抗有丝分裂药物多西紫杉醇的前列腺癌细胞模型的建立

抗肿瘤治疗有助于疾病的进展和死亡。确定阻力的机械基础对于改善治疗反应是至关重要的。这份手稿详细的协议, 以产生紫杉抗性细胞模型的前列腺癌 (pc), 以帮助解剖的路径涉及的进展, 多西紫杉醇耐药性的 pc 患者。

该程序的总体目标是生成多西紫杉醇耐药癌细胞实验模型，作为研究驱动抗有丝分裂治疗耐药性的分子机制的平台。这种方法可以帮助回答癌细胞生物学和基因组学领域的关键问题，例如确定导致疾病进展的信号通路，并确定潜在的靶向策略。该技术的主要优点是，除了使用患者肿瘤样本和动物模型外，它还是一种可靠且简单的方法来生成实验模型来研究抗癌药物反应。

演示该程序的是我实验室的博士后 Lisa Mohr 和我们团队的另一位博士后 Jungreem Woo。要开始此过程，请将 DU145 或 22Rv1 细胞接种在含有 20 毫升培养基的 150 厘米见方的烧瓶中。24 小时后，当细胞达到约 70% 至 80% 汇合时，添加 5 纳摩尔的多西紫杉醇。

72 小时后，吸出含药物的培养基，并加入新鲜的不含多西他赛的培养基。每 3 到 4 天更换一次媒体。等待一到两周，直到克隆出现在培养瓶中。

吸出培养基，用 15 mL PBS 小心洗涤细胞，并与 4 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 在 37 摄氏度下孵育 3 至 5 分钟，以将细胞从培养瓶表面分离。然后，使用 8 mL 新鲜培养基从培养瓶中重悬胰蛋白酶消化细胞。从所有处理过的烧瓶中拉出细胞，并通过离心沉淀。

之后，去除 superna-den，将细胞沉淀重悬于 20 毫升新鲜培养基中，并将细胞接种在 150 厘米见方的烧瓶中。24 小时后，当细胞达到约 70% 至 80% 汇合时，再次加入 5 纳摩尔多西他赛。如前所述重复这些过程，直到克隆出现在培养瓶中。

然后再次将细胞接种在 150 厘米见方的烧瓶中。24 小时后，当细胞达到约 70% 至 80% 汇合时，用 10 纳摩尔多西他赛处理它们。以多西紫杉醇剂量递增的方式重复相同的步骤，并在每次浓缩处理后继续合并存活的克隆。

在该过程结束时，您将获得一组抗性细胞，可供实验使用。在此过程中，在 6 孔板中每孔使用 2， 000 毫升培养基对 2， 000 个细胞进行铺板。24 小时后，为 DU145 和 22Rv1 细胞系添加浓度递增的多西紫杉醇。

仅将 DMSO 添加到一个孔中作为对照，体积与最高多西紫杉醇剂量相同。72 小时后，吸出含药物的培养基，并加入新鲜的不含多西他赛的培养基。将板孵育一到两周，直到在显微镜下可以看到菌落。

要对菌落进行染色，请用 2 到 3 毫升 PBS 轻轻洗涤它们。将它们与 2 到 3 毫升结晶紫溶液在组织培养罩或通风橱内孵育 20 分钟。然后，取出静置溶液并用 2 到 3 毫升水清洗板。

然后除去水，风干板。拍摄印版的数字图像以表示图形。通过可视化孔来分析结果，并在记号笔的帮助下手动计数菌落。

并在图表中表示细胞活力的百分比。下图描述了亲本前列腺癌细胞系 DU145 和 22Rv1 中多西紫杉醇 IC50 的测定。此处显示了所需多西紫杉醇剂量递增浓度中细胞活力的预期百分比。

以下是 DU145 和 22Rv1 细胞在多西紫杉醇耐药性产生过程中指定时间的代表性明场显微镜图像。红色箭头表示方案完成后的多西紫杉醇抗性克隆。此处显示的是对应于多西他赛耐药细胞功能验证的代表性集落形成测定。

细胞暴露于增加的多西紫杉醇浓度下，并通过结晶紫染色评估存活率。观看本视频后，您应该对如何生成和验证耐药细胞系有很好的了解，然后这些细胞系可用于您选择的检查和程序，例如基因表达分析和遗传作。感谢您的观看，祝您的实验好运。