Name: 抗有丝分裂药物多西紫杉醇的前列腺癌细胞模型的建立 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-08T12:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 了解建立多西紫杉醇耐药前列腺癌细胞模型的实验方法，使用DU145或22Rv1细胞系进行药物浓度递增筛选。该技术为研究抗肿瘤药物耐药机制提供了可靠平台。

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V.R.-B. 获得美国卫生部的资助 &amp;#38; 人类服务部、美国国立卫生研究院（NIH）、国家癌症研究所资助号 1 K22 CA207458-01，以及 J.D.-D. 获得美国卫生与公共服务部资助 &amp;#38; 人类服务部，美国国立卫生研究院（NIH），国家癌症研究所资助编号 1 R01 CA207311-01。

1. 确定导致集落形成能力下降50%的多西他赛浓度（IC50）
注意：在本实验方案中，多西他赛的IC50浓度是通过克隆形成能力来评估的。也可采用其他方法评估细胞活力（即， MTS检测可根据研究者的偏好选用。
<ol>
	<li>在75 cm2培养瓶中培养DU145或22Rv1细胞，并配制足够量的10 mM多西他赛（溶于DMSO）储备液，供后续实验使用。</li>
	<li>为测定多西他赛的IC50值，将细胞接种前，吸除培养瓶中的培养基，用5 mL PBS轻柔洗涤细胞，随后加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，在37 °C孵育3–5分钟，使细胞从瓶壁脱落。</li>
	<li>用5 mL新鲜培养基冲洗培养瓶以收集消化后的细胞，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，通过离心（300 × g，3分钟，室温（RT））沉淀细胞。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL新鲜培养基中并进行细胞计数。将细胞悬液调整至DU145细胞为2–2.5 × 105 个/mL，22Rv1细胞为4–4.5 × 105 个/mL，用移液器反复吹打混匀后，每孔接种2 mL至两个6孔板的各孔中。</li>
	<li>24小时后，当细胞融合度达到70–80%时，向各孔分别加入浓度递增的多西他赛溶液：1 nM、2.5 nM、5 nM、10 nM、25 nM、50 nM、100 nM、250 nM、500 nM和1000 nM。对照孔中加入与多西他赛处理组所用最大体积相同的DMSO（图2A）。</li>
	<li>72小时后，吸除含药培养基，每孔加入2 mL新鲜培养基。大约4–5天后，细胞培养板即可用于染色。</li>
	<li>染色前，用2–3 mL PBS轻柔洗涤细胞克隆，然后在生物安全柜或通风橱内加入2–3 mL结晶紫染色液（0.1% w/v溶于10%甲醛），孵育20分钟。</li>
	<li>移除染色液，用2–3 mL H2O洗涤培养板，弃去H2O后将培养板自然晾干。</li>
	<li>通过观察各孔情况分析结果，确定使细胞活力降低50%（IC50）的多西他赛浓度。借助记号笔手动计数克隆（避免重复计数），并将细胞活力百分比绘制成图（图2A）。最后，拍摄培养板的数码图像用于图示展示（如图3A所示）。</li>
</ol>
2. 多西他赛耐药性前列腺癌细胞的制备
注意：使用与IC50药物浓度测定相同的多西他赛溶液原液进行细胞处理（需提前配制足够量的原液用于实验）。务必保留上一步骤中的少量细胞培养瓶，以防实验过程中出现异常情况。在整个实验过程中，应平行培养亲本细胞，并用相应体积的溶剂（DMSO）处理，模拟多西他赛处理组所使用的溶剂用量。
<ol>
