Name: 小鼠肾小球疾病模型肾脏功能的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学习小鼠肾小球疾病模型的肾脏功能评估方法，包括尿白蛋白肌酐比检测、组织学分析和肾小球分离技术。该方案适用于多种肾小球疾病模型，为研究肾脏病理机制提供标准化流程。

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本工作由英国心脏基金会、理查德·布莱特VEGF研究信托基金以及英国医学研究理事会（MRC）资助。

<ol><li>Humtstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+structural+kidney+damage+in+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats.</a> Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).</li>
<li>Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+diabetic+nephropathy%3A+their+utility+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nephrology+and+Renovascular+Disease%22%5BJournal%5D)">Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.</a> International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).</li>
<li>Tesch, G. H., Lim, A. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21147843">Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).</li>
<li>Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+FSGS%3A+lessons+for+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment.</a> Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).</li>
<li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28574576">VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney.</a> Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).</li>
<li>Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+a+mouse+model+to+study+the+molecular+pathobiology+of+Alport+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kindey+International%22%5BJournal%5D)">Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis.</a> Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).</li>
<li>Kujal, P., Vernerova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%2F6+nephrectomy+as+an+experimental+model+of+chronic+renal+failure+and+adaptation+to+reduced+nephron+number%5BTitle%5D)+AND+%22Ceskoslenska+Fysiologuie%22%5BJournal%5D)">5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number.</a> Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).</li>
<li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li>
<li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF165b+overexpression+restores+normal+glomerular+water+permeability+in+VEGF164-overexpressing+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).</li>
<li>Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+increases+the+ultrafiltration+coefficient+in+isolated+intact+Wistar+rat+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli.</a> Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).</li>
