小鼠肾小球疾病模型肾脏功能的评价

本议定书描述了肾小球疾病小鼠模型中应进行的全肾脏工作。这些方法可以对肾小球疾病的所有小鼠模型进行详细的功能、结构和机械分析。

这种方法可以帮助回答肾小球疾病领域关于肾小球功能和结构表型的关键问题，并允许对肾脏病理进行机制分析。该技术的主要优点是它适用于所有评级的肾小球疾病模型。为了评估尿白蛋白肌酐比率，将一只 6 至 8 周龄的雄性小鼠放入装有水和丰富饮食食物的代谢小鼠笼中，在一个安静的房间里。

六小时后，将小鼠放回正常住房，并从每个笼子中收集至少 50 微升的基线尿液样本，从每周一次到每月一次重复尿液收集。在实验终点，从每只动物的腹部收获肾脏，并在冰冷的 PBS 中清洗器官。要检查皮质肾小球，请将肾皮层的一根极取出并切成一立方毫米的小块。

要检查深延髓近肾小球，请将延髓的一小部分取出并切成一立方毫米的小块。然后，将每个组织切片的片段放入含有 5 毫升 2.5% 戊二醛溶液的单个电子显微镜小瓶中，并将样品储存在 4 摄氏度。对于皮质和近髓样肾小球的组织学，在 4 摄氏度下用 5 毫升 4% 多聚甲醛去除并固定肾脏的上三分之一，持续 24 小时。

然后，将固定的组织转移到 5 毫升 70% 乙醇中 24 小时，然后包埋在石蜡中。对于皮质和髓质肾小球的免疫氟化学分析，将三分之一的肾脏放入组织模具中，并将组织浸入最佳切割温度化合物中。然后，将模具放在干冰上，直到化合物冻结，并将样品储存在 80 摄氏度，直到切片。

对于蛋白质分析，将 3 x 2 立方毫米的肾皮层放入 0.5 毫升塑料管中，并在液氮中快速冷冻样品，以便在 80 摄氏度下储存。对于用于 RNA 分析的长期组织储存，如刚才所示，在快速冷冻 3 x 2 立方毫米的肾块后，加入 5 体积的 RNase 稳定溶液以在 80 摄氏度下储存。对于肾小球分离，将剩余的肾组织切片，并将组织块放入 5 毫升补充有 1% 牛血清白蛋白或 BSA 的哺乳动物林格溶液中，在冰上立即筛分。

为了分离肾小球，将孔径递增的筛子堆放在玻璃烧杯上，然后将肾片放在顶部 425 微米孔径的筛子上。接下来，使用注射器柱塞和新鲜的冰冷哺乳动物林格溶液，补充有 1% BSA，通过第一个筛子将肾组织捣碎。当肾脏碎片被推过时，取下顶部筛子并继续依次将肾脏碎片推过每个筛子。

当只剩下 100 和 70 微米的筛子时，将最后两个筛子保留的肾小球收获物转移到 50 毫升锥形管中，加入 10 毫升新鲜哺乳动物林格溶液，并在冰上补充 1% BSA。将 3 毫升肾小球悬浮液分装在两个 1.5 毫升微量离心管之间，并通过离心使肾小球沉淀。去除上清液后，将肾小球在液氮中快速冷冻 80 摄氏度储存，以便以后提取蛋白质和 RNA。

然后，将剩余的肾小球溶液放入 37 摄氏度的水浴中，注射到光学显微镜载物台上的肾小球透水装置中。捕获完整的单个肾小球后，用微量移液管释放 Bowman 胶囊和肾小管碎片，开始记录，并用补充有 1% BSA 的新鲜林格氏液灌注肾小球。30 秒后，将灌注液换成浓缩的 8% BSA 林格溶液。

灌注 10 秒后，将灌注液切换回 1% BSA 林格溶液并停止记录。为了详细观察肾小球细胞和残留基质，将固定的、石蜡包埋的肾皮层样品在 37 摄氏度下干燥 1 小时，然后用连续二甲苯脱蜡和下行乙醇浸泡。将样品在蒸馏水中再水化 5 分钟，然后将玻片在通风柜中的高碘酸溶液中孵育。

5 分钟后，在 100 毫升蒸馏水中洗涤 3 次 5 分钟，然后用 Schiff 试剂孵育 15 分钟。孵育结束时，用流动的自来水清洗玻片 5 分钟，用苏木精复染 3 秒钟，然后用流动的自来水中彻底冲洗 15 分钟。然后，通过上升乙醇浸泡和两次连续 3 分钟的二甲苯浸泡使载玻片脱水。

风干后，载玻片可以用基于二甲苯的封固剂封片，以便在光学显微镜上以 400 倍放大倍率评估其肾小球结构。与野生型窝配对对照相比，血管内皮生长因子 （VEGF-A） 敲除小鼠在 10 周时出现进行性白蛋白尿，而过表达 VEGF165b 敲除的动物则免受这种情况的影响。与野生型对照相比，VEGF-A 敲除小鼠的肾小球透水性显著增加，这部分被 VEGF-A165b 过表达挽救。

VEGF-A 敲除小鼠肾皮层切片的高碘酸希夫染色通过光学显微镜分析未显示任何肾小球结构异常。然而，在电子显微镜分析中，敲除小鼠表现出肾小球基底膜宽度增加，内皮孔数量减少，亚足细胞空间覆盖率降低，平均足细胞裂缝宽度增加，而平均裂隙数量保持不变。VEGF-A 敲除动物中的 VEGF165b 过表达可挽救肾小球基底膜和狭缝宽度的变化。

然而，VEGF165b 过表达不会影响改变的 fenestrae 数量或亚足细胞空间覆盖。从筛分的肾小球中提取的 RNA 证实，人 VEGF165b mRNA 在过表达敲除小鼠中的 VEGF165b mRNA 表达，这与 VEGF-A 敲除小鼠中 VEGFR2 表达降低相关，而 VEGF165b 在动物敲除小鼠中过表达则挽救了这一表达。观看此视频后，您应该对如何完成完整的肾脏检查以评估肾小球疾病的小鼠模型有很好的了解，包括评估肾小球对白蛋白和水的通透性。