	<li>将DU145或22Rv1细胞接种于含有20 mL培养基的150 cm2培养瓶中（每个培养瓶接种DU145细胞3.5 × 106个，22Rv1细胞6.5 × 106个）。建议使用10至20个培养瓶，以确保在实验结束时获得足够数量的细胞。</li>
	<li>24小时后，当细胞融合度达到约70–80%时（图2B，多西他赛处理前），加入步骤1中确定的IC50浓度的多西他赛（本实验方案所述细胞的IC50浓度为5 nM）。</li>
	<li>72小时后，吸除含药培养基，更换为新鲜的不含多西他赛的培养基（图2B，多西他赛处理后72小时）。每3–4天更换一次培养基。大约在1–2周内，可在显微镜下观察到耐药克隆的出现（图2B，多西他赛处理后7天和14天）。</li>
	<li>吸除培养基，用15 mL PBS小心洗涤细胞，然后加入4 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，在37 °C孵育3–5分钟，使细胞从培养瓶表面脱落。</li>
	<li>用8 mL新鲜培养基重悬消化后的细胞，并合并所有处理组培养瓶中的细胞。通过离心（300 × g，3分钟，室温）收集细胞。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于20 mL新鲜培养基中，接种至150 cm2培养瓶中（每个培养瓶接种DU145细胞3.5 × 106个，22Rv1细胞6.5 × 106个）。</li>
	<li>24小时后，当细胞融合度达到约70–80%时，再次加入5 nM多西他赛（初始IC50浓度）。</li>
	<li>在第3天重复步骤2.3至2.6。</li>
	<li>24小时后，当细胞融合度达到约70–80%时，用2倍IC50浓度的多西他赛（本实验方案所述细胞为10 nM）处理细胞。</li>
	<li>重复步骤2.3至2.8，逐步递增多西他赛浓度（25 nM、50 nM、100 nM和250 nM），以获得在最终最高浓度下稳定生长的细胞群体。对于更高浓度，可将剂量递增方案持续实施长达6个月，直至达到1,000 nM浓度（图1A）。</li>
</ol>
3. 通过克隆形成实验对获得性多西他赛耐药性进行功能表征
注意：在本方案中，化学抗性通过集落形成实验进行评估。用于评估细胞活力的其他方法（即， MTS检测可根据研究者的偏好选用。
<ol>
	<li>在6孔板中每孔接种2,000个细胞（DU145或22Rv1，包括亲本株和多西他赛耐药株），每孔加入2 mL培养基。</li>
	<li>24小时后，向DU145和22Rv1细胞系中分别加入浓度递增的多西他赛（亲本细胞：0.25、0.5、1、2.5和5 nM；耐药细胞：50、125、250、500和1,000 nM）。在其中一个孔中仅加入与最高多西他赛剂量等体积的DMSO作为对照。</li>
	<li>72小时后，吸除含药物的培养基，加入新鲜的不含多西他赛的培养基。</li>
	<li>将培养皿孵育1-2周，直至在显微镜下可见菌落。</li>
	<li>为染色菌落，用2-3 mL PBS轻轻洗涤，然后在组织培养罩或通风橱内加入2-3 mL结晶紫溶液（0.1% w/v，溶于10%甲醛），孵育20分钟。</li>
	<li>去除染色液，用 2–3 mL H2O，去除 H2O 和空气干燥平板。</li>
	<li>通过观察孔板并借助记号笔手动计数菌落（以避免重复计数），分析结果，并以图表形式表示细胞存活率的百分比。拍摄培养板的数字图像用于图示展示。图3A).</li>
</ol>
4. 通过qRT-PCR分析对获得性多西他赛耐药表型进行表型表征
注意：与亲本细胞系相比，多西他赛耐药（DR）细胞表现出不同的表达谱28,29。因此，可通过使用特异性标志物引物进行qRT-PCR来验证筛选的成功（引物序列参见材料部分；详细信息参见结果部分），建议从第三轮筛选后开始，每轮筛选后均进行该检测。此外，也可通过Western blotting对多西他赛耐药表型进行评估。
<ol>