<li>Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+differences+rather+than+hyperglycemia+determine+the+severity+of+glomerulosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice.</a> Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).</li>
<li>Betz, B., Conway, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+use+of+animal+models+in+diabetic+nephropathy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research.</a> Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).</li>
<li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li>
<li>Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+glomeruli+by+electron+microscopy+reveals+a+distinct+restrictive+urinary+subpodocyte+space%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medicine+%26+Science%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li>
<li>Adembri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+induces+albuminuria+and+alterations+in+the+glomerular+filtration+barrier%3A+a+morphofunctional+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat.</a> Critical Care. 15 (6), R277(2011).</li>
<li>Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+arctiin+on+glomerular+filtration+barrier+damage+in+STZ-induced+diabetic+nephropathy+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Phytotherapy+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats.</a> Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).</li>
<li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor-A165b+is+protective+and+restores+endothelial+glycocalyx+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte-specific+overexpression+of+GLUT1+surprisingly+reduces+mesangial+matric+expansion+in+diabetic+nephropathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种针对肾小球疾病小鼠模型的完整肾脏检查方法，可从单只小鼠中获取大量关于肾脏及肾小球功能的信息。每种方法中的关键步骤均可实现对肾小球功能的详细功能、结构和机制分析，包括整体肾脏通透性评估（尿白蛋白/肌酐比值uACR和血浆肌酐测定）、单个肾小球通透性检测（肾小球LpA/Vi）、结构改变检查（PAS染色、三色蓝染色和电镜EM）、蛋白质定位分析（免疫荧光IF）以及肾小球基因表达检测（RT-PCR和Western blotting）。这些方法对于在肾脏疾病小鼠模型中全面评估肾小球功能至关重要。
在评估肾小球滤过屏障（GFB）通透性时，许多研究选择使用传统的尿白蛋白肌酐比（uACR）或24小时白蛋白排泄率作为有效的评估指标17,18。尽管这些方法能够整体评估GFB的通透性，但无法实现对单个肾小球通透性的分别测定，也无法反映不同肾小球之间的差异。先前的研究发现，测定肾小球LpA/Vi是检测GFB通透性变化更为敏感的指标5,9。事实上，本文展示的代表性结果表明，在诱导VEGF-A基因敲除（KO）14周后，VEGF-A KO × Neph-VEGF-A165b小鼠的uACR显著低于VEGF-A KO小鼠；然而，这一结果并未在肾小球LpA/Vi的测定中得到体现，在后者中VEGF-A165b并未显著阻止GFB通透性的升高（图1 和 图2）5。这表明使用多种检测方法同时评估肾脏整体通透性及单个肾小球通透性的重要性。此外，肾小球LpA/Vi肿瘤计量测定法提示，同一肾脏内不同肾小球的通透性可能存在显著差异，尤其是在疾病模型中5,10,19。测量肾小球LpA/Vi的一个局限性在于，该操作仅能在实验终点进行；因此，需要定期检测uACR以判断合适的实验终点。
