Name: 活体影像随访单细胞追踪监测细胞生物学及多神经种群的谱系进展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学习延时显微成像与单细胞追踪技术，用于监测多神经种群的细胞行为与谱系进展。该方法结合成像后免疫染色，可实时捕捉终点分析中易忽略的生物学变化，为神经科学研究提供强大工具。

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感谢 Beatriz Gascon 在图1中提供的协助和美术工作。同时感谢 C. Norris 博士提供的帮助。本研究工作得到了以下研究基金的资助：研究资助项目&#34;Red de excelencia Consolider-Ingenio Spanish Ion Channel Initiative&#34;（BFU2015-70067REDC）、MEC（BFU2014-53654-P）、BRADE-CM（S2013/ICE-2958）、UCM-Santander（PR26/16-18B-3）以及 Fundación Ramon Areces 基金项目（PR2018/16-02）。Felipe Ortega 感谢西班牙经济与竞争力部（MEC: RYC-2013-13290）的 Ramon y Cajal 项目支持。

以下部分描述了进行活体成像并随后对多个神经细胞群进行单细胞示踪所需的步骤（图1）。本方案中涉及动物的所有操作必须遵循国际实验动物科学理事会（ICLAS）的指导原则。
<img alt="细胞培养流程图：神经细胞分离、铺板、病毒转导、显微成像、数据分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56291/56291fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 示意图展示该实验方法的主要步骤， 即：细胞培养、活细胞成像、PICC 及数据采集、单细胞示踪以及最终结果。各步骤按照实验方案的工作流程进行编号。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56291/56291fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
1. 细胞培养：选定神经细胞群或细胞系的分离与接种
注意：本方案结合了其应用于不同细胞群体的示例，以验证其在分析神经细胞生物学特性方面的实用性。这些细胞包括：从小鼠脑室下区（SEZ）分离的成年神经干细胞（aNSCs）（详细的分离方案参见14）；用于研究神经元重编程的出生后皮层星形胶质细胞（详细的分离方案参见15）；出生后小脑星形胶质细胞（详细的分离方法参见16）；以及小鼠 Neuro-2a 神经母细胞瘤细胞系（N2a）。
<ol>
	<li>将细胞直接接种于多聚-D-赖氨酸包被的24孔板中，每孔加入1 mL培养基。在活细胞成像前，将aNSCs置于37 °C、8% CO2条件下培养，星形胶质细胞/细胞系置于37 °C、5% CO2条件下培养2小时。避免使用盖玻片，以防在移动电动显微镜载物台时引起不必要的位移，从而导致无法进行单细胞追踪。 
	注意：实验中使用的细胞密度和培养基如下：aNSCs在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM:F12营养混合物培养基）中接种密度为每孔30,000–40,000个细胞；N2a细胞在高糖DMEM培养基中接种密度为每孔20,000个细胞；小脑星形胶质细胞在高糖DMEM培养基中接种密度为每孔80,000个细胞；出生后星形胶质细胞在DMEM:F12营养混合物培养基中接种密度为每孔55,000–65,000个细胞。</li>
	<li>通过将细胞密度调整至可行的最低水平来标准化培养方案。然而，细胞密度必须足够高以维持培养细胞的存活率。 
	注意：若细胞密度过高，过多的碎片或解离不充分（细胞团块）可能阻碍单细胞追踪。</li>
</ol>
2. 基于延时视频显微镜的活体成像
<ol>
	<li>打开显微镜、相机、硬件和培养系统。设置温度和气压至 37 °C 和 8% CO2 对于aNSCs，或 37 °C 和5% CO2 用于星形胶质细胞/细胞系。保持温度和CO₂2 水平稳定1-2小时。 