	<li>使用RNA提取试剂盒并按照制造商说明书（详见材料表中的试剂）从亲代细胞和多西他赛耐药细胞中提取RNA。建议使用至少1-2 × 106个细胞。</li>
	<li>使用分光光度计在260 nm处测定RNA浓度。为保证最佳纯度，260 nm/280 nm吸光度比值应接近2.0。</li>
	<li>使用逆转录试剂盒并按照制造商说明书（详见材料表中的试剂），以1 µg RNA在20 µL反应体系中进行逆转录，获得互补DNA（cDNA）。（若需要更多cDNA，可相应扩大反应体系。）</li>
	<li>为每个目的基因设置三个重复，进行qPCR反应，体系如下： 
	- 2 µL 10 µM 正向引物 
	- 2 µL 10 µM 反向引物 
	- 10 µL SYBR Green PCR主混合液 
	- 5 µL H2O 
	- 1 µL 第4.3步中制备的新cDNA。 
	注：本方案所用引物序列见材料表。</li>
	<li>设置PCR程序如下： 
	- 95 °C 15 min 
	- 94 °C 30 s     | 
	- 56 °C 40 s     |&#160;40次 
	- 72 °C 30 s     |</li>
	<li>为分析qPCR结果并确定亲代细胞与耐药（DR）样本之间基因表达的变化，每个目的基因的循环阈值（Ct）均设三个重复，其平均值相对于内参对照（Actin的三个重复平均值）进行归一化处理，得到DR样本的Ct值（Ct DR）和亲代细胞的Ct值（Ct 亲代）。将亲代细胞的数值归一化为1，计算ΔCt（Ct DR - Ct 亲代），以获得最终mRNA的表达倍数变化，并用图形表示。表达倍数变化大于&#62;2或小于&#60;0.5被视为具有显著性，表明多西他赛获得性耐药表型的成功建立（图3B）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在本研究中，我们描述了一种建立多西他赛耐药性前列腺癌细胞模型系统的方法，可用于研究导致化疗耐药表型获得的机制。尽管该方法具有高度的可靠性和可重复性，但仍需考虑一些潜在的局限性。由于仅有细胞群体中的一小部分会表现出化疗耐药性28，因此建议起始时使用大量细胞（我们通常接种20个150 cm2的培养瓶，约含1.2 × 108个细胞）。为确保实验成功，需重点关注本方案中的几个关键步骤。首先，长期使用时必须采用同一批次新配制的多西他赛储备液（10 mM的储备液分装后若妥善保存于-80 °C，可使用多年）。多西他赛分装液的微小变化可能影响IC50值、细胞系建立所需时间以及克隆形成实验结果。其次，由于使用新批次细胞时可能出现差异，因此必须在每个独立细胞系中重新测定其IC50值。第三，必须通过频繁在显微镜下观察细胞来监测药物处理是否有效，以便及时发现并纠正任何错误。最后，我们建议始终保存中间阶段的细胞储备，以防污染或出现其他意外问题，从而影响实验过程中细胞的存活率。重要的是，本方案旨在通过将前列腺癌细胞暴露于高剂量多西他赛72小时，随后进行长时间恢复，来建立耐药模型，而非采用较低的持续药物浓度，目的是尽可能模拟目前报道中该紫杉烷类药物治疗前列腺癌的最佳临床情境15,16。
此外，应注意的是，耐药细胞具有高度可塑性，这可能导致其获得的耐药特性随着时间推移而逐渐丧失。因此，不建议将这些细胞在培养中持续使用超过2-3个月。如果需要长期供应，建议持续制备新的耐药细胞批次。然而，若细胞批次已长时间培养，可通过集落形成实验和qPCR重新评估其耐药性。另一种方法是通过使用高剂量多西他赛（500-1,000 nM）处理细胞72小时以增强减弱的耐药性。经过一至两周的恢复期后，可通过qPCR和集落形成实验重新检测表型。此外，尽管不推荐，也可将处理后的细胞分装后保存于液氮中（含FBS和10% DMSO）。请注意，在经历冻融循环后，必须使用上述方法重新评估化学耐药表型。