除了评估功能表型外，本方法还建议对结构和超微结构表型进行评估。这可以通过一系列染色方法实现，例如PAS染色、三色染色和银染色，每种染色用于评估肾小球形态的不同方面。在肾小球疾病的急性模型中（小鼠模型通常属于此类），除非由经过训练的肾脏病理学家进行判读，否则使用这些染色方法往往难以检测到明显的结构异常。因此，建议进行电镜（EM）检查以评估肾小球滤过屏障（GFB）的超微结构，从而实现对基底膜（GBM）、内皮细胞窗孔的大小与数量以及足细胞特征等参数的定量测量。此类测量操作所需培训较少，可帮助研究人员确定疾病模型中受影响的细胞类型或结构。在代表性结果所示的示例中，VEGF-A基因敲除（KO）小鼠表现为轻度肾小球疾病模型，因此PAS染色未发现明显结构异常。然而，在观察肾小球超微结构时发现，足细胞特异性VEGF-A基因敲除确实引起了GBM、足细胞及内皮细胞的改变5。遗憾的是，本方法中所述用于电镜的肾脏制备步骤无法检测内皮细胞糖萼，而糖萼已被证实对GFB通透性具有重要影响19。为了准确测量糖萼厚度，应按照Oltean et al19所述方法，使用含1%阿新蓝的2.5%戊二醛对肾脏进行灌注固定，以标记内皮细胞糖萼。
在评估完功能和结构表型后，可进一步特异性地分析肾小球内不同基因和信号通路的表达/活化模式。先前的超微结构评估可提供有关受累细胞类型或肾小球结构的信息，从而提示应检测足细胞特异性还是内皮细胞特异性的基因或通路。例如，在VEGF-A基因敲除小鼠的代表性结果中，观察到内皮窗孔数量减少（图3D）；因此，进一步检测了肾小球中已知参与VEGF-A通路的内皮标志物蛋白表达情况，即VEGFR-2（图4B）5。除了检测肾小球内蛋白的表达水平外，还可通过免疫荧光（IF）技术观察其定位。在Zhang et al20 的一项研究中，通过免疫荧光共定位显示GLUT1与podocin在足细胞中共表达，从而证实了GLUT1在足细胞中的特异性过表达。
与文献中报道的其他评估肾小球功能的方法相比，本文所述方法用于评估肾小球疾病小鼠模型的肾功能，能够从多个方面全面评价肾小球表型。通过该方法，研究人员可确定模型的肾脏表型，并阐明表型产生的机制。在探索这些模型中潜在治疗途径时，了解疾病的机制至关重要。该方法可便捷地应用于未来对肾小球功能的研究，无论是在疾病表型评估还是潜在治疗手段的探索中均具有广泛适用性。
综上所述，这一通用且可调整的实验方案描述了针对肾小球疾病小鼠模型的完整肾脏检查流程，能够从单只小鼠获取大量关于肾脏及肾小球功能的信息。该方法可实现对肾小球功能的详细功能学、结构学和机制性分析，适用于所有肾小球疾病的小鼠模型。

利用小鼠模型模拟人类肾脏疾病正变得越来越普遍。这类小鼠模型包括自发性模型，如自发性高血压大鼠（SHR）1、链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠和小鼠2以及db/db 2型糖尿病小鼠3；基因工程模型，如足细胞特异性的原发性局灶节段性肾小球硬化（FSGS）模型4、足细胞特异性血管内皮生长因子A（VEGF-A）敲除（VEGF-A KO）模型5和Alport综合征模型6；以及获得性模型，如5/6肾切除模型7和单侧输尿管梗阻（UUO）模型8。为了评估这些模型中肾小球功能的不同方面，已有多种技术可供使用。本文方法学论文的目的是展示在肾脏疾病小鼠模型中应进行的一套全面检测流程，以充分评估肾小球功能。
采用该方法的原理在于，能够从多个方面全面评估肾小球表型，包括评估肾小球对蛋白质和水的通透性、肾小球结构异常，以及对维持正常肾小球功能至关重要的mRNA和蛋白质表达/剪接的变化。通过使用该方法，研究人员能够确定模型的肾脏表型，并阐明表型形成的机制。这些信息对于理解疾病机制至关重要，而在利用这些模型探索潜在治疗途径时，必须掌握此类机制信息。
在文献中，常会遇到以尿液中白蛋白水平升高来确定表型的肾小球疾病小鼠模型。然而，有证据表明，仅用单一方法评估肾小球功能并不总是有效的；测定尿白蛋白排泄率或尿白蛋白肌酐比值（uACR）仅能提供关于整体肾功能的信息，而无法反映单个肾小球的情况。既往研究已表明，同一肾脏中不同肾小球的通透性可能存在差异5,9,10。此外，对单个肾小球通透性的评估是检测肾小球功能更为敏感的方法；测量单个肾小球水通透性（LpA/Vi）的技术已被证明比测定uACR对肾小球功能变化更为敏感9。该检测方法在对蛋白尿具有抵抗性的小鼠模型中尤为有益，例如c57BL/6背景的小鼠模型11。本方法学论文的优势在于，同时考察了肾脏整体对白蛋白的通透性以及单个肾小球对水的通透性。
肾小球结构异常的检测通常需采用一系列染色方法，如过碘酸-雪夫（Periodic Acid Schiff, PAS）染色、三色染色和银染法。这些方法可使训练有素的肾脏病理学家通过评分系统评估肾脏疾病的严重程度。尽管上述方法均较为可靠，但在急性肾损伤模型中，并不总是能观察到肾小球大体结构的改变12。本方法建议，在实施上述肾脏组织学技术的同时，还应通过透射电子显微镜（electron microscopy, EM）评估肾小球的超微结构。在普通光学显微镜下，染色后的肾小球可能看起来相对正常；然而，通过电子显微镜观察，可分析肾小球基底膜（GBM）厚度、足细胞足突融合情况、内皮细胞窗孔结构以及足细胞下腔隙覆盖程度的细微变化。因此，为明确肾小球功能障碍的机制，同时评估肾小球的超微结构与显微结构至关重要。
除了评估肾小球结构异常外，还应检测 mRNA 和蛋白质表达及剪接的变化，以及蛋白质的活化（例如，磷酸化），以进一步阐明肾小球疾病的发病机制。在研究肾小球疾病时，或例如在肾小球细胞中特异性敲除或过表达某个基因时（如足细胞特异性 VEGF-A 基因敲除小鼠5），重要的是仅在肾小球细胞内检测蛋白质和 mRNA 的变化，而非整个肾脏。本方案描述了一种从小鼠肾脏皮质中分离肾小球，再从中提取蛋白质和 RNA 的方法。这使得能够特异性分析疾病模型中肾小球内蛋白质和 mRNA 的异常调控。
本方案描述了一种针对肾小球疾病小鼠模型的完整肾脏检查方法，可从单只小鼠中获取大量关于肾脏及肾小球功能的信息。这些方法可用于对肾小球功能进行详细的功能性、结构性和机制性分析，并适用于所有肾小球疾病的小鼠模型。

