核素荧光报告基因成像在啮齿动物肿瘤模型中跟踪肿瘤进展

该协议的总体目标是通过成像跟踪活啮齿动物的肿瘤生长和转移。放射性核素荧光融合报告基因允许通过正电子发射断层扫描进行无创体内检测，荧光团有助于离体确认结果。每当需要长时间跟踪活体动物的细胞时，这种方法可以帮助回答关键问题。

它有助于了解远处转移和治疗对肿瘤进展的影响。所描述的技术是使用自动合成产生的 PET 示踪剂通过高灵敏度和非侵入性体内成像来追踪癌细胞。与传统方法相比，它显著减少了动物的使用。

刚接触这种方法的人可能会对其复杂性感到不知所措。特别是 PET 放射性示踪剂的自动合成大大简化了这一过程。我们相信这种方法的视觉演示展示了关键成像相关步骤的这些视图。

这项技术的影响延伸到新疗法的临床前测试，这些疗法也可以与癌细胞一起追踪。这种方法可以提供对癌症生物学和治疗方法开发的见解。每当对某个种群的体内定位、重新定位、扩增和长期监测感兴趣时。

首先，使用报告基因质粒，生成慢病毒颗粒，转导细胞并对其进行表征。然后通过在表达 NISFP 的细胞系中摄取放射性示踪剂来分析报告基因功能。将纯化的细胞和生长培养基接种在 6 孔板中，确保所有样品一式三份制备。

第二天早上，用无血清生长培养基洗涤细胞，并将板与 50 公斤贝克勒尔 F18 四氟硼酸盐在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。然后收集上清液并将 100 微升转移到预先标记的收集管中。丢弃剩余的上清液，然后用一毫升含有生理水平钙和镁的冰冷 PVS 洗涤细胞。

收集洗涤液并将 100 微升洗涤液转移到预先标记的收集管中。然后再次重复洗涤过程。添加 500 微升含有胰蛋白酶和 EDTA 的 PVS 以提升细胞。

在 37 摄氏度下孵育样品，直到细胞分离，使用显微镜检查是否分离。然后将细胞悬液转移到标记的收集管中。接下来，将细胞样品在 4 摄氏度下以 250 G 离心 4 分钟。

使用自动 Gamma 计数器对四种样品类型中的每一种样品进行计数，并使用公式 1 获得摄取百分比。要开始 F18 四氟硼酸盐合成，请在适当的化学罩中设置自动无线电合成平台，并确保将正确的 XML 文件加载到控制计算机上。当合成器运行时，将产生 F18 四呃硼酸盐，然后在阴离子交换柱上纯化。

阴离子交换柱将用水冲洗，然后用氮气干燥。最终产品来自含有 1 毫升 0.9% 氯化钠的阴离子交换柱，并通过出口管路转移到玻璃收集瓶中。要开始成像，请根据书面方案麻醉和准备小鼠。

然后使用无菌 0.9% 盐水将 F18 四氟硼酸盐溶液稀释至每 50 微升 5 兆贝克勒尔。使用带有皮下注射针头的注射器抽取 100 μL F18 四氟硼酸盐溶液。测量注射器中的放射性并记录测量值和测量时间。

50 微升 F18 四氟硼酸盐溶液静脉注射到预热的尾部中。然后测量注射器中剩余的放射性，并记录测量的值和时间。放射性示踪剂的尾静脉注射至关重要。

我们在动物麻醉下进行，以最大限度地降低错误注射和放射性示踪剂溢出的风险。动物一直处于麻醉状态，直到 PET 图像采集开始。正好在放射性示踪剂注射后 45 分钟。

接下来，设置一个计时器从 45 分钟开始倒计时，并确保鼠标位于桌子上的胸骨位置。安装适当的手术监测仪器并确保仪器正常工作，然后再继续。然后，设置 CT 成像和 PET 图像采集的测度计。

当倒数计时器读数为 15 分钟时，开始 CT 图像采集，当计时器读数为 0 分钟时，开始 PET 图像采集。首先测量整个安乐死小鼠的放射性，并记录测量的值和时间。然后解剖小鼠并收获必要的组织。

测量带尾和不带尾巴的剩余胴体的放射性。记录这些值并记录测量时间。接下来，单独称重所有收获的组织，并在日光和荧光下拍摄癌器官的照片。

然后，将组织包埋到 OCT 中用于下游组织学。测量所有收获组织的放射性，记录该值并记下测量时间。最后，将数据表示为标准摄取值或 SUV，如公式 2 中所述。

在本实验中，放射性核素荧光记录仪基因成像用于跟踪啮齿动物肿瘤模型中的肿瘤进展。共聚焦荧光显微镜证明了 NISFP 的质膜定位准确。使用提供的放射性示踪剂摄取的 NIS 量化 NISFP 功能和特异性。

NIS 表达水平相似的 4T1NISGFP 和 4T1NISRFP 表达细胞系之间没有发现显著差异。重要的是，在所有细胞系中，预氯酸盐块证明获得的放射性示踪剂摄取是由于特异性 NISFP 表达。荷瘤动物的全身 PET 成像揭示了肿瘤进展和转移扩散的信息。

此处显示的示例显示肺中广泛长转移和几个不同的结节。注射剂量值百分比和肺部单个转移的占用体积各不相同。然而，体积标准化注射剂量百分比值在相似范围内。

双模式报告基因中的荧光蛋白能够在动物解剖过程中在荧光光下鉴定癌组织。随后的离体放射性示踪剂生物分布显示放射性示踪剂摄取量高的器官，因此表达 NIS 的组织。虽然甲状腺和唾液腺以及胃都本土表达 NIS，但所有其他阳性信号都表明癌组织，例如肿瘤和转移。

放射性核素荧光报告基因还可以识别下游组织切片中的癌细胞。这项技术为癌症领域的研究人员可视化自发性转移的过程并测试药物如何影响它铺平了道路。在尝试此程序时，请务必提前仔细计划所有步骤。

必须建立细胞系，建立动物肿瘤模型，并且必须在要求的日期提供所有用于成像的试剂和设备。我们建议从小型试点实验开始。一旦掌握，如果作得当，可以在 8 小时的工作日内对 6 只动物进行放射性示踪剂生产和体内动物成像。

观看此视频后，您应该对如何使用放射性核素报告基因 NIS 结合荧光蛋白进行体内细胞追踪的报告基因有一个很好的了解。您还应该能够表征表达 NISFP 报告基因的细胞系，以产生用于体内成像所需的 PET 放射性示踪剂，并通过分布实验进行体内和离体实验。按照此程序，可以执行其他方法，如荧光细胞术，以回答其他问题。

例如，肿瘤及其转移的免疫细胞谱如何相互关联或随时间变化。不要忘记确保您生产的细胞系不含微质粒，因为据报道微质粒会影响结果。重要的是，不要忘记使用放射性同位素可能非常危险，在执行此程序时必须始终优先考虑保护自己和他人。