尽管存在这些局限性，我们28,29 及其他研究者30,31,32,33 仍成功利用这些模型系统，鉴定出导致多西他赛耐药细胞中肿瘤起始能力增强、细胞存活率提高及侵袭性增加的关键新型细胞与分子机制。通过使用这些癌症细胞模型系统，我们发现表现出未分化表型的细胞——其特征为缺乏上皮和前列腺相关分化标志物，并且可靶向的发育相关信号通路（Notch 和 Hedgehog）过度表达——能够在化疗药物暴露条件下存活28。在另一项研究中，结合这些模型与公开可用的患者基因数据集24,25，我们发现先锋转录因子 GATA2 在转移性去势抵抗性化疗耐药前列腺癌细胞中高度过表达。GATA2 通过直接激活依赖 IGF2 的下游激酶信号网络，提高细胞存活能力29。值得注意的是，这些研究有助于揭示 GATA2 在晚期转移性前列腺癌侵袭性中的若干新型关键作用34。
耐药性的产生并不仅限于多西他赛和前列腺癌，这一问题在使用多种化疗药物治疗的其他许多癌症类型中也普遍存在。事实上，类似的实验模型可及性限制也同样存在，因此可以设想，我们的方案可被调整用于研究其他癌症类型及其相应的化疗耐药机制。
按照本方案所述生成的多西他赛耐药细胞可作为一种功能性工具，用于鉴定化疗耐药相关的新型分子和细胞机制。这为发现新的治疗靶点开辟了道路，有望以此推动针对高度恶性前列腺癌的新疗法研发，进一步拓展我们对这种疾病及其患者治疗手段的认知边界。

由于细胞周期调控失常导致增殖速率加快是癌症的一个显著特征1。这一功能特性使得癌细胞对S期和M期关键细胞周期过程的保真度具有独特依赖性，从而&#160;推动了多种干扰细胞周期药物的研发，这些药物可诱导DNA损伤或有丝分裂缺陷。尽管目前已有大量抗有丝分裂药物（如有丝分裂激酶或运动蛋白抑制剂）正在开发并处于临床试验阶段，但传统的微管靶向药物（MTAs）仍是临床上唯一获批用于靶向癌症有丝分裂的治疗手段2,3,4。MTAs可通过破坏微管结构（如长春碱、长春新碱、长春瑞滨）或稳定微管结构（如紫杉烷类药物紫杉醇、多西他赛或卡巴他赛）来阻止功能性有丝分裂纺锤体的形成5,6。这些药物可激活纺锤体组装检查点7,8，导致培养细胞发生持续的有丝分裂阻滞并最终死亡9,10，同时在肿瘤组织中引发有丝分裂缺陷11,12，因此被广泛用于治疗多种癌症，包括前列腺癌13。
前列腺癌是男性中最常被诊断出的癌症，也是男性癌症相关死亡的主要原因之一14。抗有丝分裂药物（如多西他赛）可提高前列腺癌患者的生存率，是该疾病治疗的主要手段15,16,17。然而，尽管最初可使肿瘤缩小，肿瘤细胞在治疗过程中仍常产生耐药性。多种细胞机制被认为与化疗耐药性的产生有关，包括凋亡和炎症通路的失调，或药物外排泵（如ATP结合盒转运蛋白P-糖蛋白（P-gp/ABCB1））的激活或过表达，后者导致化疗药物被排出细胞外18,19。紫杉烷类药物的耐药性还与其他因素相关，例如微管蛋白异构体表达的改变或微管蛋白突变，这些变化阻碍了药物与其靶点的相互作用20,21。此外，耐药性还与基因组不稳定性积累和肿瘤异质性有关22,23。然而，导致紫杉烷类耐药的机制尚未完全阐明，这一点从目前尚无能够预防其出现的治疗策略即可看出&#160;。因此，迫切需要建立实验模型，以帮助解析这些机制，并识别出能够防止对这些药物产生耐药性的新型治疗策略。
本文介绍一种可生成多西他赛耐药（DR）前列腺癌细胞的方法&#160;。我们还将进一步描述如何利用集落形成实验和定量RT-PCR验证这些细胞的耐药状态。通过该方法获得的细胞具有诸多优势，能够重现公共人类肿瘤样本数据库中发现的多种分子特征，同时具备比肿瘤样本更广泛的实验灵活性，可支持长期进行多种类型的实验分析。这些治疗耐药性癌症模型可在组织培养中长期扩增，除其他用途外，还可进行遗传操作、显微镜成像观察以及基因表达分析。此外，它们还可移植至小鼠体内，以进一步研究其在活体（in vivo）条件下的肿瘤形成与生长效应。目前，在前列腺癌背景下研究药物耐药性的主要替代方法是直接分析肿瘤样本。尽管这些样本在获取特定肿瘤的基因表达和突变状态信息方面具有强大能力，但其获取途径往往极为有限，且难以长期维持以进行后续操作和实验分析，而本方案所建立的细胞系则可轻松实现这些操作24,25。重要的是，未来可能出现其他替代方法，例如直接从患者来源构建人源类器官，这将成为本方法的有力补充和替代方案26,27。