<table><tbody><tr><td>代谢笼</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-6731</td><td></td></tr><tr><td>Tris缓冲盐水（10倍浓缩液）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>小鼠白蛋白ELISA定量试剂盒</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E90-134</td><td></td></tr><tr><td>TMB ELISA底物溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>SPECTRstar nano</td><td>BMG Labtech</td><td>SPECTRstar nano 或同等产品</td><td></td></tr><tr><td>RNA later稳定溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>4-15%预制蛋白凝胶</td><td>BIORAD</td><td>4568084</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli上样缓冲液</td><td>BIORAD</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot转印槽</td><td>BIORAD</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris电泳缓冲液</td><td>BIORAD</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝染料</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>肌酐检测配套试剂（Creatinine Companion）</td><td>Exocell</td><td>1012 Strip Plate</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>二甲胂酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>10x磷酸盐缓冲液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>EDTA血液采集管</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>23-25G针头</td><td>BD</td><td>PMC0735</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>10 ml玻璃小瓶</td><td>Thomas Scientific</td><td>0914X10</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 ml聚丙烯管</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10110101</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml离心管</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10681894</td><td></td></tr><tr><td>一次性组织包埋模具</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>小鼠外科解剖工具包</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-005-204</td><td></td></tr><tr><td>最佳切片温度介质（OCT）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>4%多聚甲醛</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>EC1 64-0770</td><td></td></tr><tr><td>肾小球通透性测定装置</td><td>布里斯托大学自制——无商业化产品</td><td>LpA装置引用文献：Salmon et al. 2006; J. Physiol</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢筛网</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-59984</td><td></td></tr><tr><td>过碘酸-雪夫（PAS）染色系统</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>MerckMillipore</td><td>108298</td><td></td></tr><tr><td>防脱载玻片</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>封片剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8030</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Aradite树脂</td><td>Agar Scientific</td><td>CY212</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1260A</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸铅</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1210</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>例如 