	注意：进行延时视频分析需要特定设备，包括：配备电动组件的明场/相差/荧光显微镜；可控制温度、CO₂浓度和湿度的培养装置；高灵敏度相机；以及用于图像采集与分析的软件系统。2 和湿度；最后，需要可靠且功能足够强大的硬件和软件，能够获取并处理活体成像实验过程中产生的大量图像（请检查 材料列表).</li>
	<li>待细胞牢固贴壁后（接种后2小时），用永久性记号笔在不用于追踪的一个孔的底部做一小记号， 即， 不含细胞的孔 
	注意：此标记将用作参考点以归零 xyz 坐标，可在实验过程中或结束后，或更换培养基的间隔期间随时使用，以返回至零位。</li>
	<li>将培养板放入显微镜的孵育腔内，并将其牢固地固定在载物台上，以避免在显微镜电动载物台移动过程中产生不必要的位移。</li>
	<li>让细胞培养基在腔室内平衡温度约20分钟。此步骤可避免因组件热膨胀导致记录过程中失焦。</li>
	<li>启动活细胞成像软件并选择延时成像模块以设置实验。</li>
	<li>在“时间计划选项卡菜单”中设置实验的总时长和图像采集周期。由于所使用的透射光或荧光光具有固有的光毒性，需设定适当的间隔时间，以在分析的时间分辨率与潜在的细胞死亡之间取得平衡。 
	注意：例如，选择总共 120 h 用于 aNSC 培养，并每 5 min 获取一次明场图像。请注意，在此配置下，单个 120 h 视频的采集将需要计算机设备具备 120–150 吉字节的可用存储空间。</li>
	<li>在“xyz 点选项卡菜单”中选择由 x 和 y 坐标以及焦距（z 坐标）定义的图像位置。将参考点（xyz 零坐标）作为初始位置包含在内，以便随时调取坐标。</li>
	<li>在“波长选择选项卡菜单”中选择采集类型，根据需要选择仅明场或与落射荧光激发结合。选择曝光时间。请注意，过度暴露于透射光，尤其是荧光光源，可能影响细胞活力（如上所述）。
	<ol>
		<li>对于aNSCs、小脑星形胶质细胞和N2a细胞，选择明场（曝光时间10-50 ms）。</li>
		<li>对于转导的皮层星形胶质细胞，根据实验所用报告基因，选择明场（曝光时间10-50 ms）结合红色/绿色荧光成像（红色激发波长：550 nm，曝光时间400 ms；绿色激发波长：460-500 nm，曝光时间100 ms）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定义实验名称以及存储图像的文件夹。保存位置列表，以便随时重新加载实验。在设置完所有条件后，单击“立即运行”按钮以启动实验。</li>
	<li>暂停实验，每天点击一次“overwrite z button”以重新调整焦距条件，直至实验结束。如果在活细胞成像过程中需要更换培养基，需先暂停实验，从延时成像培养箱中取出培养板。随后在无菌条件下更换培养基，并将培养板放回显微镜载物台（参见步骤2.3）。重新调整焦距条件后继续实验。 
	注意：由于细胞死亡或过度增殖导致的培养基 pH 值变化，以及室温波动，可能会影响显微镜对细胞的正确聚焦。对于敏感的细胞培养（如 aNSCs），我们建议使用添加了 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）的培养基（终浓度：1 mM）。</li>
</ol>
3. 成像后免疫细胞化学（PICC）、数据采集与处理
<ol>
	<li>实验完成后，暂停软件，取出培养板进行固定和活细胞成像后续处理（PICC），具体步骤如下所述。</li>
	<li>进行细胞固定：用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次，加入 500 µL 多聚甲醛（PFA）（4% 溶于 PBS），室温（RT）孵育 10 分钟。 
	注意：多聚甲醛为强效固定剂，操作时应小心避免接触皮肤或眼睛，必须仅在通风橱内操作。</li>
	<li>用 1 mL PBS 洗涤细胞三次，加入 500 µL 封闭液（含 2%（wt/vol）牛血清白蛋白（BSA）和 0.2%（vol/vol）非离子型表面活性剂的 PBS），室温孵育 1 小时。</li>
