调控γ-氨基丁酸A型受体神经传递的新型化合物发现方法

本视频的总体目标是展示一种筛选级联方法，用于发现新型 GABA-A 受体配体。通过迭代方式结合使用放射性配体结合实验、非洲爪蟾卵母细胞的电生理记录以及啮齿类动物脑片电生理记录，其优势在于能够不断优化化合物的特性。最终可鉴定出高效、亚型选择性强且具有活性的化合物。

本演示将由 HiQScreen 的 Kumico Kambara、Jenna Tognaccini、Sonia 和 Daniel Bertrand 以及罗氏的 Marie Claire Pflimlin 完成。使用安装在配有压力喷射系统或自动注射系统的显微操作器上的玻璃微量注射针，注入 10 至 50 纳升含有质粒的溶液，注射针尖端直径不超过 100 微米。开始该操作时，将卵母细胞保持在 17 摄氏度，以防止热休克蛋白的表达。

将微孔板存放在温度可控的储存区域。然后，将OR2结合实验中检测呈阳性的测试化合物分别溶解于0.1和1000微摩尔浓度，用于电生理记录，并将其加入96孔平底聚丙烯板中。为进行双电极电压钳记录，将含有卵母细胞的板放置于自动系统上。

使用基于图标的界面按照此方案对自动记录系统进行编程，以适当确定浓度-活性关系。进行曲线拟合时，参考所示的浓度-激活曲线，将电流幅度作为激动剂浓度对数值的函数进行绘图。进行电生理记录时，将脑组织置于室温下用碳氧混合气饱和的dACSF溶液中。

然后，用精细的解剖刀分离左侧海马结构。随后，使用组织切片机从海马的中段切取厚度为400 µm的横切片。用毛笔将切片转移至记录室，并在室温下维持45分钟。

随后，用以碳合气饱和、温度为35摄氏度、流速为每分钟1.5毫升的回收型人工脑脊液（rACSF）灌注脑片。为记录单个群体峰电位，将脑片置于显微镜载物台上的记录室中，并以每分钟3毫升流速的回收型人工脑脊液（rACSF）进行灌注。

使用拉针仪将一根硼硅酸盐玻璃微电极拉制成电阻约为两兆欧姆的尖端。用含有两摩尔氯化钠的溶液填充该微电极，并将其装入电极 holder 中。使用右侧的显微操作器，将记录用微电极置于海马脑片 CA1 区的锥体细胞层（stratum pyramidale）中。

随后，将绝缘的双极铂铱电极插入左侧显微操作器的电极 holder 中。使用左侧显微操作器，将刺激电极置于海马脑片 CA1 区的 Schaffer 侧支处。利用刺激发生器，每 30 秒向刺激电极输送一次电流脉冲，并逐步增加刺激强度，直至出现群体峰电位。

调节刺激强度，以诱发相当于最大可获得幅度45%的群体峰电位。为进行成对脉冲抑制实验，使用刺激发生器每隔30秒向刺激电极输送两个电流脉冲。将刺激强度设定为诱发相当于最大幅度45%的群体峰电位。

为了测试化合物，将待测化合物用人工脑脊液（ACSF）进行稀释，使DMSO的终浓度不超过0.1%。在对照溶液中加入与化合物溶液相同浓度的DMSO。每隔30秒记录一次由Schaffer侧支刺激诱发的单个或成对脉冲群体峰电位，持续至少30分钟。在此基线期，群体峰电位的波形应保持稳定。

接下来，准备一个烧杯，其中装有含固定浓度待测化合物的碳合人工脑脊液（rACSF），并在记录单脉冲或双脉冲群体峰电位期间，将该溶液灌流至海马脑片。此外，通过使用不含该化合物的碳合rACSF灌流脑片，评估化合物作用后的恢复情况。图中所示为大鼠海马脑片的示意图，以及起源于CA3锥体细胞轴突的Schaffer侧支投射至CA1锥体神经元树突分支的结构。

将微电极置于锥体细胞层以记录群体峰电位，并置于辐射层以记录树突的场兴奋性突触后电位。刺激电极放置于Schaffer侧支内。该图显示了通过同一刺激电极以20毫秒间隔施加成对刺激所诱发的群体峰电位。

群体反应对第二个刺激的反应幅度小于对第一个刺激的反应幅度。在不存在和存在β-CCM（一种非选择性GABA A受体负向变构调节剂）的情况下记录了群体峰电位。β-CCM通过部分阻断任何前馈性GABA能抑制，增强了第二个群体峰电位的幅度。

通过该实验步骤，还可进一步开展药代动力学、受体占有率及体内功效以及安全性药理学等其他方法，以回答有关所鉴定化合物临床开发潜力的其他问题。