957000H</td><td></td></tr><tr><td>疏水笔</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Nephrin（1243-1256）抗体</td><td>Acris</td><td>BP5030</td><td></td></tr><tr><td>抗Podocin抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0372-200UL</td><td></td></tr><tr><td>抗CD31抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor二抗</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的Vectashield封片剂</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>NP40细胞裂解缓冲液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FNN0021</td><td></td></tr><tr><td>Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78437X4</td><td></td></tr><tr><td>10x转移缓冲液</td><td>BIORAD</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>PVDF膜</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2002</td><td></td></tr><tr><td>HRP标记二抗</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>用于Western blot的ECF底物</td><td>Fisher</td><td>10713387</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV逆转录酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M053S</td><td></td></tr><tr><td>寡聚dT引物</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18418012</td><td></td></tr><tr><td>随机引物</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427088</td><td></td></tr><tr><td>核糖核酸酶抑制剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>DEPC处理水</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J图像分析软件</td><td>Image J</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR扩增仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜（TEM）</td><td>Britannica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

肾小球疾病小鼠模型中肾功能的评估

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

利用小鼠模型模拟人类肾脏疾病正变得越来越普遍。我们的研究重点是评估糖尿病肾病以及足细胞特异性 VEGF-A 基因敲除小鼠的肾小球功能；因此，本方案详细描述了我们实验室用于评估这些肾小球疾病小鼠模型的完整肾脏检测流程，从而能够从单只小鼠中获取大量关于肾脏及肾小球功能的信息。与文献中报道的其他评估肾小球功能的方法相比，本文所述方法可从多个方面全面评估肾小球表型。采用该方法，研究人员可确定模型的肾脏表型，并阐明表型形成的机制。在探索这些模型中潜在治疗途径时，有关疾病机制的此类关键信息至关重要。该方法可通过测定尿白蛋白/肌酐比值和单个肾小球水通透性，对肾小球滤过屏障进行详细的功能评估，同时结合过碘酸-希夫（Periodic Acid Schiff）染色和电子显微镜技术进行结构和超微结构分析。此外，对 mRNA 和蛋白水平上表达异常基因的分析，有助于深入解析肾小球功能的分子机制。本方案概述了一套通用且可灵活调整的方法，适用于所有肾小球疾病的小鼠模型研究。

采用代谢笼收集野生型（WT）、可诱导的足细胞特异性VEGF-A基因敲除（VEGF-A KO）以及VEGF-A KO × Neph-VEGF165b小鼠（在足细胞中持续过表达人源VEGF-A165b亚型的VEGF-A KO小鼠）的尿液。在诱导VEGF-A基因敲除后的第0、4、10和14周检测尿白蛋白/肌酐比值，结果显示，与WT littermate对照组相比，VEGF-A KO小鼠在第10周时已出现进行性白蛋白尿。各组绝对数值见图2A，每只小鼠相对于基线值的归一化数据见图2B。然而，在VEGF-A KO × Neph-VEGF-A165b小鼠中未观察到白蛋白尿（图2），表明VEGF-A165b在此白蛋白尿模型中具有保护作用5。
