Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

该方案的总体目标是在胶质母细胞瘤的临床前小鼠模型中将治疗性干细胞鼻内输送到大脑。这种方法可以帮助回答神经肿瘤学领域关于治疗性干细胞治疗是否可以在临床前脑肿瘤模型中实现稳健的治疗效果的关键问题。该技术的主要优点是鼻内给药有助于提供无创、可重复的脑肿瘤治疗，从而绕过阻塞性血脑屏障。

这项技术不仅限于胶质母细胞瘤。它可以广泛扩展到其他脑恶性肿瘤和脑部疾病的治疗。我的同事 Dou Yu 是一位研究助理教授，Gina Li 是一位研究技术专家，她将演示这个程序。

加湿、补充二氧化碳的细胞培养箱中，将感兴趣的神经胶质瘤细胞从冷冻原液中以 10 倍的一次增殖速度培养到每 T 75 平方厘米培养瓶中的 6 个细胞中，放入 15 毫升补充血清或无血清培养基中。当培养物达到 80% 汇合时，用不含钙和镁的 PBS 洗涤培养物。然后，在室温下用点 0 5% 胰蛋白酶解离细胞。

然后点击烧瓶，将细胞从容器底部分离。立即用 8 至 9 mL 含血清培养基中和酶。使用血清移液管将所得细胞悬液转移到锥形管中。

通过离心收集细胞。随后在 10 ml PBS 中洗涤两次。我们将沉淀以 5 至 20 倍 10 至第 5 个细胞的无菌盐水/2 点 5 微升浓度悬浮在无菌盐水中，并将细胞转移到冰上的无菌微量离心管中。

通过捏脚趾确认适当的镇静水平后，将大约六周大的免疫功能低下的小鼠以适当的头部位置安装在乙醇消毒的立体定位框架上。将插入的 Hamilton 微型注射器垂直于毛刺孔周围的颅骨表面。使用立体定位框架旋钮将微型注射器的平头定位，直到它刚好位于毛刺孔的开口处，然后慢慢降低注射器，直到针头到达硬脑膜表面以下 3 毫米处。

将注射器零点缩回 5 毫米，将针尖保持在硬脑膜下方 5 毫米的两个点，并在一分钟内注射 2 点 5 微升的预装胶质瘤细胞。将针头再放置 1 到 2 分钟，然后在 1 分钟内缓慢抽出注射器，以尽量减少细胞回流。涂抹无菌骨蜡以避免颅外肿瘤增加生长，并使用 7 毫米不锈钢伤口夹闭合伤口。

然后通过皮下注射输送 1 毫升 37 摄氏度无菌乳酸林格溶液，并将动物放入恢复室中，该恢复室位于加热垫的中间位置，并进行监测，直至完全恢复。神经胶质瘤细胞植入后 7 到 8 天，仅头部暴露于辐射路径。然后连续 5 天每天向动物提供两个等级的照射，在最后一次照射剂量后通过生物发光成像评估肿瘤。

对于人类神经干细胞基因修饰，当干细胞培养物达到 75% 至 80% 的汇合度时，将聚凝胺中每个细胞 5 个病毒颗粒的 CXCR4 编码的病毒直接粘附到培养基中，进行 8 至 16 小时的培养。孵育结束时，用新鲜的杀稻瘟菌素补充培养基替换转导培养基，以阳性选择转导的细胞。如图所示，通过胰蛋白酶消化收获细胞。

根据标准流式细胞术分析方案，使用抗 CXCR4 抗体和匹配的同位素抗体对照，通过流式细胞术验证 CXCR4 表达水平。然后将细胞悬浮在无菌盐水中以进行鼻内输送。对于神经细胞的低氧预处理，当培养物达到 90% 汇合时，将培养瓶转移到提供 1% 氧气的加湿二氧化碳培养箱中。

24 小时后，通过胰蛋白酶消化收获细胞。将细胞悬浮在无菌盐水中以进行鼻内输送。为了用溶瘤病毒加载人神经干细胞，根据标准腺病毒转染方案，每个细胞用 50 个条件复制腺病毒病毒颗粒感染干细胞，在室温下放置 2 小时，并定期敲击。

然后用新鲜培养基洗涤细胞 3 次，以去除任何未结合的病毒颗粒，并将细胞悬浮在无菌盐水中进行横向递送。当细胞经过实验适当的修饰后，将麻醉的荷瘤动物仰卧放在加热垫上的干净窗帘上，并在头部下方放置一个带衬垫的枕头，以保持鼻孔处于直立角度。枕头材料应为可酒精擦拭的塑料或一次性卷起的纸巾，以避免交叉动物污染。

当小鼠就位时，使用微量移液器将两微升感兴趣的实验性人神经干细胞群分配到第一只小鼠的每个鼻孔中。在应用下一体积的细胞之前，目视确认液滴的吸入。依次对每个鼠标重复传递。

然后等待 5 分钟，然后应用下一轮细胞。当所有四轮细胞都给药后，将动物置于恢复室中并进行监测，直至完全恢复。如流式细胞术所示，缺氧预处理和 CXCR4 过表达都显着上调 CXCR4 受体的细胞膜存在。

肿瘤中存在微米大小的顺磁性离子氧化物标记的干细胞可以通过普鲁士蓝染色来确认。神经干细胞所表现出的肿瘤嗜性可以通过对肿瘤组织的组织学分析来可视化。组织分析还显示，仅头部照射会导致肿瘤体积减少以及肿瘤和周围组织中 SDF-1 的上调。

证实神经干细胞中的 CXCR4 受体上调，我们促进照射后的肿瘤趋向性。生存分析表明，尽管单独照射对荷瘤动物的生存有益，但与对照照射的、负载溶瘤病毒的非缺氧干细胞相比，使用载有辐照溶瘤病毒的缺氧神经干细胞可以获得额外的益处。在溶瘤病毒负荷和照射后，还观察到 CXCR4 转导的神经干细胞具有显著的生存获益。

此外，低氧神经干细胞和 CXCR4 转导的神经干细胞都表现出显着增强的溶瘤病毒颗粒的肿瘤靶向递送，病毒六邻体蛋白染色证明了这一点。一旦掌握，如果作得当，这种鼻内给药技术可以在一小时内完成。在尝试此过程时，请务必记住完全按照描述及时执行所有步骤。

该技术允许在临床前啮齿动物模型中探索干细胞对广谱脑部疾病的治疗潜力。观看本视频后，您应该对如何进行一致且有效的鼻内治疗性干细胞递送以靶向小鼠脑肿瘤有很好的了解。不要忘记，与人体细胞和病毒一起工作可能是危险的，并且在执行这些程序时应始终采取预防措施，例如使用 a-subject 技术和适当的个人防护设备。