	<li>移除封闭液，加入 250–400 µL 一抗溶液，室温孵育 2 小时。一抗溶液为将一抗稀释于含 2%（wt/vol）BSA 和 0.2%（vol/vol）非离子型表面活性剂的 PBS 中制备而成。本实验中使用的一抗包括：GFAP（1:500）、βIII-微管蛋白（βIII-tubulin，1:1,000）和 α-微管蛋白（α-tubulin，1:1,000）。由于该步骤直接在孔内进行，需使用较大体积（250–400 µL）的溶液以确保完全覆盖所有细胞。</li>
	<li>用 1 mL PBS 洗涤三次，加入 250–400 µL 二抗溶液（稀释方法同步骤 3.4）。本实验中使用的二抗包括：抗小鼠荧光素（FITC）抗体（1:800）、抗兔 Cy3 抗体（1:500）。室温避光孵育 1 小时。</li>
	<li>用 1 mL PBS 洗涤三次。将细胞保存于 1 mL PBS 中，用于后续实验步骤。</li>
	<li>将培养板重新放回显微镜载物台上，并牢固固定，以防止在电动载物台移动过程中发生意外位移。</li>
	<li>利用步骤 2.2 中标记的位置恢复 xyz 零点，并通过点击“Offset All X, Y, Z”按钮将各坐标位置重置至该参考点。重新设定每个位置的焦距。</li>
	<li>获取最终一轮图像，在软件的“波长选择选项卡菜单”中配置荧光发射所需的条件，以检测 PICC 中先前靶向的抗原。
	<ol>
		<li>简要而言，除明场外，在软件中激活 FITC（激发波长：495 nm）和 Cy3（激发波长：550 nm）的采集选项。明场曝光时间设为 10–50 ms，荧光染料检测曝光时间设为 400 ms，点击“1 time loop”按钮，获取最终一轮图像。 
		注意：荧光强度可能因 PICC 结果而异。请调整曝光时间以获得最佳图像质量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择软件中的文件/导出功能，将图像导出为标记图像文件格式（Tiff）或联合图像专家组格式（Jpeg），并保存至预设的目标文件夹。</li>
	<li>将导出的图像转换为追踪软件所需的格式：The Tracking Tool17（tTt）。为此，在“tTt Converter tool”操作窗口中定义输入和输出文件夹，以及用于位置（xy）、通道（c）和时间点（t）的标记，然后点击“convert images”按钮。 
	注意：图像必须根据特定设置重命名，并且每个实验中使用的位置应分别存储在独立的文件夹中。该追踪工具的安装说明、系统要求、位置/图像重命名方法及使用指南可从以下网址下载：https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/tTt-and-qtfy.html。</li>
</ol>
4. 单细胞追踪
<ol>
	<li>重命名数据后，运行 tTt 软件。选择用户名和 tTt 工作文件夹。 
	注意：追踪工具的工作文件夹将保存所有分析数据和导出结果。该工作文件夹必须命名为 tTtexport，其内包含名为“AVIexport”、“Configs”、“TreeExport”和“tTtfiles”的子文件夹。</li>
	<li>在“选择实验文件夹窗口”中选择要加载的实验，指定存储实验的文件夹路径，然后点击“加载实验”按钮。</li>
	<li>运行日志文件转换器，将加载的图像转换为跟踪软件可读取的格式（对于首次加载的实验，软件将自动提示执行此操作）。</li>
	<li>通过单击其符号来选择用于追踪的位置（转换后，“位置布局窗口”中将显示实验期间记录的位置概览）。每个位置均由一个符号表示，该符号包含位置的图像及其对应的编号（参见 图1).</li>
	<li>选定位置后，当“位置布局窗口”右侧显示可用图像列表时，选择这些图像并点击“Load images”按钮。</li>
	<li>加载完成后，当“细胞编辑窗口”出现时，在该窗口中选择需要追踪的波长和图像间隔。波长0对应明场，1对应FITC，2对应Cy3，3对应DAPI。在本文描述的实验中，使用了间隔1。 即所有图像已加载。需要说明的是，间隔2表示每隔一张图像加载一次。</li>
	<li>图像加载完成后，返回“位置布局窗口”，双击代表已加载位置的图标，将弹出“电影窗口”，用于进行单细胞追踪。</li>
	<li>按照追踪工具的说明进行追踪。选择0通道（对应明场），并调整亮度和对比度（“调整伽马按钮”）。按下F2键开始追踪。 