通过从野生型（WT）、VEGF-A基因敲除（KO）以及VEGF-A与Neph-VEGF-A165b转基因小鼠的肾脏中分离出的单个肾小球，测量了肾小球的LpAVi值。图3A展示了捕获肾小球以及在用8% BSA灌流时观察到的收缩现象的示例。该收缩程度被用于计算每个肾小球的LpA/Vi值（图3B）。在VEGF-KO诱导14周后，VEGF-A KO小鼠的肾小球LpA/Vi值较野生型对照组肾小球显著升高。尽管在VEGF-A与Neph-VEGF-A165b双转基因小鼠中该值有所降低，但在14周时VEGF-A165b的过表达仍未能完全阻止肾小球LpA/Vi值的升高5。
VEGF-A基因敲除诱导14周后对肾皮质切片进行PAS染色，结果显示VEGF-A基因敲除组及VEGF-A X Neph-VEGF-A组均未出现任何肾小球结构异常165b 小鼠（图4A）。然而，通过电镜分析肾小球超微结构发现，VEGF-A基因敲除小鼠的肾小球基底膜增厚、内皮细胞窗孔数量减少、足细胞足突覆盖面积降低，以及足细胞裂孔平均宽度增加（图 4C-4F）。足细胞足突的平均宽度和裂孔数量保持不变（图3B 和 3G）。VEGF-A 的过表达165在VEGF-A基因敲除小鼠中，b可防止肾小球基底膜和裂孔宽度的改变（图 4C 和 4F）。然而，VEGF-A165b 对窗孔数量和 SPS 覆盖率的改变无影响（图 4D 和 4E)5.
对从滤过肾小球中提取的RNA进行RT-PCR分析显示，人源VEGF-A165b mRNA仅存在于VEGF-A基因敲除×Neph-VEGF-A165b转基因小鼠中（图5A）。从滤过肾小球中提取蛋白并经Western blot检测蛋白水平时发现，VEGF-A基因敲除小鼠肾小球中VEGFR-2的蛋白表达降低，而VEGF-A165b的过表达可阻止该下调（图5B和5C）5。
<img alt="微流控装置示意图；细胞捕获、双通道流动、包封过程、注射泵。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图1. 肾小球通透性（LpA）实验装置示意图。 (A) 肾小球被吸附在(B) 固定于支架上的微移液管上，并通过夹具固定在载物台上以保持稳定。(C) 矩形显微载片。(D) 带有摄像机的显微镜4X物镜。(E) 预热至37 °C的1% BSA溶液。(F) 预热至37 °C的8% BSA溶液。(G) 连接两条灌注液管路的远程三通阀，可实现灌注液的快速更换。(H) 灌注液流向微载片的路径，随后灌注液将包围肾小球。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示VEGF-A基因敲除研究中uACR随周数变化的图表；统计数据分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. 尿白蛋白肌酐比值。（A） 在野生型（WT）、VEGF-A基因敲除（KO）以及VEGF-A × Neph-VEGF-A165b小鼠中，诱导VEGF-A基因敲除后第0、4、10和14周的uACR值。（B） 将相同uACR值归一化至每只小鼠的基线值（第0周）。与野生型 littermate 对照组相比，VEGF-A基因敲除小鼠在第10周和第14周时uACR显著升高，而在VEGF-A × Neph-VEGF-A165b小鼠中该升高被抑制（*p &lt;0.05；双因素方差分析，对组间比较进行校正；每时间点n=4–12只小鼠；误差线：均值标准误[SEM]）。本图经Stevens et al5修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="血管通透性比较；超滤系数；用于分析的图表和显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 肾小球水通透性的测量。（A） 通过负压吸引将肾小球捕获在微移液管上；灌流液从1% BSA（Ai）切换至8% BSA（Aii），并观察肾小球的收缩情况。（B） 利用切换8% BSA前后所采集的数据测定肾小球的LpA/Vi值。（C） 与野生型对照组相比，VEGF-A基因敲除小鼠在诱导VEGF-A基因敲除后14周时表现出显著升高的肾小球LpA/Vi值。而在VEGF-A X Neph-VEGF-A165b小鼠中，该变化未被显著抑制（*p &lt;0.05；单因素方差分析，Bonferroni法进行两两比较校正；n = 4 - 9只小鼠，15 - 30个肾小球；误差棒：标准误）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肾脏组织学及VEGF-A对血管结构和功能影响的柱状图比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4. 肾小球结构分析。（A） 肾皮质PAS染色显示，野生型（WT）、VEGF-A基因敲除（KO）以及VEGF-A X Neph-VEGF-A165b小鼠的肾小球均未见明显结构异常（Ai - iii）。电镜（EM）结果显示，VEGF-A KO小鼠肾小球存在超微结构异常（Aiv - vi）。（B） 各组间足细胞足突宽度（FPW）平均值无显著变化。（C） VEGF-A KO小鼠肾小球基底膜（GBM）增厚，而VEGF-A165b可防止该变化。（D） VEGF-A KO小鼠肾小球窗孔数量减少，VEGF-A165b未能逆转此现象。（E） VEGF-A KO小鼠肾小球足细胞足突覆盖面积（SPS）减少，VEGF-A165b亦未能改善。（F） VEGF-A KO小鼠肾小球裂孔平均宽度增加，而VEGF-A165b可防止该增宽。（G） 三组间裂孔数量无显著差异（*p &lt;0.05；单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni校正；n = 3只小鼠，共9个肾小球；误差棒：标准误SEM）。本图经Stevens et al5修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="PCR 电泳和蛋白质印迹分析；VEGFR2 表达量柱状图比较野生型与 VEGF-A 基因敲除型" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5. 