诱导生活青蛙和斑马鱼胚胎缺氧

本发明的总体目标是研究缺氧或高氧对任何感兴趣的水生生物的胚胎组织的影响。该方法可以帮助回答发育和细胞生物学领域的关键问题，例如胚胎生长受限、胎儿缺氧、高海拔适应、肥胖和实体瘤发展。这种技术的主要优点是简单、成本效益和稳健性。

它允许在体内长时间诱导和维持 hypoxi。收集和饲养非洲爪蟾和斑马鱼胚胎后，根据文本方案准备网底 24 孔板。将塑料棒连接到网底 24 孔板上，并将其放入所选的水池中，然后使用硅胶管将装有所需氧氮混合物或其他所选气体混合物的气罐连接到使用适当气体调节器的分配阀上。

接下来，将硅胶管和分配阀连接到水生水箱内的陶瓷盘式扩散器。根据实验中使用的胚胎类型，用适当的胚胎培养基填充低氧室水箱，然后关闭水生水箱并使用硅脂涂上盖子并小心密封。开始通过陶瓷盘扩散器扩散气体混合物。

让系统平衡 10 到 15 分钟。将腔室介质中的氧气流速调整为每秒 0.0017 至 0.0019 立方米。在此气体流速下，板的孔中不应看到介质的干扰。

氧气流量取决于气罐的内部压力和气体调节器的出口压力。这两个参数都应根据气体调节器的监视器进行调整。平衡后，使用血氧仪或氧气探头测量水中的氧气浓度。

如果需要特定的非室温，请将低氧室放入所需温度的实验室培养箱中。仔细选择用于实验的胚胎，使用全胚胎和活胚胎进行缺氧孵化。将胚胎培养皿放入装有气体培养室的培养箱中，让它们平衡到培养箱的温度。

然后使用塑料移液管小心地将胚胎转移到气体培养室的网状 24 孔板的孔中。用不同的基因型仔细标记孔。在将胚胎放入孔中时，确保腔室的最小再氧合。

快速转移样品，并迅速重新密封腔室。将气体培养室与所选气体混合物持续注入 5 小时，或根据实验情况保持更长的时间。这里使用了 5% 氧气和 95% 氮气的混合物。

小心地将胚胎从气体培养室转移回与胚胎类型相对应的常氧培养基中。准备缓冲液和培养基并根据文本方案麻醉胚胎后，使用组织匀浆器或超声仪对胚胎组织进行匀浆。然后离心匀浆以去除碎片。

收集上清液，在 85 °C 下使样品变性 5 分钟，然后添加 Laemmli 凝胶上样缓冲液至体积为 1 倍体积。使用上清液进行蛋白质印迹分析，或将样品冷冻在负 20 摄氏度。为了将 EdU 掺入胚胎中，用 400 至 500 毫升 5 毫摩尔 EuD 溶液填充气体培养室，并补充有 1% 体积的 DMSO。

将气管连接到装有 5% 氧气和 95% 氮气混合物的气瓶。将溶液孵育 15 分钟。实验前，用实验中使用的相同气体混合物预平衡溶液 15 min。

将胚胎转移到低氧室，将它们均匀分布在孔之间，并将胚胎孵育两个小时。最后，根据文本协议分析 EdU 掺入的胚胎。如此表所示，在整个实验过程中，培养培养基中所需的氧浓度是在不同的时间点诱导的，由光纤氧传感器监测。

在本实验中，在低氧浓度下稳定的 HIF-1 α 在正常氧浓度下保持的全青蛙胚胎裂解物中测量，或在 5% 缺氧及其分离视网膜的裂解物中测量。在这两个样品中，HIF-1 α 在缺氧下稳定。在这里，将青蛙和斑马鱼胚胎在维持在 5% 氧气的缺氧室中孵育，并通过监测 EdU 掺入来评估视网膜增殖。

正如预期的那样，青蛙和斑马鱼胚胎的常氧控制视网膜在增殖祖细胞所在的 CMZ 中显示出强烈的染色。在低氧室中氧孵育后，在青蛙和斑马鱼胚胎中观察到 CMZ 祖细胞增殖的强烈减少。通过进行时间过程，可以表明视网膜祖细胞增殖的减少是急性的，并且在两小时内最大，并且持续数小时，而胚胎根据其发育阶段正常发育。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 30 分钟内完成。在尝试此过程时，请务必记住确保正确的气体流速，并避免不必要且长时间的腔室重新打开。按照此程序，可以执行其他方法（如 QPCR）来回答其他问题，例如激活或下调 HIF-1 α 和缺氧或高氧的某些靶基因。

开发后，这项技术为发育生物学领域的研究人员探索青蛙和斑马鱼胚胎中的视网膜细胞增殖和缺氧以及营养受限铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何在任何水生生物中诱导缺氧或高氧，以及如何研究其对组织和感兴趣现象（如视网膜细胞增殖）的影响有很好的了解。不要忘记，使用氧气混合物可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如确保正确使用和连接气体调节器。