的孔中加入大约 500 微升预热的 2XSSC

然后，使用镊子将盖玻片转移到孔中，并在 42 摄氏度下孵育 10 分钟。用抗体溶液进一步染色细胞后，使用荧光显微镜观察标本。这里展示的是未经处理的 U-2 OS 细胞的图像，这些细胞不含任何颗粒或用应激颗粒标志物 G3BP1、eIF4G 和 eIF3B 染色的病灶。

在用亚砷酸钠或长春瑞滨处理的 U-2 OS 细胞中，诱导形成含有 G3BP1 、 eIF4G 和 eIF3B 的细胞质病灶。通过以增加的放大倍率对每个通道进行线扫描分析，然后对获得的图形进行叠加来确认这些标记物的共定位。此外，在处理过的细胞中鉴定的细胞质病灶含有 mRNA，如 poly A FISH 所示。

oligo dT 信号与 G3BP1 信号共定位，确认了应激颗粒的鉴定。一旦掌握了，如果执行得当，整个工作流程可以在三天内完成。看完这个视频后，您应该对如何进行免疫荧光和荧光杂交有了很好的了解。

对于正确表征和识别应力颗粒至关重要的步骤。不要忘记，使用多聚甲醛可能非常危险。执行此程序时，应始终采取预防措施，例如使用 PPE 和充分通风。