在体内图像的Cx3cr1^gfp/gfp 记者光谱域光学相干层析成像和扫描激光眼底

本协议描述了如何利用眼科成像平台系统, 在小啮齿动物中利用光谱域光学相干层析成像和扫描激光眼底等高分辨率成像技术, 获取有关视网膜厚度和胶质细胞分布, 分别。

该程序的总体目标是使用光谱域光学相干断层扫描和扫描激光检眼镜检查来分别获得视网膜厚度和小胶质细胞分布的信息。这种方法可以帮助回答实验眼科学领域关于视网膜异常与小胶质细胞积累之间相关性的关键问题。这种技术的主要优点是可以以非侵入性方式实时获取这些信息。

确认对角膜拭子无反应后，将鼠标置于平台左侧的俯卧位置，右侧眼眶面向晶状体。将一滴羟丙基甲基纤维素滴在加四屈光度、刚性、透气性隐形眼镜中，涂在右眼上，然后启动采集模块。对于 B 扫描，选择"红外加光学相干断层扫描"选项，在"应用程序和结构"下，选择"视网膜"，然后使用显微纵器将镜头移向鼠标眼睛。

在聚焦视网膜之前，确认已选择眼球灵巧指示器，然后使用对焦旋钮放大视网膜，直到在监视器屏幕左侧的眼底图像中清晰可见大血管。根据需要使用微型纵器调整相机的位置，根据需要转动灵敏度旋钮以降低或增加眼底图像的亮度。从 Pattern 菜单中选择 Line Scan，然后使用微作器在光谱域光学相干断层扫描 （SD-OCT） 扫描窗口的顶角和底角之间移动 B 扫描。

将 Automatic Real Time 值至少设置为 9 以获得高图像质量，然后单击 Acquire。获得所有图像后，将隐形眼镜从眼睛转移到新鲜平衡的盐溶液中，并用一滴新鲜的羟丙基甲基纤维素水化角膜。左眼成像后，逆时针方向旋转标准 30 度光学元件以将其移除并安装 55 度镜头进行第二轮成像。

要评估自发荧光，无需移动鼠标，选择控制面板上的红外线，然后专注于视网膜大血管。选择自动荧光成像，并根据需要使用灵敏度旋钮调整图像亮度。按一下灵敏度旋钮，将自动实时值设置为至少 67。

当达到自动实时值时，采集图像并再次按下灵敏度旋钮以停止平均。根据实验的需要，调整焦点以可视化不同的视网膜层。获得所有图像后，将宽视场 102 度镜头放在光学元件上，对每只眼睛的自发荧光进行成像，如刚才所示。

要测量每张图像中的手动视网膜厚度，请双击第一个实验动物中的名称以打开 OCT 扫描。打开使用 30 度或 55 度镜头获得的 B 扫描，然后选择厚度曲线。单击 Edit Layer Segmentations 图标。

该软件将自动识别内界膜和基底膜。要手动校正膜的位置，请选择要修改的层以及红色圆圈选项。按住鼠标按钮，移动圆圈以修改线条，直到相应的图层位置正确，然后单击 Save and Close 退出窗口。

在 Layer （图层） 选项下，选择 Retina 并单击图表上的其他位置以查看所选位置的视网膜厚度。然后测量视网膜厚度和与视神经头的所需距离，并将值导出到电子表格中。在这些代表性的 SD-OCT 单次扫描中，来自小鼠纯合子在 Cx3cr1 启动子下 gfp 表达的单次扫描中，视网膜结构在 30 度和 55 度晶状体图像中都清晰可见。

然而，在使用 30 度镜头获得的扫描中观察到脉络膜的高反射率。在 SD-OCT 之后，扫描激光检眼镜检查允许使用 55 度或 102 度镜片观察视网膜中单个 gfp 阳性小胶质细胞，使用 102 度镜片获得更大的眼底面积覆盖。在 SD-OCT 扫描中，在手动校正内限界和基膜视网膜边界后，当测量与视神经头的距离相同时，通常会在 30 度和 55 度镜片之间观察到视网膜厚度测量的良好相关性。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在不到 50 分钟的时间内完成。经过开发，这项技术为实验眼科学领域的研究人员在体内探索小型啮齿动物的视网膜病理学铺平了道路。