	注意：在追踪过程中，将鼠标指针置于待追踪细胞上并按下“0”键，即可持续追踪该细胞。可通过细胞分裂、细胞凋亡和细胞丢失按钮来监测这些特定的细胞事件。随着实验的追踪进行，这些选项将自动显示在“细胞编辑器窗口”中绘制的谱系树中。</li>
	<li>一旦追踪到克隆，将明场图像与通过 PICC 获得的免疫荧光图像进行比对，以确定细胞后代的性质。每个落射荧光通道将在“电影窗口”中显示（通道 1、2， 等等。).</li>
</ol>
5. 最终结果
<ol>
	<li>完成单细胞追踪并确定子代细胞后，保存实验（细胞编辑器窗口/文件选项卡/将当前谱系树另存为），然后导出结果。</li>
	<li>在“细胞编辑器窗口”的“导出菜单”中导出谱系树和细胞数据。同样，通过“电影窗口”中的“导出菜单”导出细胞图像和视频。图像、谱系树、数据和视频将被导出至 tTt 工作文件夹。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

活体成像最重要的价值之一在于能够进行精确的谱系追踪，从而阐明神经细胞群体中谱系发育的关键特征。谱系追踪是指识别并持续监测单个前体细胞的所有子代细胞，从克隆的始祖细胞到其后续形成的克隆。21. 值得注意的是，用于谱系示踪的替代方法（例如病毒转导或多色报告基因构建体21存在一个关键缺陷，即最终结果基于静态图像，未必能代表整个过程的完整序列。这意味着细胞死亡、细胞群体行为的异质性、标记物的稀释、扩散或标记效率低下，以及其他重要限制因素，均可能导致结果读取不完整或不准确2此外，活体成像使研究者能够分析神经细胞群体生物学的重要特征，例如细胞分裂的方式与时间、细胞生长、迁移、增殖与分化之间的平衡、细胞周期长度、神经突的形成及其复杂性与长度，以及细胞命运决定（分化）或转分化（重编程）等过程。
此外，活体成像可轻松与其他旨在获取单细胞数据的分析方法相结合，例如RNA测序。然而，要同时获得活体成像与其他技术的联合优势，需要在视频中先前监测的细胞能够在后续被重新识别并单独收集用于二次分析。这可以通过使用带有位置坐标的显微镜、应用特定细胞的荧光报告系统，或分析细胞群体的分布作为参考来实现。事实上，单个细胞的转录组特征与其行为的结合，可能为揭示细胞生物学中涉及的新分子信号通路提供一条强有力的途径。
影响活体成像实验的主要问题之一是细胞培养密度过低。如前所述，密度过高时，过多的碎片或解离不充分（形成细胞团块）可能会影响图像的质量和空间分辨率，导致无法进行单细胞追踪。因此，应将所研究的不同细胞群体的培养条件调整至在不损害细胞培养活力的前提下尽可能低的细胞数量。
图像采集的频率也非常关键，尤其是在使用荧光照明时，应仔细调整。细胞过度暴露于透射光特别是荧光光源下，可能影响细胞活力。此外，图像采集间隔时间过长，则可能影响分析的时间分辨率。
活体成像实验中的另一个关键步骤是定期调整焦距。若未能正确设置或重新设置焦距，可能会影响单细胞追踪。此外，必须仔细检查培养箱是否维持了适当的温度、湿度和CO2浓度，并及时纠正可能引起细胞死亡的异常波动。
最后，在完成经外周静脉置入中心静脉导管（PICC）操作后，必须在最后一次图像采集前准确恢复xyz零位。若xyz零位设置不正确，将难以匹配相差显微图像与免疫荧光图像，从而影响对细胞子代的识别。
尽管这种方法具有诸多优势，对神经细胞群体进行活体成像仍存在一些局限性。例如，为了成功实现对aNSCs的单细胞追踪，需要较低的细胞密度，这使得无法进行诸如蛋白质印迹（Western blotting）14等生化检测。此外，对于小脑星形胶质细胞或N2a细胞等快速分裂的细胞群体，其监测在时间上受到限制，因为当培养接近汇合时，细胞追踪往往变得过于困难。再者，许多培养方法以及细胞分离过程中固有的生物学限制，常常导致细胞在长时间培养中活力下降，从而限制了活体成像实验的持续时间。最后，将细胞从其天然环境中分离出来既有积极影响也有负面影响。脱离生理微环境的细胞可能无法接收到调控其行为的重要信号；但与此同时，这种方法也为单独检验这些信号在特定神经细胞群体谱系进展中的作用提供了有力手段。
鉴于上述局限性，显然最理想的方法学方案是在正常生理条件下进行活体成像和单细胞示踪实验 体内然而，目前的技术无法在脑部深层区域对单个细胞进行长时间的追踪2因此，活体成像的未来发展应致力于克服这一局限，力求全面解析单个细胞的细胞生物学特性 体内 尽可能轻微地干扰生理环境3.