标志物的mRNA和蛋白表达。(A) RT-PCR 结果显示人 VEGF-A165b mRNA 表达仅在 VEGF-A 基因敲除 × Neph-VEGF-A 转基因小鼠的滤过肾小球中明显可见165b 小鼠。 （B） Western blotting 结果显示，VEGF-A 基因敲除肾小球中 VEGFR-2 蛋白表达下调，而在 VEGF-A 基因敲除 × Neph-VEGF-A 转基因小鼠中该下调现象被阻止165b 肾小球（*p &lt;0.05；单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni校正；n = 3–6只小鼠；误差线：标准误）。该图已根据Stevens修改 等5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了应在肾小球疾病小鼠模型中进行的完整肾脏检查。这些方法可对肾小球功能进行详细的功能性、结构性和机制性分析，适用于所有肾小球疾病的小鼠模型。

使用小鼠模型模拟人类肾脏疾病正变得越来越普遍。我们的研究重点是评估肾小球功能……

该方法有助于解答肾小球疾病领域中关于肾小球功能与结构表型的关键问题，并可实现对肾脏病理机制的分析。该技术的主要优势在于其可适用于各种肾小球疾病模型。在评估尿白蛋白/肌酐比值时，将一只6至8周龄的雄性小鼠放入代谢笼中，笼内提供水和强化饮食饲料，并置于安静的房间内。六小时后，将小鼠放回常规饲养环境，并从每只笼子中收集至少50 µL的基础尿液样本，之后每周至每月重复一次尿液采集。在实验终点时，从每只动物的腹部取出肾脏，并用预冷的PBS冲洗器官。为观察皮质肾小球，切取肾脏皮质的一极并切成1 mm³的小块。为了观察深层近髓肾小球，切取并切成若干体积为一立方毫米的小块，取自髓质的一小部分组织。然后，将每块组织碎片分别放入含有五毫升2.5%戊二醛溶液的透射电镜样品瓶中，并将样品置于4°C条件下保存。对于皮质及近髓肾小球的组织学检查，取肾脏上三分之一部分，置于五毫升4%多聚甲醛溶液中，在4°C条件下固定24小时。然后，将固定后的组织转移至5 mL 70%乙醇中，放置24小时，再进行石蜡包埋。如需对皮质和髓质肾小球进行免疫荧光化学分析，取三分之一的肾脏组织放入组织模具中，并将组织浸入最佳切割温度（OCT）包埋剂中。随后将模具置于干冰上，直至包埋剂完全冻结，然后将样品于-80°C保存，直至切片。进行蛋白质分析时，将三乘二立方毫米的肾皮质组织块放入0.5毫升塑料管中，并在液氮中快速冷冻，随后于-80摄氏度保存。若需长期保存组织用于RNA分析，在如上所述快速冷冻三乘二立方毫米的肾组织块后，加入五倍体积的RNase稳定溶液，并于-80摄氏度保存。为分离肾小球，将剩余的肾组织切片后，立即将组织块置于含有1%牛血清白蛋白（BSA）的5毫升哺乳动物林格氏液中，冰上保存以备立即过筛。为了分离肾小球，将孔径尺寸递增的筛网依次叠加在玻璃烧杯上，并将肾组织切片置于最上层孔径为425微米的筛网上。接着，使用注射器活塞和添加了1% BSA的冰冷哺乳动物林格氏液，将肾组织研磨通过第一层筛网。当肾组织碎片被推过筛网后，移去最上层筛网，并依次继续将肾组织碎片推过每一层筛网。当仅剩100微米和70微米的筛网时，将最后两个筛网截留的肾小球收获物转移至含有10毫升新鲜哺乳动物林格液的50毫升锥形管中，林格液中添加1% BSA并置于冰上。将肾小球悬液中的3毫升分装至两个1.5毫升微量离心管中，通过离心沉淀肾小球。去除上清液后，将肾小球在液氮中速冻，随后于-80摄氏度保存，用于后续蛋白质和RNA提取。然后，将剩余的肾小球溶液放入37摄氏度水浴中，准备在光学显微镜载物台上进行肾小球水通透性装置的注射。捕获一个完整且独立的肾小球后，用微移液管清除肾小囊及小管碎片，开始记录，并用添加了1% BSA的新鲜任氏液灌注肾小球。30秒后，将灌注液更换为含8% BSA的高浓度任氏液。灌注10秒后，将灌注液换回1% BSA林格液，并停止记录。为清晰观察肾小球细胞及残留基质，将固定的石蜡包埋肾皮质样本在37摄氏度下干燥一小时，随后依次用二甲苯和梯度递减的乙醇浸泡进行脱蜡。将样本在蒸馏水中再水化5分钟，然后将切片置于通风橱内的高碘酸溶液中孵育。五分钟后，用100毫升蒸馏水洗涤载玻片三次，每次五分钟，随后在希夫试剂中孵育15分钟。孵育结束后，将载玻片置于流动的自来水下冲洗5分钟，再用苏木精复染3秒，然后再次在流动的自来水下彻底冲洗15分钟。接着，依次通过梯度乙醇浸泡进行脱水，并用二甲苯连续浸泡两次，每次三分钟。空气干燥后，可使用基于二甲苯的封片介质封片，并在光学显微镜下以400倍放大倍数评估肾小球结构。与野生型同窝对照小鼠相比，血管内皮生长因子（VEGF-A）基因敲除小鼠在10周时即出现进行性白蛋白尿；而VEGF165b过表达的基因敲除动物则对该病症具有保护作用。VEGF-A基因敲除小鼠的肾小球水通透性显著高于野生型对照组，而VEGF-A165b的过表达可部分挽救这一异常。对VEGF-A基因敲除小鼠的肾皮质切片进行高碘酸-希夫染色，经光镜分析未发现任何肾小球结构异常。然而，经电子显微镜分析发现，基因敲除小鼠的肾小球基底膜增厚、内皮细胞窗孔数量减少、足细胞下间隙覆盖面积减小、平均足细胞裂孔宽度增加，而裂孔的平均数量保持不变。在VEGF-A基因敲除动物中过表达VEGF165b可逆转肾小球基底膜和裂孔宽度的上述改变。然而，VEGF165b 的过表达并不影响裂孔数量或足细胞下间隙的覆盖程度。从筛分得到的肾小球中提取的 RNA 证实，在 VEGF165b 过表达的敲除小鼠中存在人源 VEGF165b mRNA 的表达，这与 VEGF-A 敲除小鼠中 VEGFR2 表达降低的现象相一致，而在基因敲入动物中，VEGF165b 的过表达可挽救该降低现象。观看本视频后，您应能够充分掌握如何完成小鼠肾小球疾病模型的全面肾脏评估，包括对肾小球对白蛋白和水通透性的评估。

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