由于类器官可在三维环境中重现肿瘤在其原始微环境中的特性，因此将成为介于细胞系与人类肿瘤之间的理想模型。然而，本方案所述的实验细胞模型在维持成本上仍更具优势，且适用于更快速的分析。通过研究这些细胞系所获得的结果，可在人类样本和三维培养体系中进行外推和验证。因此，本方案可能对希望研究任何细胞系中化疗耐药机制的研究人员具有吸引力，因为我们的方法可适用于其他药物和癌症类型的研究。本文所述方法操作简便，适用于任何实验室，成本低廉，可用于药物耐药性分子与细胞机制的初步研究。

<table><tbody><tr><td>DU145 细胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-81</td><td></td></tr><tr><td>22Rv1 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2505</td><td></td></tr><tr><td>多西他赛</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1148</td><td>溶于 DMSO（10 mM）</td></tr><tr><td>150 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 组织培养瓶</td><td>Falcon</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>6 孔组织培养板</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素</td></tr><tr><td>Foundation B 胎牛血清</td><td>Gemini</td><td>900208</td><td></td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 反转录 PCR 第一链合成系统</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Invitrogen</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>10% 甲醛溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>qRT-PCR 引物：</td><td>Life technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACTIN R: CTCCTTAATGTCACGCACGAT</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

生成对有丝分裂抑制剂多西他赛耐药的前列腺癌细胞模型

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

微管靶向药物（MTAs）是治疗多种肿瘤的主要手段。然而，化疗药物的获得性耐药是疾病进展的常见机制，也是恶性肿瘤预后判断的关键特征。在前列腺癌（PC）中，对紫杉烷类药物如多西他赛产生耐药性，直接导致治疗失败，并促使疾病进展至致死性阶段，其特征为预后差且死亡率高。尽管该领域已研究数十年，但导致获得性耐药的多种机制尚未完全阐明，因而严重限制了可用于晚期患者的新治疗策略的开发。在本实验方案中，我们描述了构建模拟晚期致死性前列腺癌特征的多西他赛耐药前列腺癌细胞系的方法，这些细胞系可用于研究获得性化疗耐药的发生机制。尽管基于细胞的模型可能存在固有的局限性（例如耐药特性随时间推移而丧失），但通过本方法建立的多西他赛耐药细胞系已在近期研究中成功应用，并为深入理解致死性前列腺癌中获得性化疗耐药的分子机制提供了&#160;重要机会。