为了开发出更新且更有效的治疗策略以再生神经细胞群体，我们必须首先了解维持具有神经再生潜能细胞的基本机制。实现这一目标需要全面掌握调控细胞静息与增殖/分化之间的平衡、分裂方式与分裂时机、细胞周期长度、迁移能力以及细胞存活率等相关因素， 等等尽管这是一种已使用多年的实验技术1活体成像和直接观察仍然是监测上述事件的最佳选择。与许多侧重终点检测的方法不同，活体成像和单细胞追踪可在整个实验过程中提供动态信息2,3,4,5,6因此，加入时间分辨率可以识别出细胞死亡、细胞行为的异质性或细胞命运决定，以及许多其他可能被忽视的关键事件。理想情况下，这些细胞特征应在单细胞水平上进行最佳监测 体内 其中同时考虑了内在（细胞自主）和外在（细胞微环境）信号。
然而，尽管体外（in vitro）环境无法完全模拟细胞的天然微环境，但这些实验方案中常用的低密度培养条件更有利于揭示细胞的内在特性。此外，通过简单地调整培养基来更简便地控制周围环境，可成为研究决定神经微环境的各种外在因素以及病理状态下可能被诱导的环境因子各自作用的有力工具7,8,9,10,11,12,13。因此，当实验设计恰当时（如本文所提出的方案），活细胞成像为解决上述已列出的大多数问题提供了一种可行的体外（in vitro）研究方案。
简而言之，本方案描述了成功进行活体成像实验并随后进行单细胞追踪所需的硬件、软件、培养条件及主要步骤。该方法可提供有价值的信息，有助于揭示多种神经细胞群体在生物学特性及谱系发育进程中的基本特征。

<table><tbody><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td>工作液浓度 0.02 mg mL-1</td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Falcon</td><td>352047</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基（DMEM）：F12 营养混合物培养基（不含 L-谷氨酰胺）</td><td>Invitrogen</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基</td><td>Sigma</td><td>D6546</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Merck</td><td>11869</td><td>非离子型表面活性剂</td></tr><tr><td>小鼠抗-&amp;beta; III 微管蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>T8660</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 GFAP 抗体</td><td>DakoCytomation</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗-&amp;alpha; 微管蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记的抗小鼠二抗</td><td>Jackson Laboratories</td><td>715-095-150</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 标记的抗兔二抗</td><td>Jackson Laboratories</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>明场/相差/荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>TE-2000-E</td><td></td></tr><tr><td>CFI PLAN FLUOR DLLL 10X 物镜</td><td>Nikon</td><td>Ref 280MRH10101</td><td></td></tr><tr><td>CFI SUPER PLAN FLUOR ELWD AMD 20X 物镜</td><td>Nikon</td><td>Ref 280MRH48230</td><td></td></tr><tr><td>pE-300 LED 荧光光源</td><td>Cool LED</td><td>Ref Number 1981</td><td></td></tr><tr><td>310M-201 培养系统（温度控制）</td><td>OKO-Lab</td><td>序列号&amp;ordm; VOF007307</td><td></td></tr><tr><td>Pro-ScanII&amp;nbsp; 电动载物台系统</td><td>Prior</td><td>序列号&amp;ordm; 60018</td><td></td></tr><tr><td>高精度显微相机，版本 4.2</td><td>ANDOR Zyla</td><td>VSC-03650</td><td></td></tr><tr><td>用于延时成像的专用活细胞成像软件：NIS-Elements