果蝇幼虫和成年脑的代谢分析

这种方法可以帮助回答有关果蝇脑代谢以及神经胶质细胞过度增殖如何影响代谢重编程的关键问题，即饮食或行为是否会改变新陈代谢。该技术的主要优点是，可以将果蝇大脑作为一个完整的组织进行代谢分析，一次只测量一个大脑即可获得可重复的结果。虽然这种方法可以深入了解果蝇大脑的新陈代谢，但它也可以分别应用于其他组织和模型系统，例如假想盘和秀丽隐杆

为了准备微组织约束，从储存容器中为每个正在测量的大脑选择一个微组织约束，加上至少三个用作仅约束的控制。使用网篮和六孔板，用 70% 的乙醇冲洗约束装置，然后用去离子水洗涤 3 次，每次 2 分钟。如果约束装置仍然散发出酒精气味，请进行额外的水洗。

在检测培养基中清洗微组织约束装置，并将其留在溶液中，直到它们准备好使用。要解剖黑腹果蝇幼虫的大脑，请从一小瓶培养的器官 R 蝇中选择晚期三龄幼虫。将幼虫放入含有 500 微升 1x PBS 的干净解剖点板的孔中。

接下来，通过在孔中轻轻摇动幼虫来清洗幼虫，然后将其转移到另一个干净的孔中。然后，将点板放在解剖显微镜下。用一把镊子抓住幼虫的腹部，同时用第二对镊子抓住眼钩。

使用两组镊子轻轻而平稳地将幼虫向相反的方向拉动。想象大脑通常附着在眼钩上，并且通常附有眼触角盘。使用眼钩将大脑固定到位，小心地去除其他组织。

最后，将眼钩与大脑分开。然后，使用镊子将解剖的大脑转移到含有 1x PBS 的新孔中。要将解剖的大脑添加到 96 孔代谢测定板中，首先向所有孔中加入 50 微升测定培养基，包括实验孔、对照孔、仅约束孔和背景孔。

然后，小心地在每个孔中放置一个大脑。在解剖显微镜下，使用弯针微探针将大脑压到孔底部。使用探针轻轻地将大脑定位在三个凸起的球体的中间。

要在 96 孔代谢测定板中添加微组织约束，首先将其放在边缘。在显微镜下，将其定向为塑料环朝下，网眼朝上。接下来，从显微镜中取出板。

用镊子抓住两侧的约束装置，轻轻地将其放入井中。使用弯曲的针状微探针将约束装置向下压入孔中。微组织约束装置必须正确放置在每个孔的中心大脑上，以便该技术提供有意义的结果。

在显微镜下，验证是否可以通过组织约束看到解剖的大脑，并且它位于孔的中心，然后对将用于测定的所有孔重复该过程。小心地将 130 μL 的检测培养基添加到每个实验孔、对照孔和仅限制孔中。确认在添加介质时大脑和微组织约束装置没有移动。

然后，将 180 微升检测培养基添加到四个角孔中，用作背景对照。在此过程中，取下工具板，并将没有盖子的细胞板以相同方向添加到代谢分析仪中。选择 Load Cell Plate"让仪器接收细胞板并关闭托盘，然后开始检测。

检测完成后，取出弹出的细胞板和卡盒。使用解剖显微镜，验证检测完成后大脑和微组织约束装置是否仍正确放置在孔中，并从分析中排除任何异常的孔。当遵循优化条件时，幼虫和成虫大脑的检测导致 OCR 读数在稳定的第六个时间点（检测开始约 25 分钟）略高于每分钟 150 皮摩尔。

此速率至少保持 30 分钟，最多保持 2 小时。在第六个时间点，成虫大脑的 ECAR 略低于幼虫大脑，并且维持至少 30 分钟。这一发现对应于幼虫阶段糖酵解的增加以支持生长。

注射线粒体抑制剂（如寡霉素）可降低 OCR 读数以揭示 ATP 依赖性呼吸，而进一步用鱼藤酮和抗霉素 A 治疗可降低 OCR 以揭示非线粒体耗氧量。在尝试此程序时，重要的是要记住将大脑居中并确保在运行分析之前和分析期间将微组织约束装置固定到位。在此程序之后，可以执行其他方法，如定量 PCR 和 western blot 分析，以回答有关基因表达如何促进观察到的代谢表型的其他问题。