在成年小鼠中的亚型腺相关病毒9（AAV9）载体递送

这种软脑膜下 AAV9 递送技术的总体目标是在成年小鼠的整个脊髓长度上实现有效的脊髓实质转基因表达。这种方法可以促进针对纵脊髓基因表达的研究，并有助于了解几种脊髓神经退行性疾病的机制，包括肌萎缩侧索硬化症、脊髓外伤或慢性疼痛。该技术的主要优点是，通过与软膜下 AAV9 注射节段相邻的多个脊柱节段中的脊髓灰质和白质实现高效的转基因表达。

这种方法的视觉演示至关重要，因为如果没有视觉演示，很难学习硬脑膜打开步骤和软脑膜下针的位置。演示该程序的是我们实验室的博士后研究员 Takahiro Tadokoro。首先对动物进行适当麻醉以进行手术，这里使用异氟醚。

在继续之前确保没有爪子捏的反应，然后用眼药膏覆盖眼睛。接下来，用剪刀剃掉动物的背部，并用 2% 洗必泰清洁皮肤。如果要进行腰椎软膜下注射，请用手术刀切开 T8 至 L1 椎骨上的皮肤，然后用剪刀将椎旁肌肉从 T10 至 T12 椎骨上分离。

使用小鼠脊柱夹将动物安装到标准的立体定位框架中。接下来，用牙钻剃掉 T10 到 T12 椎骨的椎板两侧，直到出现裂缝，然后用镊子去除破裂的骨头碎片，露出腰椎脊髓的背表面。硬脑膜现在可见，使用 30 号不锈钢针头在硬脑膜上切开 1 到 2 毫米的切口。

小心切开硬脑膜以避免损伤下面的软脑膜很重要。现在，用镊子抓住切割的硬脑膜边缘，并将硬脑膜开口延长至 5 毫米。如果要进行宫颈软皮下注射，请使用耳杆将头部放入立体定位框架中，固定小鼠头部，并使用剪刀在颈部背侧皮肤上切开 1.5 至 2 厘米的切口，以暴露 C1 和 C2 节段和枕骨。

然后，用牙钻剃掉一部分裸露的枕骨，并用镊子去除骨头碎片。然后，使用 23 号不锈钢针头和镊子去除大脑池的寰枕膜。使用棉签清洁切口部位的任何组织和骨碎屑，然后切开硬脑膜，切开 2 到 3 毫米的切口。

使用玻璃毛细管支架将 34 号 pia 穿刺针和 36 号注射针安装到两个单独的 X、Y、Z 机械臂的 Z 臂上。接下来，使用与 PE10 或 PE20 管连接的 50 微升微量注射器加载 AAV9-UBI-GFP 病毒。加载病毒后，将管路末端连接到注射针。

接下来，通过设置为 8 到 10 倍放大倍率的手术解剖镜观察时，使用 X 臂将穿入软脑膜的针降低到 1 毫米的深度。保持穿刺针的角度相对于组织表面 5 到 10 度。打开 pia 后，使用 X 臂将 pia 穿刺针从软脑膜下腔中取出。

使用标志（如血管）记下穿透的部位。移动第二个纵器的 X、Y 和 Z 臂，将载有 AAV9 病毒的注射针的尖端定位到 pia 穿透部位。然后，将注射针的尖端插入软脑膜下腔约 0.5 毫米后，使用 Z 臂将软脑膜抬起约 0.3 毫米，然后使用 X 臂继续将针头水平推进到软脑膜下腔。

推进针头，直到它以约 2 到 3 毫米的深度进入软脑膜下腔，然后使用 50 微升微量注射器将 AAV9-UBI-GFP 病毒注射到软脑膜下腔。AAV9-UBI-GFP 注射完成后，从软膜下腔取出注射针。使用单丝缝合线和手术夹闭合肌肉和皮肤。

让动物在加热垫上恢复，然后再被关进干净的笼子里。将两次双侧 AAV9-UBI-GFP 注射到上腰软膜下间隙，并在 AAV9 分娩后 14 天对动物进行大量固定。在位于虚线区域内的灰质和虚线区域外的白质中可以看到强烈的 GFP 表达。

这从腰椎延伸到注射 3 加 3 微升 AAV9 的动物的上胸段。注射较低体积 AAV9 的动物 GFP 表达强度较低。下图描述了大脑运动和感觉中枢中强效逆行和顺行 AAV9-UBI-GFP 介导的 GFP 表达。

这张低倍图像清楚地显示了颈脊髓、延髓、小脑和运动皮层中存在强烈的 GFP 阳性。这张从矢状脑切片拍摄的高功率图像显示，脊髓小脑束的网状结构、核和轴突中的神经元中存在 GFP 荧光。这张从冠状脑切片拍摄的低倍图像表明，在运动皮层的锥体神经元和网状丘脑核区域的脊髓丘脑束末端存在 GFP 荧光。

最后，这张高功率图像显示了运动皮层锥体神经元中强烈的 GFP 表达。掌握后，这项技术可以在 30 到 40 分钟内完成。神经科学领域的研究人员使用这项技术将成为研究特定基因在脊柱退行性疾病进化中的作用的有效工具。

它还将有助于通过抑制已知与进行性脊髓神经元变性有关的突变基因来探索潜在的治疗效果，如熟悉的肌萎缩侧索硬化症。