本方案将用于建立多西他赛耐药（DR）的前列腺癌细胞。根据方案步骤的示意图（图1A 和 图1B）所示，完成该流程所需时间可能为4至7个月。具体耗时可能因所选细胞系及方案中所述药物浓度范围的不同而有所差异。重要的是，确定每种细胞系的多西他赛IC50浓度，有助于为所选细胞设计本方案中递增药物浓度的范围（图2A）。一旦启动方案，可在不同时间点于显微镜下观察多西他赛对DU145和22Rv1细胞的初步效应，以监测方案是否正常进行。建议用于监测多西他赛处理过程的时间点包括：多西他赛暴露前（基线）、暴露72小时后、7天后及14天后。需注意，仅有少数肿瘤细胞在多西他赛处理后存活并形成克隆，这些克隆可在显微镜下观察到（图2B）。
亲代细胞及新建立的多西他赛耐药（DR）细胞的代表性克隆形成实验结果与定量图示如下所示 图 3A请注意，所获得的多西他赛耐药细胞可在比亲本细胞高1,000倍的药物浓度下存活。
最后，可通过qRT-PCR验证多西他赛耐药表型（图3B）。需要注意的是，与亲本细胞相比，多西他赛耐药细胞表现出ABCB1和GATA2的特征性上调，以及CK19和CDH1的下调。选择这些基因进行验证，是因为我们在先前已发表的研究中已通过实验验证，在两种耐药细胞模型中均存在GATA2的上调以及CK19和CDH1的下调28,29。ABCB1基因也被选为标志性基因，已有文献报道该基因在耐药细胞中持续上调18,19。然而，需要强调的是，研究者可根据文献报道，并结合所使用的细胞模型及诱导耐药性的药物，选择其他相关基因进行验证。
<img alt="前列腺癌细胞中多西他赛耐药性、时间线图示、细胞活力、qRT-PCR结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：多西他赛耐药性前列腺癌细胞模型建立的时间线。（A）建立多西他赛耐药性细胞模型的实验方案时间线示意图。图示显示了多西他赛处理、验证步骤以及各阶段所需时间。（B）方案验证步骤的示意图，包括亲本细胞和多西他赛耐药细胞在指定浓度多西他赛处理72小时（以红色表示）后的功能性克隆形成实验，克隆百分比的代表性图表以及用于表型验证的qRT-PCR结果。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞活力IC50分析；多西他赛处理DU145、22Rv1；显微镜结果，耐药克隆。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2：多西他赛耐药前列腺癌细胞模型系统的建立。（A）示意图显示在亲代前列腺癌细胞系DU145和22Rv1中测定多西他赛IC50的过程（方案步骤1）。图中包含预期的细胞活力百分比以及所需的多西他赛剂量递增浓度。代表性DU145和22Rv1细胞活力曲线显示，在多西他赛处理72小时后，IC50为5 nM。实验重复三次，数据表示为均值±标准差。（B）在建立多西他赛耐药性的过程中（方案步骤2），于指定时间点拍摄的DU145和22Rv1细胞的代表性明场显微镜图像。红色箭头指示完成方案后出现的多西他赛耐药克隆。比例尺 = 50 nm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="癌细胞对多西他赛的反应；克隆形成实验、耐药性分析、药物浓度效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：多西他赛耐药细胞模型的功能与表型特征分析。（A）亲本细胞和多西他赛耐药细胞在指定浓度多西他赛处理72小时后的代表性克隆形成实验结果。图中曲线表示各处理浓度下的克隆百分比。实验设三个重复，数据以均值±标准差表示。比例尺 = 5 mm。（B）通过qRT-PCR检测ABCB1、GATA2、CK19和CDH1的耐药细胞/亲本细胞相对mRNA表达倍数增加量。所有qPCR原始数据均以肌动蛋白（Actin）为内参进行标准化（详见实验方案）。实验设三个重复，数据以均值±标准差表示。*p &lt;0.05。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