AR4.5</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements AR4.5 -Hasp ID: 13CE819E</td><td></td></tr><tr><td>OKO touch 培养系统（CO2 控制）</td><td>OKO-lab</td><td>序列号 1716</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 Neuro-2a 神经母细胞瘤细胞系</td><td>ATCC</td><td>ATCCCCL131</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr></tbody></table>

活体成像联合单细胞示踪监测多种神经细胞群体的细胞生物学与谱系进展

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

理解调控神经细胞群体关键生物学事件（如增殖、分化或细胞命运决定）的机制，对于设计针对多种神经系统疾病的有效治疗策略至关重要。目前用于追踪细胞群体的方法主要依赖静态图像中的最终结果，通常难以提供足够的时间分辨率来识别单个细胞的行为特征。此外，细胞死亡的差异、细胞群体内的行为异质性、标记物的稀释或扩散，以及所用标记物效率低下等问题，都是导致结果读取不完整或错误的重要障碍。相反，在适当条件下进行活细胞成像和单细胞追踪，是监测上述各类事件的有力工具。本文介绍了一种基于延时视频显微镜的实验方案，结合后续图像处理，利用特定软件实现对神经细胞群体的单细胞分辨率追踪。所述方法使研究人员能够深入探究不同神经细胞群体在细胞生物学特性及谱系发育进程中的关键科学问题。

所述方法能够解决有关多种神经细胞群体细胞生物学的关键问题。例如，已可监测aNSCs的神经发生和少突胶质发生谱系的进展过程7,8,14,18通过追踪单个aNSCs及其子代（图 2A，B），可以证明分离的aNSCs 体外 保持其神经发生特性，主要生成成神经细胞，并遵循所提出的序列 体内19 但在单细胞水平上尚未被证实。此外，该培养系统首次实现了对来自SEZ的aNSC谱系中不对称细胞分裂的可视化观察图2B），为研究神经干细胞的自我更新提供了独特的模型8,14同样，无论分析的是何种细胞谱系，均可获得有关细胞生长、分裂次数、细胞活力或细胞周期长度的有价值数据。
<img alt="对称/不对称神经干细胞分裂的神经发生谱系分析，显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56291/56291fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2. 从侧脑室下区（SEZ）分离的活体神经干细胞（aNSCs）示例，通过活细胞成像和单细胞追踪进行分析。相差图像显示克隆在不同时间点（日-时：分）的发育进程。最终图像为成像后免疫细胞化学染色（PICC），标记胶质纤维酸性蛋白（GFAP，红色）、βIII-微管蛋白（绿色）和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）。(A) 通过对多轮扩增性分裂生成终末分裂后神经母细胞的对称性神经发生谱系树分析。红色箭头指示包含在对称谱系树中的细胞。右侧显示由tTt软件生成的对应克隆谱系树。(B) 一个前体细胞产生不对称神经发生谱系树的示例，其中一个分支通过扩增性分裂产生神经母细胞，而另一分支则可能通过自我更新事件生成静息态GFAP阳性细胞。右侧显示由tTt软件生成的谱系树。所有谱系树中：“N”代表终末分裂后神经母细胞；“G”代表静息态GFAP阳性细胞；“X”代表细胞死亡；“?”代表丢失的细胞。比例尺为50 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56291/56291fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
活体成像与单细胞追踪分析还可准确反映神经细胞群体的迁移能力。该信息来源于对出生后小脑星形胶质细胞进行划痕损伤实验所获得的数据20，从而获取了星形胶质细胞在修复伤口过程中平均迁移距离的相关信息（图3）。此外，实验观察到部分星形胶质细胞在愈合过程中发生分裂，而另一些细胞在整个实验期间保持未分裂状态。值得注意的是，发生分裂的细胞似乎比未分裂的细胞表现出更强的迁移活性（平均迁移距离为后者的两倍）。这一现象提示星形胶质细胞在损伤后形成瘢痕的能力具有显著异质性，而这种异质性在传统的终点分析实验中往往会被掩盖。 
