多能干细胞半自动化生产肝样细胞的研究

该方法使用半自动化平台以 96 孔形式生产高度可重复的肝细胞样细胞。该技术的主要优点是快速、经济高效、变异少，并允许大规模生产 96 孔板的肝细胞样细胞。制备每毫升 5 微克解冻的层粘连蛋白 521 溶液，方法是将其稀释在冰冷的一次 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水或 DPBS 中与钙镁。

使用带有标准试管分液盒的自动液体处理分配器，在 96 孔板的每孔中加入 50 μL 层粘连蛋白 521 溶液。孵育层粘连蛋白 521 包被板。孵育后，使用八通道吸液适配器将层粘连蛋白 521 溶液从包被表面吸出，并避免与包被表面接触。

立即在每孔中加入 50 微升 mTeSR1 培养基，并补充 10 微摩尔的 Rho 相关激酶或 ROCK 抑制剂 Y27632。将板保存在培养箱中，直到细胞在 37 摄氏度和 5% CO 2 下接种。在补充有 10 微摩尔 ROCK 抑制剂 Y27632 的 mTeSR1 培养基中，从每毫升 3 倍 10 的细胞悬液到每 mL 的第 5 个细胞。

将 50 微升细胞悬液添加到板上。接种后，将板放回 37 摄氏度、5%CO2 的细胞培养箱中 24 小时，让细胞附着。从培养箱中取出板后，第二天检查板，检查细胞间接触是否已建立且汇合度达到 40%然后切换到分化培养基。

细胞汇合吸引分化的开始。获得高质量肝细胞样细胞是关键。分化开始，一旦汇合度达到 40%如果汇合度较高，则板不适合分化。

接种后 24 小时，使用自动手持式电动通道移液器小心去除培养基。并加入 100 微升新鲜内胚层引物培养基，补充有 100 纳克/毫升激活素 A 和 50 纳克/毫升 Wnt3a。确定性内胚层诱导后，改用 KSR DMSO 培养基进行肝母细胞规格。

并每两天更换一次培养基，持续五天。肝母细胞分化后，去除 KSR DMSO 培养基，用不含补充剂的 HepatoZYME 培养基洗涤细胞一次。洗涤后，加入 100 微升 HepatoZYME 成熟培养基，补充有 10 ng/mL 肝细胞生长因子和 20 ng/mL 抑瘤素 M.每 48 小时更换一次培养基，持续 7 到 10 天。

在分化的第 18 天，固定细胞并使用液体处理和自动洗板机进行免疫细胞化学。将板存放在 4 摄氏度的黑暗中直至成像。随后进行成像和定量。

第 18 天，DAPI 染色后检查孔间的变异性和细胞数。在每孔捕获 7 个视野并量化细胞核数量后，未发现统计学差异。第 18 天人肝细胞样细胞或 HLC 染色显示肝细胞标志物 HNF4 α、白蛋白和 AFP 的表达。

HLCs 还表达 CYP P450 蛋白，CYP2D6 和 CYP3A4 显示 CYP P450 代谢活性。HLC 还显示出明显的多边形外观，由 E-钙粘蛋白显示。尽管该方案是标准化的，但分化前的细胞汇合对于 HRC 分化至关重要。

我们看到细胞独立性。因此，每个细胞系都需要销售播种和密度优化。一旦掌握，该方法就可以快速生成多个人肝细胞板，用于疾病建模、药物筛选或药物建议研究。

该系统允许生成用于肝细胞生物学机理分析的多参数数据集。