烟草 Benthamiana叶在制备鳞片上的瞬态表达

烟草 benthamiana叶片中生物合成酶的瞬态异源表达可以将 23-oxidosqualene 的内源供给转移到新的高附加值三萜产品的生产中。这里描述了一个详细的协议, 快速 (5 天) 准备规模生产萜和类似物利用这个强大的植物基础平台。

该方案为用于下游研究的三萜化合物提供了方便的制备规模访问，例如结构表征或医学相关生物活性的到期。该方案快速、可扩展，并且允许通过不同农杆菌菌株的共渗透来利用酶的组合，无需构建大型多基因载体。首先，用来自甘油原液培养物的所需根癌农杆菌菌株的条纹接种选择性 LB 琼脂平板。

将板在 28 摄氏度下在立式培养箱中孵育过夜。第二天，用每种根癌农杆菌菌株的样品单独接种 50 毫升选择性 LB 培养基。将培养物在 28 摄氏度下在摇动培养箱中以 200 rpm 孵育过夜。

将 50 毫升培养物单独转移到 1， 000 毫升选择性 LB 培养基中，并在 28 摄氏度下以 200 rpm 的转速在振荡培养箱中孵育过夜。第二天，通过以 4， 000 次 g 离心，从液体培养物中单独沉淀根癌农杆菌。弃去上清液后，将沉淀单独重悬于 50 毫升新鲜制备的 MMA 缓冲液中。

将重悬的沉淀物在室温下避光孵育 1 小时。现在，确定每种根癌农杆菌 MMA 悬浮液的适当体积，以在 10 升总最终体积中产生至少 0.2 的最终 OD 600。合并每个悬浮液的确定体积。

现在，向组合悬浮液中添加额外的 MMA 缓冲液，最终体积为 1 升，可立即用于真空渗透。将 1 升浸润悬浮液和 1 升 10 倍强度的 MMA 缓冲液转移到浸润浴中，然后再加入 8 升水。取下定制植物架的可拆卸翅膀。

插入四株已按照文本方案中所述生长的五周龄植物，然后重新连接翅膀。如果叶子没有完全浸没在渗透悬浮液中，则渗透覆盖率会受到影响。通过在真空处理之前确保悬浮液的水平到达植物支架的顶面，可以最大限度地减少这个问题。

倒置支架，将其放在渗透浴的顶部，以便将叶子浸入渗透悬浮液中。将装有浸没植物的浸润浴转移到浸润室，然后关上门。确保渗透器上的进气阀已关闭。

打开真空泵后，打开渗透室上的真空进气阀。一旦渗透室中的压力降低 880 毫巴，关闭真空进气阀，然后打开进气阀。恢复到大气压后，打开门，取出渗透槽。

现在，抬起植物支架，直到植物不再浸没在渗透悬浮液中。然后，轻轻摇晃支架，让多余的悬浮液从叶子上流回渗透浴中。最后，将支架放回直立位置，取下可拆卸的翅膀，然后取出植物。

将浸润的植物在 25 摄氏度下种植 5 天，每天光照 16 小时，每天浇水。生长五天后，收获叶子，然后按照文本协议中的说明干燥它们。通过一种方便的方法将干叶研磨成粗粉末，例如使用家用食品加工机或手动压碎装在袋子里的叶子。

将叶粉与石英砂混合在一个合适的容器中。它起到分散剂的作用，提高了萃取过程的效率。现在，首先倒置四个提取单元进行填充。

然后，插入玻璃纤维过滤器，然后插入金属筛板和固定塞。将提取单元放回直立位置，并添加一层一厘米深的石英砂。用准备好的叶粉填充提取单元直至填充线。

如果需要，在此过程中轻轻压缩粉末，以便于在每个提取单元中添加更多的粉末。现在，在填充粉末的顶部添加一小层石英砂，然后插入顶部的纤维素过滤器。将填充的提取池插入加压溶剂萃取仪中，然后运行所需的方法。

方法完成后，通过在真空下旋转蒸发将组合的提取液浓缩至干，如文本方案中所述。检查深绿色浆料的预期输出。为了去除叶绿素，使用碱性离子交换树脂，首先将粗提取物溶解在最小体积的乙醇中。

向所得溶液中加入 50 mL 碱性离子交换树脂珠。然后，在室温下搅拌 30 分钟。每 30 分钟额外加入 50 mL 碱性离子交换树脂珠，直至反应完成。

起初，碱性离子交换树脂珠为粉红色，液相为绿色。随着反应的进行，树脂珠变为绿色，液相变为橙色或暗棕色，具体取决于规模。通过玻璃快速色谱柱通过一小柱硅藻土过滤反应混合物，使用手动波纹管施加压力。

用乙醇冲洗收集的树脂珠，然后用乙醇与己烷进行一对一的冲洗，最后用己烷进行冲洗。使用足够的冲洗体积将珠子重悬于硅藻土柱的顶部。最后，在真空下通过旋转蒸发将滤液、冲洗液和浓缩液混合至干燥。

这里显示的是浸润生长后 5 天后用荧光蛋白 GFP 的表达构建体浸润的一种植物的叶子的图像。这说明了可以预期的渗透覆盖范围。叶子从图像的左上角到右下角按降序排列，相对于它们在植物上的原始高度。

该图像表示使用此方案产生的 0.8 克 β-胰淀素，纯度大于 98%。该实验是在 459 株植物的规模上进行的，代表每克干叶材料 3.3 毫克的分离产量。在尝试此方案时，重要的是要记住，只有浸润的叶子才会产生您感兴趣的化合物。

因此，在可能的情况下选择性地收获这些叶子是有利的，以防止样品被非生产性组织稀释。本协议中的收获后步骤仅用于说明目的。它们可以替代其他天然产物提取纯化技术，具体取决于您所在机构的专业知识和/或设施的可用性。

我们发现，该方案中提出的基本离子交换树脂处理是更传统的皂化化，然后进行液/液分配以更大规模地去除叶绿素的便捷替代方案。在遵循此协议之前，您应该熟悉所有所用物质的材料安全数据，并采取适当的安全预防措施。应检查和遵守有关使用转基因材料的当地立法，包括遵循适当的遏制程序。