对癌症治疗的耐药性是导致疾病进展和死亡的重要原因。明确耐药的分子机制对于提高治疗效果至关重要。本文详细描述了一种建立前列腺癌（PC）紫杉烷类耐药细胞模型的实验方案，以帮助解析PC患者进展为多西他赛耐药过程中所涉及的分子通路。

微管靶向药物（MTAs）是治疗多种肿瘤的主要手段。然而，化疗药物的获得性耐药是一个……

本实验的总体目标是建立多西他赛耐药的癌细胞实验模型，作为研究驱动抗有丝分裂治疗耐药性的分子机制的平台。该方法有助于回答癌症细胞生物学和基因组学领域中的关键问题，例如鉴定参与疾病进展的信号通路，以及确定潜在的可靶向治疗策略。该技术的主要优势在于，它是一种可靠且简便的方法，可用于生成研究抗癌药物反应的实验模型，而无需依赖患者肿瘤样本或动物模型。本实验操作将由我实验室的博士后 Lisa Mohr 以及团队中的另一位博士后 Jungreem Woo 进行示范。开始实验时，将 DU145 或 22Rv1 细胞接种于含有 20 毫升培养基的 150 平方厘米培养瓶中。24 小时后，当细胞融合度达到约 70% 至 80% 时，加入浓度为 5 纳摩尔的多西他赛。72 小时后，吸除含药物的培养基，加入新鲜的不含多西他赛的培养基。每三到四天更换一次培养基。等待一到两周，直至培养瓶中出现克隆。吸去培养基，用15毫升PBS小心洗涤细胞，然后在37摄氏度下加入4毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA孵育3至5分钟，使细胞从培养瓶表面脱落。随后，用8毫升新鲜培养基重悬消化后的细胞。收集所有处理过的培养瓶中的细胞，通过离心形成细胞沉淀。随后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 20 毫升新鲜培养基中，并将细胞接种至 150 平方厘米的培养瓶中。24 小时后，当细胞融合度达到约 70% 至 80% 时，再次加入 5 纳摩尔的多西他赛。重复前述步骤，直至培养瓶中出现克隆。然后再次将细胞接种至150平方厘米的培养瓶中。24小时后，当细胞融合度达到约70%至80%时，用10纳摩尔的多西他赛处理细胞。以多西他赛剂量递增的方式重复相同步骤，并在每次浓度处理后持续收集存活的克隆。该过程结束时，您将获得一池可用于实验的耐药细胞。在此步骤中，使用六孔板，每孔加入2毫升培养基，接种2,000个细胞。24小时后，对DU145和22Rv1细胞系分别加入浓度递增的多西他赛。仅向一个孔中加入与最高剂量多西他赛相同体积的DMSO作为对照。72小时后，吸除含药物的培养基，加入新鲜的不含多西他赛的培养基。将培养板继续孵育一至两周，直至在显微镜下可见克隆形成。为染色菌落，先用两到三毫升 PBS 轻轻冲洗。然后在组织培养罩或通风橱内，加入两到三毫升结晶紫溶液，孵育 20 分钟。随后弃去染色液，用两到三毫升水冲洗培养板。然后去除水分，将平板风干。拍摄平板的数字图像用于图示。通过观察各孔并借助记号笔手动计数菌落，对结果进行分析。并在图表中表示细胞活力的百分比。下图展示了在亲本前列腺癌细胞系DU145和22Rv1中测定多西他赛IC50的结果。此处显示了在多西他赛剂量递增浓度下所需的细胞活力预期百分比。以下是生成多西他赛耐药性的过程中，在指定时间点拍摄的 DU145 和 22Rv1 细胞的代表性明场显微镜图像。红色箭头指示完成方案后获得的多西他赛耐药克隆。图中显示的是与多西他赛耐药细胞功能验证相对应的代表性克隆形成实验结果。细胞经不同浓度的多西他赛处理后，通过结晶紫染色评估其存活率。观看本视频后，您应能充分掌握如何建立并验证耐药细胞系，随后可将其用于基因表达分析、基因操作等自选的检测与实验。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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