<img alt="划痕伤口实验示意图、大鼠小脑星形胶质细胞、延时图像、细胞迁移分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56291/56291fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 划痕伤口实验中新生期小脑星形胶质细胞迁移行为的分析。相差显微图像显示了伤口在不同时间点（日-小时：分钟）的形态。由tTt软件生成的谱系树展示了星形胶质细胞在闭合伤口过程中细胞分裂的代表性行为。柱状图显示了通过单细胞追踪分析得到的星形胶质细胞平均迁移距离（均值 ± 标准误）。比例尺为50 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56291/56291fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
延时视频显微实验的另一个有趣特征是能够比较细胞群体中的增殖与分化。我们测试了在促进增殖（含10%胎牛血清（FBS））或分化（含0.5% FBS + 10 µM 花生四烯酸）条件下培养的N2a细胞。在增殖条件下，可以追踪这些细胞的谱系进展（图4A），而分化中的细胞不进行增殖，并会形成神经突（图4B）。值得注意的是，单细胞追踪能够区分具有不同增殖能力的细胞克隆，并可评估神经突的伸长与回缩，从而提供精确且定量的数据，这些数据可随后导出使用。
<img alt="增殖与分化条件下N2a细胞谱系及其谱系树和免疫细胞化学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56291/56291fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4. N2a细胞在增殖（A）或分化条件（B）下的生物学行为监测。相差显微图像显示克隆在不同时间点（日-时：分）的发育进程。末幅图像为成像后免疫细胞化学（PICC）染色结果，显示α-微管蛋白（绿色）。（A）单细胞追踪可监测细胞分裂次数，以及不同细胞在增殖反应中的异质性。右侧为tTt软件生成的谱系树，展示N2a细胞的增殖行为。（B）在分化条件下，细胞退出细胞周期并长出神经突，该过程可通过成像后分析有效量化。右侧谱系树所示的单细胞追踪结果，展示了N2a细胞在分化条件下如何退出细胞周期并停止分裂。比例尺为50 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56291/56291fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
最后，活细胞成像和单细胞示踪对于监测细胞在重编程过程中发生的形态学和分子变化极为有用。对出生后星形胶质细胞转导 Achaete-scute 同源物 1（Ascl1）进行活细胞成像，可提供有关重编程期间发生的形态学变化，或星形胶质细胞重编程过程中细胞分裂受阻的宝贵数据（见图5）。此外，当 Ascl1 转导与在 Double Cortin（DCX）启动子控制下表达绿色荧光蛋白（GFP）的构建体转导相结合时，可以精确定义重编程细胞中开始表达神经元特异性标志物的时间点（图5）。延时视频显微镜还可用于量化成功完成重编程的细胞数量，并与在此过程中死亡的细胞数量进行比较。对这些事件的监测有助于识别成功重编程细胞中的关键“检查点”9。
<img alt="星形胶质细胞重编程；明场、RFP、GFP图像；谱系追踪、细胞分化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56291/56291fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 对出生后皮层星形胶质细胞进行神经元重编程的分析。通过转导促神经发生的Ascl1-红色荧光蛋白（RFP）载体诱导重编程。通过共转导携带由DCX启动子调控的GFP的载体来监测神经元转化过程。相差图像显示了在不同时间点（日-小时：分钟）重编程的进展过程。荧光图像分别显示RFP和GFP的表达情况。活细胞成像与单细胞追踪可追踪关键事件，例如形态学变化、重编程过程中细胞分裂的缺失、细胞死亡，以及重编程细胞开始表达神经元标志物的确切时间。比例尺为80 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56291/56291fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种通过延时视频显微镜监测神经细胞群体，并结合基于软件的后期处理的稳健方案。该方法是一种强大的工具，可用于在活体成像实验中识别特定细胞群体内的生物学事件。

理解调控神经细胞群体关键生物学事件（如增殖、分化或细胞命运）的机制……

本实验的总体目标是对多种神经细胞群体进行连续活体成像和单细胞追踪。结合成像后的免疫细胞化学分析，该方法可实现对追踪时间段内发生的任何细胞事件进行分析。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如多种神经细胞群体的细胞行为与谱系发育过程，以及其调控因子的鉴定。活体实时成像与单细胞追踪的主要优势在于，能够监测基于终点分析方法所可能遗漏的细胞生物学变化。本演示将指导研究人员完成一系列主要步骤，这些步骤可轻松适配于任何培养条件和图像采集软件。我是Rosa Gomez，我将演示细胞接种及成像后免疫细胞化学的操作步骤。我是David Agust

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